松材线虫Bx-sHSP16A基因克隆及蛋白质结构研究

分子伴侣小热激蛋白(sHSPs)是线虫度过高温环境的关键因子。为开发直接针对松材线虫的防治技术提供理论依据,对松材线虫小热激蛋白Bx-sHSP16A基因进行了研究。采用SL法进行基因全长克隆,STRING 9.0进行蛋白质互作网络分析,NAMD 2.9进行分子动力学模拟。本研究克隆到松材线虫小热激蛋白基因Bx-sHSP16A。Bx-sHSP16A具α-crystallin保守结构域“F-polar-R-polar-aromatic-x-L-P”序列和“I/L-x-I”序列,初步判断具备分子伴侣功能。Bx-sHSP16A与多个蛋白发生互作,深入研究这些蛋白有助于了解Bx-sHSP16A在应激反应路径中的作用。Bx-sHSP16A二聚体中A亚基的“I/L-x-I”序列可以嵌入B亚基的去水合位点,契合后氢键稳定,说明Bx-sHSP16A可以形成多聚体。在应激反应过程中,去水合位点与多聚体聚合相关,Bx-sHSP16A以多聚体形式发挥分子伴侣功能。     

基于转录组的水稻干尖线虫锌指蛋白基因克隆及功能分析

为了寻找线虫生殖相关基因,为开发线虫生殖抑制药剂提供理论基础,通过分析水稻干尖线虫转录组文库高通量测序数据,对Unigene进行KEGG路径分析,筛选出一个孕酮介导的卵母细胞形成代谢路径(progesterone-mediated oocyte maturation),并筛选出该路径的主要调控基因——锌指蛋白基因。通过同源序列比对发现水稻干尖线虫锌指蛋白氨基酸序列中含有核酸结合保守结构域NLS,进一步通过三维结构分析及分子对接验证该蛋白可与DNA分子结合。结果表明,水稻干尖线虫锌指蛋白可与其调控基因的启动子结合从而完成对孕酮介导的卵母细胞形成代谢路径的调控。通过本研究得出最终结论,水稻干尖线虫锌指蛋白具有生物防治价值,值得深入研究。     

牦牛SRY基因克隆与分子特征

SRY(Sex-determining region on the Y chromosome,SRY)基因位于哺乳动物的Y染色体,对性别形成起着决定性作用.对高原牦牛SRY基因的编码区进行克隆和分子特征分析,以期从分子水平了解牦牛的性别形成机制.以雄性高原牦牛血液为材料,从基因组DNA中扩增SRY基因编码区(单外显子)序列,将其克隆至pGEM-T easy载体并测序.同时,将牦牛SRY基因编码区与奶牛进行序列比对;对牦牛SRY蛋白与其他物种SRY蛋白进行序列比对;采用在线生物软件对牦牛SRY蛋白的特性和结构进行预测.牦牛SRY基因(GenBank:EU547257)编码区长687 bp,编码229个氨基酸.克隆获得的牦牛SRY基因编码区与奶牛该序列存在2个碱基的变异,造成1个氨基酸的变异;各物种SRY蛋白具有较高的同源性;牦牛SRY蛋白(GenBank:ACB 29799)主要由亲水性氨基酸构成,同源建模预测的SRY HMG区域的3D模型显示,SRY HMG区域三维结构呈由三个α-螺旋组成的"L"型.首次从高原牦牛基因组中克隆了SRY基因,并进一步揭示了其分子特征,为从分子水平人为的控制牦牛性别奠定了重要基础.     

毛白杨PtoMnSOD基因克隆及生物信息学分析

为了揭示毛白杨锰超氧化物歧化酶基因PtoMnSOD在植物抗逆中的功能。本研究通过RT-PCR方法获取毛白杨PtoMnSOD基因序列,并对该基因及其编码蛋白进行生物信息学分析。结果显示:PtoMnSOD基因开放阅读框(ORF)为699 bp,编码232个氨基酸,具有PF00081和PF02777两个保守结构域,属于MnSOD亚家族。其编码的蛋白含有20个磷酸化位点,是无跨膜结构、无信号肽且定位于线粒体的不稳定亲水性蛋白。同源序列比对显示,不同物种的MnSOD氨基酸序列具有很强的保守性。研究结果为进一步开展毛白杨锰超氧化物歧化酶基因PtoMnSOD的功能研究奠定了理论基础。     

拟南芥转录因子CBF2的克隆与生物信息学分析

本研究旨在克隆转录因子CBF2并对其进行生物信息学分析得到该基因相关信息。试验以拟南芥基因组DNA为模板,根据GenBank中拟南芥转录因子CBF2(FJ491243.1)已知序列设计引物,回收扩增的目的片段与T-easy载体连接后转入大肠杆菌(E.coli DH5α),经蓝白斑筛选后提取重组体的质粒,经滞后筛选、PCR、酶切鉴定无误后进行测序。经生物信息学分析,该基因全长651 bp,其中编码区长648 bp,编码216个氨基酸,其蛋白的分子式为C₁₀₅₆H₁₆₂₃N₂₉₃O₃₃₃S₁₆,相对分子质量为24.26 kDa,等电点为5.00,该蛋白为亲水性非分泌型蛋白,无信号肽存在;其蛋白质二级结构以α-螺旋、β-折叠和无规卷曲为主。肽链可能含有9处丝氨酸磷酸化位点,6处苏氨酸磷酸化位点,以及2处酪氨酸磷酸化位点。本研究通过对CBF2基因的生物信息学分析,获得了该基因的相关信息,并与已有研究结果进行比对分析,推测该基因在植物抗逆过程中有重要的作用。     

东北白桦(Betula platyphylla Suk.)LEA基因的克隆及盐胁迫响应基因的鉴定

LEA蛋白(late embryogenesis abundant proteins)是一类胚胎发育晚期种子中大量富集的蛋白,在植物抗逆过程中起重要作用。目前,白桦的全基因组测序工作已经完成,在此基础上,本研究根据已报导的拟南芥抗逆相关LEA基因,从白桦全基因组序列中鉴定出13个与这些抗逆LEA基因同源的白桦LEA基因。并进一步利用qRT-PCR方法研究这些LEA基因对盐胁迫的表达响应,从而鉴定出在白桦响应盐胁迫过程中起作用的LEA基因,这些盐胁迫响应的LEA基因将为白桦的抗性育种及抗逆分子生物学研究提供帮助。     

Aspergillus niger 乳糖酶基因的克隆及序列分析

利用PCR及RT-PCR技术从黑曲霉(Aspergillus niger)菌株DL116中克隆到了乳糖酶基因组DNA，cDNA序列(GENBANK ACCESSION No.EF103141)。序列分析表明，乳糖酶基因组DNA序列长3368bp，其中含有8个内含子，cDNA编码区长2967bp，共编码988个氨基酸，氨基酸序列中共含有12个潜在的糖基化位点。并将此基因与不同来源的乳糖酶基因进行了同源性比较     

木薯低温诱导基因MeLTI6A的克隆与序列分析

为了研究木薯(Manihot esculenta Crantz)的抗逆境胁迫机制,从水稻低温诱导及抗旱基因OsLTI6A出发,同源克隆了木薯的抗逆基因MeLIT6A,并对其序列和功能进行了分析研究。MeLIT6A的基因组序列全长为273 bp,其中ORF长度为173 bp,内含子长度为99 bp;编码1个含有57个氨基酸残基的蛋白,含有1个与Pmp3超级家族同源性极高的保守区域。该基因推导蛋白MELTI6A与蓖麻的、拟南芥的、水稻的、玉米的低温诱导蛋白基因6A (LTI6A)的推导蛋白的同源性分别为：89.7%。81.0%、74.1%和87.9%。蛋白功能分类预测MELTI6A是1个非酶类的、疏水性较高的、有2个透膜区域的蛋白,可能有转运蛋白和作为受体蛋白的功能,与拟南芥的AtLTI6A的功能相似。     

富士苹果SDRs家族基因MdSDR的克隆及序列分析

本研究以富士苹果(Malus domestica cv. Fuji)为材料,提取总RNA并反转获得的cDNA为模板,利用PCR技术获得苹果短链脱氢酶/还原酶家族基因MdSDR序列,并结合生物信息学方法对MdSDR蛋白序列进行分析。结果显示,苹果MdSDR序列全长804 bp,编码267个氨基酸,分子质量约27.83 kD,等电点为7.69,是一种稳定的疏水蛋白。比对分析发现其编码蛋白氨基酸序列与已选序列中的碧桃、樱花相似性最高,分别达77.78%和77.69%,进化分析结果也表明MdSDR蛋白与碧桃和樱花亲缘关系较近。亚细胞定位结果显示该蛋白主要位于细胞质中。多序列比对分析显示该蛋白含有SDR家族特有的两个保守结构域:GxxxGxG与YxxxK。二级结构中β片层、α螺旋、无规则卷曲结构分别占比12.73%、39.70%、47.57%,并含有典型的βαβ单元。三级结构预测结果表明该蛋白具有典型的Rossman折叠结构域。本研究结果为了解苹果中SDRs蛋白的功能、探讨其在苹果抗逆中的作用、培育苹果抗逆种质资源提供了思路。     

转Harpin_(Xooc)蛋白编码基因hrf2大豆的胞囊线虫病1号小种抗性鉴定

Harpin蛋白能激活植物的多种防卫通路,从而使植物产生对逆境的广谱抗性。hrf2编码Harpin_(Xooc)蛋白,具有与Harpin蛋白类似的功能。对转hrf2基因的大豆进行抗胞囊线虫病鉴定,结果表明:转hrf2基因大豆的2个株系的单株胞囊线虫数均极显著低于受体植株天隆一号,说明hrf2能够提高大豆对胞囊线虫病1号小种的抗性。     

松墨天牛Homothorax基因的鉴定及表达分析

为了探讨Meis家族中Homothorax基因在昆虫中的表达特性,以松墨天牛为研究对象,从cDNA文库中筛选到松墨天牛Homothorax基因,命名为MaHth(GenBank:KX364396)。该序列长为1347bp,编码448个氨基酸。由此预测的蛋白质二级结构主要由α螺旋与无规则卷曲组成,其次是β转角与延伸链;SWISS-MODEL同源建模预测其三级结构的基元为α螺旋-β转角-α螺旋。MaHth基因编码蛋白,定位于细胞核,并存在2个独立的核定位信号:KRDK、KKNQKKR。通过DNAMAN软件比对发现MaHth与赤拟谷盗同源性最高,为97%,且存在Hox保守结构域序列;用MEGA4.0构建系统发育树,显示松墨天牛与赤拟谷盗处在同一分支。通过RT-qPCR分析表明:卵、蛹中的表达量比幼虫、成虫中的高,在成虫中最低;幼虫头部中MaHth表达量最高,马氏管中表达量较低;成虫头部、马氏管中MaHth表达量最高,足、翅、触角中表达量较低。     

灭多威胁迫下罗非鱼精巢转录组变化及信号通路分析

应用高通量测序技术(RNA-seq),获得显著差异表达基因369条,160条基因显著下调,209条基因显著上调。其中显著差异表达基因在ECM与受体相互作用信号通路和MAPK信号通路中富集明显。分析发现,灭多威对精巢组织细胞粘附性造成影响,诱导ECM与受体相互作用中相关基因表达显著上调,如层粘连蛋白Laminins、整合素ɑ6、β1等,以稳定精巢组织结构；JNK途径中MAP3K、MKK4、JNK显著表达上调,增强录因子AP-1,促进 P53、Bax等促凋亡蛋白的表达；MAPK信号通路ERK途径中相关生长因子表达受到影响,从而可能对罗非鱼精巢组织生殖细胞增殖产生影响。     

饲料可消化蛋白和脂肪水平对吉富罗非鱼幼鱼生长性能、能量物质代谢和抗氧化功能的影响

本试验旨在研究饲料中不同可消化蛋白(DCP)和脂肪(DL)水平对吉富罗非鱼(GIFT, Oreochromis niloticus)幼鱼生长性能、能量物质代谢和抗氧化功能的影响,以确定罗非鱼幼鱼饲料适宜氮能比。初始均重为2 g幼鱼,投喂不同DCP(22%、24%、26%、28%)和DL水平(3%、5%、7%)配制而成的12种不同氮能比试验饲料10周。试验表明：提高饲料DCP和DL水平,显著提高鱼体体增重和特定生长率,5%DL组与7%DL组无显著差异,但蛋白质沉积率呈逐渐下降趋势,DCP26DL5组体增重和特定生长率与最高组DCP26DL7无显著差异;DCP26DL5组胃蛋白酶活性显著高于DCP28DL3组;DCP26DL5组血液AST活性最低,且DCP26DL5组TC和LDL-C含量显著低于DCP22DL7组,血糖水平无显著变化;鱼体抗氧化功能显著提高,DCP26DL5组肝脏SOD活性显著高于DCP22DL3组。研究结果表明,饲料DCP水平过高会降低蛋白质效率,DL水平过高生长性能出现平台期,建议吉富罗非鱼幼鱼饲料适宜DCP水平为26%,DL水平为5%,即氮能比为19.18 mg/KJ。     

甘草生长素反应因子(ARF)基因家族的鉴定及表达分析

本研究旨在鉴定甘草ARF基因家族并分析其在非生物胁迫下的表达模式。以乌拉尔甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)为研究对象,利用生物信息学方法对ARF基因家族进行鉴定,并对其蛋白质理化性质、保守结构域、基因结构、进化关系、顺式作用元件和表达模式分析。鉴定得到10个甘草ARF基因。其蛋白氨基酸序列长度在301~945 aa之间,分子量约为33.07~104.37kDa,等电点为5.93~8.50。亚细胞定位分析显示甘草ARF蛋白均位于细胞核。保守结构域分析显示GuARF蛋白大多包含B3、Auxin_resp和Aux/IAA结构域。基因结构发现外显子数量从6个到22个不等。在甘草ARF基因启动子区还存在5类不同的顺式调控元件。系统进化分析表明甘草ARF蛋白分为3类。转录组数据分析显示,10个GuARF基因在非生物胁迫下具有一定表达特异性。上述结果显示甘草ARF基因家族可能参与多种生物过程,这为进一步研究植物对非生物胁迫的生理和分子反应提供了有价值的信息。     

甘蔗Rieske Fe/S蛋白前体基因ScPetC的克隆及表达分析

细胞色素b6f复合体还原型铁硫蛋白前体(Cytochrome b6f complex Rieske Fe/S precursor protein, PetC)是由细胞核PetC基因编码的蛋白,其成熟蛋白参与构成细胞色素b6f复合体,是电子传递的重要元件。基于前期构建的受高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus, SrMV)侵染的甘蔗转录组数据库,从主栽甘蔗品种‘新台糖22号’叶片中成功克隆到该基因,并命名为ScPetC (GenBank登录号为MH333037.1)。生物信息学分析发现, ScPetC基因cDNA全长824bp,包含了一个678bp的开放阅读框,编码226个氨基酸。ScPetC属于PRK13473超家族,其C末端具有典型的Rieske保守结构域;蛋白理论等电点为8.19,属于稳定的、亲水性蛋白;二级结构多为无规则卷曲,三级结构预测其比其他植物PetC多出一段α螺旋结构。在本氏烟(Nicotiana benthamiana)叶片瞬时表达中, ScPetC定位于叶绿体、细胞质和细胞膜。尽管前人研究表明, ScPetC的表达量会受SrMV侵染的影响,不同于半夏(Pinellia ternata) PetC与大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus, SMV) P1蛋白之间的互作, ScPetC不能与SrMV-P1蛋白互作,但能与甘蔗黄叶病毒(Sugarcane yellow leaf virus, SCYLV) P0蛋白互作。实时荧光定量PCR分析表明, ScPetC基因在甘蔗不同组织中均有表达,但在叶片中的表达量最高。甘蔗受脱落酸胁迫3 h时, ScPetC表达量显著上调,但是随着处理时间的延长,表达受到抑制;在茉莉酸甲酯、水杨酸、氯化铜、氯化镉和氯化钠胁迫下,ScPetC表达量均显著下调。本研究通过对ScPetC生物学功能、环境外源激素与重金属等胁迫下的表达模式及其与甘蔗病原病毒蛋白互作的初步探究,增加了对甘蔗PetC的了解,也为深入研究其在甘蔗受黄叶病毒侵染中的作用奠定基础。     

沙棘3-磷酸甘油脱氢酶基因生物信息学及表达分析

沙棘果肉和种子组织中均富含生物活性油。3-磷酸甘油脱氢酶(GPD1)是促进油脂合成前体甘油-3-磷酸(G3P)合成的限速酶。本研究对沙棘HrGPD1基因进行生物信息学分析(氨基酸序列,保守域,亚细胞定位等),及其在沙棘不同组织(果肉和种子)中的表达情况。研究发现:HrGPD1开放阅读框为1 143 bp,编码380个氨基酸,无信号肽和跨膜结构域,存在多个磷酸化位点,定位于质体中,蛋白高级结构以α-螺旋为主,该蛋白序列与桑、梅、烟草和拟南芥的GPD表现出较高的序列相似性。qRT-PCR分析发现,HrGPD1基因在沙棘品系‘新俄3号’成熟种子和果肉中的相对表达量分别为0.52和1.35,与二者的含油率高低规律相一致。这为进一步研究HrGPD1基因在沙棘生物活性油合成过程中的作用机理提供科学依据。     

萼脊兰MADS-box基因的克隆及表达载体构建

为了研究"ABC"模型的B类PI基因,探究决定花瓣和雄蕊形成的基因特征。采用CTAB法提取萼脊兰花瓣总RNA,并通过RT-PCR法克隆萼脊兰PI基因的编码序列,该序列长度为633 bp,编码210个氨基酸,与小兰屿蝴蝶兰的氨基酸相似性最高。对PI所表达蛋白质的结构、亲水性和二级结构进行了分析,结果显示,该基因包含MADS-box和K-box保守结构域,属于MADS-box基因家族;该蛋白分子属于亲水性蛋白,包含56.19%α螺旋、13.81%的延伸链以及30%的不规则折叠,实时荧光定量PCR结果显示,PI基因主要在花器官中表达,且表达量高,说明PI基因的表达具有组织特异性。构建植物表达载体的结果显示,目的基因和带启动子的片段已插入到表达载体p CAMBIA1301中,表明成功构建植物表达载体1301-PI,为最终获得新奇花型的萼脊兰奠定基础。     

MADS-box基因GmAP3的克隆及生物信息学分析

植物MADS盒基因蛋白是一类在生物发育过程中起着重要作用的转录因子家族。本研究在前期大豆花芽转录组测序分析的基础上,利用RACE技术成功克隆了一个MADS-box基因的全长cDNA序列,利用生物信息学方法对它所编码的氨基酸基本性质和结构进行了系统分析。结果表明,该基因属于MIKC家族,为亲水性蛋白,稳定性较好;二级结构中同时含有α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲结构,其中α-螺旋和无规则卷曲所占比例均较高;亚细胞定位分析显示其定位在细胞核上;聚类分析表明该基因属于AP3亚家族,该基因编码的氨基酸与拟南芥AP3蛋白的同源性为41.18%,与大豆中GmNMH7的同源性最高为97%,命名该基因为GmAP3。本研究成功克隆出GmAP3基因,为该基因的进一步研究提供实验材料,并通过生物信息学分析预测,为下一步该基因的功能研究提供依据。     

荸荠查尔酮异构酶基因的克隆与表达分析

查尔酮异构酶(CHI)是植物黄酮合成途径的关键酶,为了研究鲜切荸荠贮藏过程中表面黄化的机理,利用RACE技术对荸荠CHI基因编码区cDNA全长进行克隆,并分析其在不同组织和鲜切荸荠贮藏过程中的表达。结果表明,荸荠CHI基因(CwCHI)cDNA序列长度为1 003 bp(GeneBank:MG719238),含有一个744 bp的最大开放阅读框,其DNA包含3个内含子和4个外显子。Cw CHI可编码247个氨基酸,经预测其分子量为26.410 kD,理论等电点为4.89。Cw CHI蛋白的二级结构以α-螺旋为主,占38.06%。通过多重比对发现,CwCHI具有该家族特有的保守结构域,决定底物偏好性的第201位氨基酸为Ser,与其他Ⅰ型CHI蛋白相同。系统进化分析表明CwCHI与油棕榈和菠萝的CHI蛋白亲缘关系较近。荧光定量PCR分析表明,CwCHI基因在荸荠皮中的表达量最高,而在荸荠肉中的表达最低。鲜切荸荠黄化过程中CHI活性和CwCHI表达量快速上升,水杨酸处理抑制了CHI活性的上升和CwCHI的表达。     

甘蔗β-胡萝卜素异构酶基因家族的鉴定、定位和表达分析

独脚金内酯(strigolactones, SLs)是一种广泛存在、能够抑制植物分蘖或分枝的植物激素。β-胡萝卜素异构酶(D27)是SLs合成中的关键酶,但是目前关于甘蔗D27基因家族的鉴定与分析鲜有报道。本研究通过挖掘甘蔗原始亲本之一的割手密种基因组数据鉴定了5个割手密种D27基因家族成员。系统进化树分析发现,割手密种D27s分处在3个不同系统发育分支,与高粱D27s高度同源。保守结构域预测揭示,割手密种D27s包含β-胡萝卜素异构酶的典型结构域Pfam:DUF4033。顺式元件分析结果显示,割手密种D27s主要参与调控激素和胁迫响应,以及植物生长发育等。基于甘蔗栽培种转录组数据分析发现,甘蔗割手密种D27基因家族成员(Sspon.06G0012830-1A)的同源基因同时参与甘蔗分蘖调控及黑穗病菌胁迫响应。在此基础上,我们克隆获得了甘蔗栽培种ROC22中的同源基因cDNA序列,命名为ScD27.1 (GenBank登录号为MT499895)。生物信息学分析结果显示, ScD27.1编码266个氨基酸,其蛋白等电点为8.91,分子量为30.00 kD,是不稳定蛋白且定位于叶绿体。二级结构主要包括α-螺旋和无规则卷曲,具有叶绿体转运肽,包含4个泛素化位点和18个磷酸化位点。qRT-PCR表达分析表明,ScD27.1基因受ABA及H2O2显著诱导表达,但对MeJA、SA胁迫响应不明显。亚细胞定位结果显示, ScD27.1蛋白可能定位于细胞膜和叶绿体,参与细胞内膜泡运输或由液泡前体、胞内运输小泡分拣运输。以上研究表明, ScD27.1基因可能参与黑穗病菌侵染诱导的甘蔗分蘖及ABA和H2O2相关信号通路。本研究为了解甘蔗ScD27.1蛋白在胞内运输和分蘖中的作用及其参与甘蔗-黑穗病菌互作提供一定的基础理论。