玉米ZmPR4启子的克隆及其在小麦幼胚愈伤组织中的活性分析

以玉米B73基因组DNA为模板, 通过特异PCR扩增, 克隆出玉米启动子ZmPR4序列。序列分析表明, 该启动子与AJ969166序列同源性为100%。构建了ZmPR4或玉米泛素基因(Ubiquitin)启动子控制的报告基因GUS的表达载体。通过基因枪介导法转化小麦幼胚愈伤组织。瞬间表达实验表明, 在小麦幼胚愈伤组织中, 玉米ZmPR4启动子的本底表达活性明显比Ubi启动子的低, 但经纹枯病菌诱导后, ZmPR4 启动子控制的GUS基因的表达明显增强。PCR检测结果证实ZmPR4 启动子在小麦愈伤组织中具有表达活性, 能够驱动GUS基因的表达。因此, 玉米ZmPR4启动子在小麦抗病基因工程育种中具有潜在的应用价值。     

玉米ZmPR4启动子的克隆及其在小麦幼胚愈伤组织中的活性分析

以玉米B73基因组DNA为模板,通过特异PCR扩增,克隆出玉米启动子ZmPR4序列。序列分析表明,该启动子与AJ969166序列同源性为100%。构建了ZmPR4或玉米泛素基因(Ubiquitin)启动子控制的报告基因GUS的表达载体。通过基因枪介导法转化小麦幼胚愈伤组织。瞬间表达实验表明,在小麦幼胚愈伤组织中,玉米ZmPR4启动子的本底表达活性明显比Ubi启动子的低,但经纹枯病菌诱导后,ZmPR4启动子控制的GUS基因的表达明显增强。PCR检测结果证实ZmPR4启动子在小麦愈伤组织中具有表达活性,能够驱动GUS基因的表达。因此,玉米ZmPR4启动子在小麦抗病基因工程育种中具有潜在的应用价值。     

小麦穗发芽抗性相关Vp1基因启动子的分离及功能验证

成熟期穗发芽严重影响小麦产量和品质。Vp1是调节胚发育, 促进胚成熟和休眠的重要转录因子, 对小麦种子休眠和穗发芽抗性具有重要作用。本研究分离了普通小麦B基因组Vp1基因的启动子, 生物信息学预测结果表明, 其含有9个脱落酸响应元件ABRE、2个DREB和6个MYB干旱响应元件、3个赤霉素响应元件GARE、1个水杨酸响应元件TCA-E、2个茉莉酸甲酯响应元件TGACG-motif、4个SKn-1和1个RYREPE胚乳特异表达元件。采用5′端缺失的方法, 构建了系列含Vp1启动子不同区段融合GUS报告基因的瞬时表达载体和植物表达载体。通过基因枪转化小麦愈伤组织, 瞬时表达结果显示, Vp1启动子在无诱导的情况下不能启动GUS基因表达, 在低温、ABA、GA、PEG和NaCl诱导后可以启动GUS基因表达, 表现诱导表达特性, 且其诱导表达强度随启动子缺失片段长度变短而减弱。利用Gateway方法成功构建了6个启动子各缺失片段类型的植物表达载体, 并通过农杆菌介导转化四倍体小麦Stewart, 获得转基因植株。该启动子可有效启动GUS基因在转基因植株的花药、糊粉层、穗轴及根中表达, 其他组织中没有表达。当启动子片段大于660 bp时, 外源ABA可诱导启动子启动GUS基因在转基因植株茎节中的表达。     

逆境诱导型启动子rd29A诱导ipt基因转化烟草的研究

构建诱导型启动子rd29A驱动下ipt基因表达载体,经农杆菌介导转入烟草,同时构建CaMV35S启动子驱动下的ipt表达载体作为对照,以研究两种启动子诱导下目的基因的表达差异.同时对遗传转化后的外植体进行常温(25℃)和4℃低温诱导处理,比较分析不同温度及处理时间对rd29A-ipt及35S-ipt转化的受体材料的愈伤组织诱导、生长和分化情况的影响,结果表明:rd29A启动子在4℃低温诱导12h时,能够很好的调控ipt基因的表达,使烟草外植体正常分化,获得较高的抗性愈伤诱导率,与转rd29A-ipt植株在常温处理以及对照载体低温和常温三种处理之间差异性显著.35S启动子由于诱导ipt基因过量表达而使植株生长受到抑制.PCR检测结果表明ipt基因和rd29A基因已整合到烟草基因组中.     

rd29A启动子的克隆及提高烟草抗逆性的研究

根据GenBank上公布的rd29A基因序列(D13044),利用PCR方法从拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组DNA中扩增得到了rd29A基因的启动子片段.序列分析表明,该片段与D13044有99%的同源性,它包括了DRE等4种完整的顺式作用元件.与GUS基因融合构建双元植物表达载体pBI-rd.转基因烟草的GUS活性组织染色分析及Northern杂交分析均表明,3种胁迫处理均可诱导GUS基因大量表达.其中,15%PEG和0.5%NaCl胁迫处理的转基因烟草比0℃低温处理的转基因烟草的GUS表达量高,而未经胁迫处理的转基因烟草的GUS基因只有少量表达.这些结果表明,rd29A属胁迫诱导型启动子,当植物遭受逆境胁迫时,rd29A启动子可以驱动下游目的基因超量表达,这就为通过基因工程途径提高植物抗逆性奠定了基础.     

大豆抗逆基因GmDREB3启动子的克隆及调控区段分析

GmDREB3基因能提高转基因烟草和拟南芥的抗逆性。利用SiteFinding-PCR技术, 从大豆品种铁丰8号基因组中分离到大豆抗逆基因GmDREB3启动子片段, 长度1 648 bp。该片段富含A/T碱基, 还含有TATA-box、低温响应元件MYC及其他顺式元件MYB、CAAT-box等。将该启动子分区段与GUS报告基因连接构建表达载体, 利用基因枪法转化小麦愈伤组织, 并进行干旱、高盐、低温等处理, 通过组织化学染色和GUS荧光定量测定分析各区段调控元件的活性。结果表明, 在干旱和低温的诱导下, 该启动子能激活下游GUS基因的表达, 在–285 ~ –1 117区域存在与低温和干旱应答有关的重要调控元件, 在–1 464 ~ –1 648区域内存在抑制启动子活性的调控元件。由此推断, 在逆境条件下通过启动子区域正、负调控元件的共同作用, 使GmDREB3基因的表达维持在一个恰当的水平。     

大豆抗逆基因GmDREB3启动子的克隆及调控区段分析

GmDREB3基因能提高转基因烟草和拟南芥的抗逆性。利用SiteFinding-PCR技术, 从大豆品种铁丰8号基因组中分离到大豆抗逆基因GmDREB3启动子片段, 长度1 648 bp。该片段富含A/T碱基, 还含有TATA-box、低温响应元件MYC及其他顺式元件MYB、CAAT-box等。将该启动子分区段与GUS报告基因连接构建表达载体, 利用基因枪法转化小麦愈伤组织, 并进行干旱、高盐、低温等处理, 通过组织化学染色和GUS荧光定量测定分析各区段调控元件的活性。结果表明, 在干旱和低温的诱导下, 该启动子能激活下游GUS基因的表达, 在–285 ~ –1 117区域存在与低温和干旱应答有关的重要调控元件, 在–1 464 ~ –1 648区域内存在抑制启动子活性的调控元件。由此推断, 在逆境条件下通过启动子区域正、负调控元件的共同作用, 使GmDREB3基因的表达维持在一个恰当的水平。     

拟南芥启动子rd29A在长春花中的瞬时转化及功能鉴定

拟南芥诱导型启动子rd29A作为低温及盐胁迫的诱导型启动子,其在长春花中的生物学功能为长春花转基因植物的构建提供了一个可控的基因表达体系。本研究通过克隆拟南芥启动子rd29A,替换双元载体p BI121中组成型启动子Ca MV 35S构建表达载体rd29A::GUS,经根瘤农杆菌(GV3101)介导转化长春花顶端分生组织实现GUS基因在rd29A启动子驱动下的瞬时表达。表明:同常温条件(25℃)相比,经低温诱导(4℃)12 h后长春花中GUS基因表达量升高了四倍,GUS染色也同时证明了低温可成功诱导rd29A启动子在长春花中的生物学活性,进而为长春花诱导型基因表达的转基因植物构建提供了可行的理论依据。     

百子莲ApCathB启动子克隆及其对超低温保存的响应分析

组织蛋白酶B基因(ApCathB)是影响百子莲胚性愈伤组织超低温保存冻存率的关键基因,为探究ApCathB如何响应超低温保存复合逆境,利用染色体步移法扩增获得ApCathB的启动子序列,使用PlantCARE在线软件分析该启动子中含光、激素和非生物胁迫相关的顺式作用元件。将ProApCathB::GUS表达载体转化拟南芥,获得转基因植株,GUS组织化学染色表明ApCathB启动子在拟南芥幼苗时期和小花等部位活性较高,在成熟叶中较低。转基因拟南芥萌发60 h幼苗在超低温保存处理过程中,GUS基因和蛋白的表达量在脱水处理后显著提高,暗示ApCathB启动子受到脱水处理的诱导进而响应超低温保存复合逆境,这为进一步研究ApCathB在百子莲超低温保存中的功能及其相关调控机制提供了数据参考。     

大豆CHI1基因启动子的克隆及功能初探

为了解大豆ClassⅠ几丁酶基因(Chitinase gene)对不同胁迫响应的分子机制。利用PCR技术克隆了大豆ClassⅠChitinase基因的启动子片段(Gm CHI1p),序列分析表明,扩增片段(1 641 bp)与Gen Bank中的已知序列同源性达99.8%,且含有多个胁迫响应调控元件。利用GUS基因上游无启动子的表达载体p CAMBIA1391Z,构建GmCHI1p与GUS基因融合的植物表达载体pCAM-Gm CHI1p,并通过农杆菌介导法导入烟草中。在转基因烟草愈伤组织中检测到GUS活性,表明该启动子具有启动活性。对转基因烟草中的GUS活性进行初步定性分析,结果表明,GmCHI1p可驱动GUS基因在转基因烟草的根部特异性表达,而且在伤害处理的叶片中检测到GUS的强烈表达,表现出明显的根组织特异性及伤害诱导性。这种伤害诱导仅在伤害组织部位及其附近高效表达而没有被长距离传递,预计该启动子在转基因抗虫分子育种中具有巨大的应用前景。     

拟南芥WUS基因的克隆及植物表达载体的构建与鉴定

克隆得到正确的拟南芥WUS基因,成功构建WUS基因组成型植物表达载体和WUS-EGFP融合基因诱导型植物表达载体,分别转化了根癌农杆菌EHA105,并用WUS基因组成型植物表达载体转化橡胶树愈伤组织,得到组织化学检测阳性的愈伤组织,为深入研究WUS基因生理生化功能做准备。用双酶切切下植物表达载体PBI121的35S-GUS片段,将其连接到pCAMBIA2301上成为中间植物表达载体pCAMBIA2301-35S-GUS。提取拟南芥总RNA,通过RT-PCR方法获得WUS基因,经过TA克隆连接到pEASY-T1载体上,再用双酶切切下WUS基因,将其取代pCAMBIA2301-35S-GUS中的GUS片段,形成pCAMBIA2301-35S-WUS植物表达载体。同时以质粒pCAMBIA2301-EGFP为模板,PCR获得EGFP,用重叠延伸PCR技术（gene splicing by overlap extension PCR,简称SOE PCR）获得WUS- EGFP融合基因,经双酶切将融合基因连接到诱导型植物表达载体pER8上,构成pER8-WUS-EGFP诱导型植物表达载体。通过电击转化法将这两个载体成功转入根癌农杆菌EHA105中,经过双酶切检测、PCR检测与测序分析,检测结果皆完全正确,克隆的WUS基因与WUS-EGFP融合基因序列和NCBI上公布的序列也完全一致,说明这两个植物表达载体已经构建成功。另外用pCAMBIA2301-35S-WUS植物表达载体遗传转化橡胶树易碎胚性愈伤组织,经GUS染色为蓝色,说明愈伤组织转化成功。     

虾青素合成关键酶基因bkt植物表达载体的构建 及对玉米的遗传转化

虾青素是一种具有极强抗氧化活性的类胡萝卜素，具有广泛的应用价值。β-胡萝卜素酮化酶（Bkt）是由玉米黄素合成虾青素生物合成途径中的关键酶。采用La Taq DNA聚合酶用PCR的方法从pET-28a（+）bkt中扩增得到bkt基因，用bkt基因替换pBI221中的GUS基因形成含有CaMV 35S启动子和NOS终止子的bkt基因表达盒，然后插入植物表达载体pCAMBIA1301的多克隆位点，最终获得带有选择标记和报告基因的植物表达载体pCAMBIA1301-bkt。通过农杆菌LBA4404介导将其转化进入玉米自交系齐319，转化后的愈伤经GUS组织化学染色分析表明bkt基因已经转入玉米胚性愈伤组织     

冬小麦遗传再生体系及根癌农杆菌介导的转化研究

摘要:以冬小麦品种临优145的幼胚为外植体,消毒后用解剖刀挑取幼胚,盾片朝上接种于MS+2,4-D 2 mg/L+肌醇100 mg/L＋MES 400 mg/L＋CH 100 mg/L[7]＋40g/L麦芽糖＋8g/L琼脂的培养基中诱导愈伤组织, 每两周继代一次,将诱导出的淡黄色、颗粒状Ⅱ型胚性愈伤组织接种于分化培养基（MS+ZT 1 mg/L+IAA 1mg/L+ MES 400 mg/L＋CH 100 mg/L+麦芽糖40g/L+gelrite 2.6g/L,PH5.8）上培养2－3周,然后转接到再生培养基(1/10MS+NAA 0.5mg/L+KT 0.5mg/L+蔗糖30g/L+ gelrite 2.6g/L,PH5.8)中进行再生成苗。接种1229块幼胚,得到987块愈伤组织, Hyg抗性愈伤组织123块,抗性再生植株34株。在建立了再生体系的基础上,用根癌农杆菌介导法将GUS基因导入幼胚愈伤组织,抗性植株的PCR检测呈阳性。X－gluc染色表明, 少部分愈伤组织出现肉眼可见的蓝色晕斑,说明GUS基因已经在小麦幼胚愈伤组织中表达。     

GUS基因和NPTⅡ基因表达的相关性及其在转基因棉花检测研究中的应用

利用农杆菌介导转化法,将含有35S启动子驱动NPTII基因和GUS基因以及棉纤维特异表达启动子E6驱动目的基因FB的植物表达载体转入到常规棉花R15中.重点分析了GUS基因和NPTII基因在愈伤诱导阶段、T0代及T1代转基因棉花中的表达情况.综合两个基因的表达来进行转基因棉花的阳性鉴定,可以为转基因棉花后代的纯合选育提供双重保障.7个转基因株系选育到T3代共获得株行51个,卡那霉素检测多数株行阳性率在90%以上,其中21个株行阳性率达100%.     

豌豆终止子rbc-T在转基因小麦研究中的应用

目前常用的转基因载体元件大多为真菌或细菌来源,引发对转基因食品安全性的担忧。本研究克隆了豌豆终止子rbc-T,并用其替换农杆菌终止子nos-T构建转化载体,利用基因枪法将携带Ubi启动子、GUS基因和终止子rbc-T组成的最小表达框片段转化普通小麦,同时以带有nos-T终止子的载体为对照,经过PCR检测筛选获得T2代稳定遗传的转基因小麦株系。GUS组织化学染色及酶活定量分析结果表明,带有nos-T及rbc-T的转基因小麦中均能检测到GUS基因不同程度的表达。因此认为,豌豆终止子rbc-T可以代替农杆菌终止子nos-T用于小麦的转基因研究。     

用核基质结合区(SAR)序列提高小麦最小表达框转基因表达的稳定性

采用最小表达框技术转化植物可以规避由骨架序列引起的安全风险。核基质结合区序列SAR (scaffold attachment region)可作为边界元件与核基质结合阻挡转基因片段邻近染色质区的作用与影响, 提高外源基因稳定性。本研究在最小表达框序列两端添加SAR序列, 提高小麦最小表达框转基因表达的稳定性, 提高转化基因的表达效率。首先, 以GUS为目的基因构建带有SAR序列的最小表达框, 以科农199为受体进行基因枪转化, 同时以不加SAR序列的最小表达框片段为对照。带有SAR序列的最小表达框片段共轰击857个幼胚, T₀代获得40株再生植株, PCR检测到16株阳性植株, 转化效率为1.87%; 对这16个阳性单株进行GUS染色, 15株显色; 从来自4个T₀阳性植株的18个T₁代植株中随机选取18株进行PCR和GUS染色检测, 有15株表现为阳性。不带SAR序列的对照片段轰击1012个幼胚, 获得31株再生植株, 其中5株PCR阳性, 转化效率0.49%, 这5个阳性植株中仅2株为GUS染色阳性; 来自于5个T₀代PCR阳性株系的10个T₁代单株中没有发现PCR和GUS染色阳性株。表明SAR序列可以提高基因枪转基因效率和目的基因表达稳定性。为了创制抗旱转基因小麦, 以来自大豆的抗旱相关转录因子基因GmDREB3为目的基因, Bar基因为筛选标记基因, 转化受体小麦济麦22, 共轰击6045个幼胚, 获得再生植株130株, PCR检测阳性植株30株, 转化效率为0.50%; 随机选取6株PCR阳性植株进行RT-PCR分析, 其中5株可检测到外源基因的转录。进一步对这5株RT-PCR阳性植株插入片段完整性进行分析, 其中4株插入片段基本完整。通过real-time PCR分析, 发现T₀代6个RT-PCR阳性植株的外源GmDREB3的拷贝数为1~3个。以上结果证明, 在最小表达框两端加上SAR序列后可以提高小麦最小表达框转基因表达的稳定性。     

SNAC1基因作为筛选标记基因用于棉花的遗传转化

以SNAC1基因作为筛选标记基因,NaCl作为筛选剂,通过农杆菌介导法将SNAC1和GUS基因导入棉花细胞并得到胚性愈伤组织。经过PCR检测证实,外源基因已经整合到棉花基因组中,GUS染色证明GUS基因得到表达。研究了NaCl作为棉花转化细胞的筛选剂在农杆菌介导转化中的应用浓度及方法,即NaCl的筛选浓度在1.1%～1.5%(W/V)之间,在愈伤组织诱导初期适当低一点,随着愈伤组织的生长而加大筛选浓度。由于NaCl不利于胚的分化,经过2～3次继代筛选后要及时去除NaCl以促进胚的分化。