鸡、 猪大肠杆菌ESBLs基因型检测及耐药性分析

为检测不同动物源大肠杆菌中超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的基因型,探究ESBLs对大肠杆菌耐药性的影响,指导兽医临床有效防治大肠杆菌病.采用NCCLS标准方法和双纸片协同法,对102株大肠杆菌菌株进行抗菌药物敏感性测定和和ESBLs检测,设计合成4对引物,用PCR方法进行了ESBLs耐药质粒的DNA扩增和基因型分析.结果表明:以产ESBLs细菌的耐药质粒为模板扩增出了与预期片段大小相符的TEM、CTX-M型ESBLs产物,但均未扩增出SHV、OVA型ESBLs产物.鸡源、猪源产ESBLs菌株检出率分别为81％、6％.CTX-M、TEM型为山东莱西地区动物源产ESBLs大肠杆菌菌株的流行基因型,且鸡源产ESBLs大肠杆菌菌株分布广泛,应加强当地产酶耐药菌的监测和研究,以有效防治此类细菌引发的疾病.     

鸡猪源大肠杆菌CTX-M型ESBLs的分子检测

为了解河南地区鸡猪源CTX-M型超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的流行情况,并进行基因型分析,通过表型确证试验检测产ESBLs大肠杆菌,分别用5组CTX-M型引物对其进行聚合酶链式反应扩增.表型确证试验检测结果显示,鸡、猪源大肠杆菌中产ESBLs菌株检出率分别为62.8%(59/94)和78.3%(36/46).PCR扩增结果进一步显示,鸡源大肠杆菌中CTX-M型ESBLs阳性率为89.8%(53/59),其中CTX-M-2组型14株,CTX-M-9组型26株,CTX-M-2和CTX-M-9组型13株;猪源大肠杆菌CTX-M型ESBLs的阳性检出率为69.4%(25/36),其中,CTX-M-2组型7株,CTX-M-9组型17株,CTX-M-2和CTX-M-9组型1株.河南地区鸡、猪源大肠杆菌CTX-M型ESBLs的产生率较高,而以CTX-M-2组型和CTX-M-9组型为主.     

猪、鸡大肠杆菌ESBLs的基因型检测

【目的】为克服产生ESBLs细菌的耐药性,指导临床合理用药。【方法】笔者对产生ESBLs的大肠杆菌,用PCR方法进行了扩增测序和基因型分析【结果】产生ESBLs细菌均扩增出了TEM型引物但都没有扩出SHV引物。【结论】国内猪鸡产ESBLs大肠杆菌目前还未通过质粒进行细菌间耐药基因的交换。     

新疆牛羊源耐药大肠杆菌β-内酰胺酶及16S rRNA甲基化酶基因检测

摘要：【目的】了解新疆某羊场、牛场耐药大肠杆菌携带 β-内酰胺酶和/或 16S rRNA 甲基化酶基因及其共存情况。【方法】通过 PCR 方法对 168 株羊源和32株牛源耐β-内酰胺类药物大肠杆菌进行 β-内酰胺酶及 16S rRNA 甲基化酶基因检测,并对检出基因的 PCR 产物测序。【结果】检测结果为：羊源大肠杆菌携带的 -内酰胺酶基因为blaTEM（42.26%,71/168）和blaCTX-M（2.98%,5/168）;牛源大肠杆菌携带的-内酰胺酶基因为blaTEM（15.63%,5/32）基因,未检出blaCTX-M;两个养殖场均未检出其他被检基因。羊源、牛源大肠杆菌携带的16S rRNA甲基化酶基因为rmtB基因,其检出率分别为4.17%（7/168）和50.00%（16/32）,均未检出armA基因。基因共存情况：3（1.79%）株羊源菌同时携带blaTEM和blaCTX-M基因,7（4.17%）株羊源菌同时携带blaTEM 和rmtB 基因;2（6.25% ）株牛源菌同时携带blaTEM 和rmtB基因。【结论】羊源和牛源分离的大肠杆菌中存在-内酰胺酶和16S rRNA甲基化酶基因介导的细菌耐药,均以blaTEM和rmtB基因为主。此外,存在不同类型耐药基因共存于同一株耐药菌的现象。     

禽流感病毒H9亚型HN31株NS基因

为克隆和分析禽流感病毒（H9亚型）HN31株的NS基因的分子特征,通过RT-PCR方法扩增其NS基因,PCR产物与载体pMD19-T Vector连接,转化大肠杆菌DH5α,经蓝白斑筛选,调取阳性菌落,摇菌过夜,提取质粒进行PCR鉴定和酶切鉴定,送阳性重组质粒测序。结果显示RT-PCR产物大小为919 bp,HN31株的NS基因长度为890 bp;其与H6、H9亚型的A型流感病毒的亲缘关系比H5、H7、H3、H1亚型流感病毒更近。     

质粒介导的喹诺酮类耐药基因在鸡源大肠杆菌中的流行

为了解河南省质粒介导的喹诺酮类耐药基因(qnrA、qnrB、qnrS、qepA和aac(6′)-Ib-cr)在产16S rRNA甲基化酶鸡源大肠杆菌中的流行与分布,分别设计特异性引物对2005-2008年在河南省病鸡病料中分离保存的158株16SrRNA甲基化酶阳性鸡大肠杆菌进行PCR扩增。结果显示,在158株产16S rRNA甲基化酶鸡源大肠杆菌中,qnrA、qnrB、qnrS、qepA和aac(6′)-Ib-cr的检出率分别为0.6%,2.5%,13.9%,2.5%和58.2%。提示质粒介导的喹诺酮类耐药基因在河南省产16S rRNA甲基化酶鸡源大肠杆菌中普遍存在,且以qnrS和aac(6′)-Ib-cr为主。     

产蛋异常蛋鸭H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定

从表现产蛋异常的蛋鸭中分离到1 株病毒, 经血凝抑制试验（HI）和聚合酶链反应（PCR）方法鉴定为H9N2亚型禽流感病毒。在GenBank中,BLAST分析扩增的该病毒3个基因片段表明,该株病毒与96年我国山东鸡H9N2亚型禽流感病毒(A/chicken/Shandong/6/96(H9N2))各相应的基因片段同源性最高,均为99%,所扩增的3个片段均为禽源H9N2亚型禽流感病毒的相应基因片段。对HA基因的遗传进化分析表明,该病毒与参考毒株（A/CK/BJ/94）处于同一进化分支上。     

大肠杆菌生物膜毒力基因的检测

通过确定大肠杆菌形成生物膜毒力基因的分布情况,为大肠杆菌生物膜的形成机理提供理论依据。本实验利用PCR聚合酶链式反应,对25株大肠杆菌阳性菌株菌进行了相关毒力因子fimH,Kp sMTII,chuA,fliC,yja和PapC的检测筛选。其结果显示：KpsMTII在所检测25株菌中出现的频率最高,占40%;其次是fliC,占32.5%,fimH占20%,合计占52.5%;chuA占7.5%,yja和PapC均未检出。结果表明：细菌粘附结构fimH基因和fliC基因是影响大肠杆菌形成生物膜的主要粘附结构毒力基因,其次是大肠杆菌毒力因子KpsMTII基因,最后是外膜蛋白血红素chuA基因。     

河北省南部鸡肝周炎大肠杆菌的分离及血清型鉴定

本文对2003.3-2008.4年自河北省邯郸市、邢台市、石家庄市、衡水市、沧州市等发病鸡场呈现典型肝周炎病变的病死鸡肝脏分离的132株致病性大肠杆菌进行了生化特性测定,O抗原血清型鉴定及药敏试验。结果表明132株均符合大肠杆菌生化特征。试验用55种大肠杆菌单因子阳性血清进行O血清型鉴定,确定了103株O血清型,占分离菌株数的78.03％（103/132）。选取O1、O21、O65、O78、O93 血清型共15株菌株（每一血清型选取3株不同来源的菌株）做药敏试验,证实多数菌株对丁胺卡那霉素高敏,对头孢曲松中敏,而对磺胺甲硝唑耐受。     

麻花鸡副黏病毒ZH-1株F基因真核表达载体的构建

将麻花鸡副黏病毒ZH-1株毒种接种于11日龄SPF鸡胚,收集48～96h死亡的鸡胚尿囊液.参考已发表的鸡源副黏病毒F基因序列,设计并合成了一对特异性引物,用以扩增麻花鸡副黏病毒ZH-1株F基因,预期扩增的F基因片段包含完整的开放阅读框.通过RT-PCR扩增出麻花鸡副黏病毒ZH-1株F基因片段,琼脂糖凝胶电泳回收、纯化,得到F基因片段,经EcoR I和Sal I消化,将F基因克隆进入PCI-neo载体,转化大肠杆菌DHSa,挑选菌落,经限制性核酸内切酶Sal I和EcoR I双酶切及PCR鉴定,结果证明重组真核表达载体PCI-neo-F构建成功,为下一步在哺乳动物细胞vero细胞中表达打下良好的基础.扩增的F基因测序后,与其他禽副黏病毒1型F基因进行系统发育树的分析比较,为阐明麻花鸡副黏病毒ZH-1株的遗传背景奠定了基础.     

大肠杆菌噬菌体Bp7裂解性能分析

以40株鸡致病性大肠杆菌为作用对象分析噬菌体Bp7的裂解谱,并用透射电镜较系统地观察分析噬菌体Bp7侵染并裂解大肠杆菌的过程。结果显示,噬菌体Bp7可裂解40株鸡致病性大肠杆菌中的14株,裂解率达35%。噬菌体Bp7头部外廓呈六边形,平均直径约93nm,尾长约106nm,有尾鞘。噬菌体Bp7侵染大肠杆菌后30min时处于隐蔽期,45min时处于成熟阶段,60min时已经进入释放期,一个溶菌周期大约为60min。试验为噬菌体作为抗生素替代品治疗细菌病的研究提供了理论基础。     

山西省雏鸡致病性大肠杆菌病原学研究

针对雏鸡大肠杆菌病病原的复杂特性,从山西省部分地区采集疑似大肠杆菌病死亡的雏鸡病料,并进行细菌分离、生化试验、血清学鉴定和致病性试验。结果分离出37株大肠杆菌。通过血清型鉴定,有15株大肠杆菌鉴定为:O119、O60、O7、O88、O45、O10、O11、O2、O103、O81等10个血清型,其中O119和O88为优势血清型;其余菌株未鉴定出血清型。37株分离菌株的致病性试验表明:有35株为雏鸡致病性大肠杆菌;2株为非致病性大肠杆菌,其血清型均为O10。研究结果为雏鸡大肠杆菌病的防制提供了可靠的理论依据。     

病犬大肠杆菌16S rRNA甲基化酶基因检测研究

摘要：为了解郑州市发病犬大肠杆菌对氨基糖苷类药物高度耐药的16S rRNA甲基化酶流行情况,本研究测定了分离自河南郑州市宠物医院发病犬的123株大肠杆菌对氨基糖苷类代表药物阿米卡星的敏感性;分别设计6种16S rRNA甲基化酶基因特异性引物,对耐药分离株进行16S rRNA甲基化酶基因PCR扩增检测。检测结果显示,在发病犬大肠杆菌中仅检测到armA和rmtB,其检出率分别为3.25%（4/123）和38.2%（47/123）。其中,有3.25%（4/123）的大肠杆菌可同时检测到armA和rmtB。这些结果提示,此地区发病犬大肠杆菌16S rRNA甲基化酶基因以rmtB为主。病犬细菌一旦携带这些耐药基因,可导致对氨基糖苷类药物高度耐药,应引起重视。     

潍坊地区肉鸡致病性大肠杆菌的血清型鉴定及药敏试验

从山东潍坊地区不同鸡场采集病料,经生化试验和血清型鉴定了95株大肠杆菌,78株为致病性大肠杆菌,它们覆盖了14种血清型,其中O78、O2、O15、O11优势血清型。对这些致病性大肠杆菌进行药敏试验,受试菌的平均耐药率为40.6%,同时多重耐药现象普遍。在21种受试药物中,高敏的药物有4种,分别为头孢噻肟钠、磷霉素钠、氟苯尼考、头孢曲松钠。这一结果对指导本地区肉鸡大肠杆菌病防治具有参考价值。     

兔源抗动物腹泻益生菌Tu-1的分离、鉴定及耐受性研究

本研究旨在从健康兔肠道内分离出一株对大肠杆菌有拮抗活性的菌株,并对其鉴定到属。选用平板抑菌圈法,从兔子盲肠中分离得到64株对大肠杆菌有拮抗作用的细菌,对其中14株拮抗作用较强的菌株进行了复筛,其中抑菌圈直径大于20mm的4株,抑菌圈直径在15mm~20mm的8株,另外2株拮抗作用较小,其中Tu-1对大肠杆菌的拮抗作用最强,抑菌圈直径达到21.4mm。在耐受性实验中,Tu-1对酸性环境、胆酸盐和高渗透压均表现出耐受性。对其形态及生理生化特征进行了研究分析,发现与芽孢杆菌相似,将所测得的16S rDNA序列用BLAST软件在GenBank数据库中进行比对,选取序列相似性高的菌株,用Clustal X(1.8)软件进行16S rDNA相似性分析,Neighbor-Joining法构建系统发育树。Tu-1与Bacillus velezensis的相似性水平均达到99.77%,鉴定该菌为Bacillus velezensis。     

棉田黄萎病菌致病型群落结构研究

通过对两地同一病田不同抗病品种中分离获得的47个菌株的致病力测定结果表明,同一棉田中不同黄萎病菌株的致病力差异十分显著,强致病力类型、中等致病力类型和弱致病力类菌株分别占测试菌株的51.6%、32.3%、16.1%,落叶型菌株占16.1%。从抗病品种上分离到的菌株致病力差异大,落叶型菌株和弱致病力类型菌株所占的比例高。通过对不同抗病品种田间连续调查记录发现:落叶型棉花黄萎病株在病害的发生初期及后期所占比例大,在感病品种上比在抗耐品种上发病率高。这一结果表明棉田黄萎病菌的致病力类型是多样的,是一个由弱到强连续变化的群体。     

应用多元PCR鉴定水体中大肠杆菌的毒素基因

根据已发表的大肠杆菌毒素基因序列,针对大肠杆菌的8种毒素基因设计特异引物并进行多元PCR扩增,验证多元PCR技术的可靠性及其在水环境中大肠杆菌毒素基因检测的实用性。