GO基因对草莓遗传转化及抗病性鉴定

利用PCR技术从黑曲霉（Aspergillus niger）中扩增并克隆了葡萄糖氧化酶（glucose oxidase,简称GO）基因,并将马铃薯病原诱导型启动子（Prp1-1基因启动子）与其融合构建了植物表达载体pCAMGO,经农杆菌介导转化获得了转基因草莓.在病原物灰霉菌孢子诱导后,由淀粉-KI的显色反应证实,转基因草莓中GO基因的表达引起H2O2的生成;用草莓灰霉病病原侵染,结果表明：转基因草莓抗灰霉病的能力较对照明显提高.     

转AhCMO基因玉米后代的获得及耐盐性鉴定

试验采用超声波辅助花粉介导法将山菠菜胆碱单加氧酶(AhCMO)基因转入玉米自交系‘郑58’中,经抗生素筛选、PCR检测及自花授粉获得转CMO基因的T2代玉米种子。选取5份T2代玉米种子盆栽进行耐盐性鉴定试验。首先针对其非转基因受体材料筛选出耐盐性鉴定浓度,其后通过生理生化指标对转基因T3代株系进行耐盐性鉴定,同时筛选耐盐性强的株系。结果表明:耐盐性筛选及鉴定的适宜浓度为250mmol/L;依据对苗期生理生化指标的测定分析,在250mmol/LNaCl胁迫下,转基因玉米植株的超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性及叶绿素含量高于非转基因玉米,丙二醛(MDA)含量低于非转基因玉米。SOD活性提高了2%~208%;POD活性提高了22%~65%;叶绿素含量增加了8%~61%;MDA含量减少了3%~93%。试验表明,耐盐基因CMO的转化提高了玉米的耐盐性。依据生理生化指标变化情况建立的耐盐性级别评价方法显示,5份参试株系中耐盐性比对照提高3级的有2份。     

利用AH1基因的遗传转化改良紫花苜蓿耐盐性

由于盐胁迫严重限制了苜蓿的产量,研究构建了沙打旺(Astragalus adsurgens Pall)解螺旋酶基因AH1的植物表达载体p Cambia-AH1,并利用农杆菌介导法将目的基因转化到紫花苜蓿(Medicago sativa L.)中,旨在获得抗盐胁迫能力强的转基因植株。半定量RT-PCR检测和Northern杂交表明AH1基因在5个转基因株系中稳定表达。在盐胁迫条件下,与野生型对照植株相比,AH1转基因株系对中度盐胁迫(200 mmol/L Na Cl)具有较强的耐受性。而且,在中度盐胁迫条件下(200 mmol/L Na Cl),转基因植株累积了大量的游离脯氨酸和可溶糖。研究表明AH1基因可以改善植物盐渗透调节能力,从而导致了AH1转基因植株的抗盐胁迫能力的提高。     

玉米耐盐性的鉴定评价

对14个玉米品种的芽期、苗期、全生育期进行耐盐性鉴定,将穗长、穗粗、行粒数、穗行数、秃尖长、百粒质量等性状的T/CK与全生育期耐盐指数(STI)进行相关分析。结果表明,STI与穗长、穗粗、行粒数、百粒质量的T/CK呈正相关,且达显著或极显著水平;STI与秃尖长呈负相关,达到极显著水平。M14(蠡玉37)在3个时期均表现出较高的耐盐性,而且具有良好的生产潜力,在全盐量0.15%～0.25%的盐渍化土壤上具有一定的推广利用价值;M2(浚单20)、M4(京单28)、M9(锐步1号)在芽期耐盐性较差,但苗期和全生育期有较高的耐盐性,因此,在保证发芽的条件下,有一定的推广应用价值。     

山菠菜胆碱单加氧酶基因对棉花的遗传转化和耐盐性表达

胆碱单加氧酶（CMO）是渗透保护剂甜菜碱生物合成的关键酶之一。以棉花（Gossypium hirsutium L.）泗棉3号的下胚轴切段为外植体，利用农杆菌介导法将克隆自山菠菜（Atriplex hortensis）的AhCMO基因导入其中，通过组织培养胚状体发生途径获得转基因再生植株。以0.5%卡那霉素对再生苗筛选后，PCR检测抗卡那霉素棉苗确认阳性转化株，Southern和Northern杂交结果进一步证实外源基因已导入棉花并得到表达。在温室盆栽条件下，于2片真叶期对转AhCMO基因棉花及其转化受体泗棉3号施加0.5%的NaCl胁迫，15 d后发现其光合作用和植株生长被显著抑制，非转基因棉花泗棉3号的株高、鲜重和光合速率分别降低了57.6%、65.6%和69.9%，而转AhCMO基因的棉株分别降低了37.3%、54.6% 和47.9%。转AhCMO棉花所受盐害程度显著小于非转基因的棉株，说明AhCMO基因的导入和表达提高了转基因棉花的耐盐性。     

chyb基因的玉米遗传转化及后代性状分析

采用"成熟胚原位转化法"用带有质粒p Cambia2300-Lcchyb-bar的根癌农杆菌C58,侵染玉米芽尖生长点,将chyb基因转入玉米优良品系7922中。T0代植株不进行筛选,T1代植株用浓度为250 mg/L草铵膦筛选,存活植株进行PCR和RT-PCR检测,T1代获得24株阳性植株。T2代植株用500 mg/L草铵膦筛选,PCR阳性植株HPLC分析结果表明转基因植株总类胡萝卜素含量较野生型显著提高,其中玉米黄质含量提高了55.81%。转基因玉米叶片净光合速率明显高于野生型。本研究初步证明目的基因chyb已经成功整合到玉米基因组中,为进一步验证chyb基因在玉米中的功能,以及通过基因工程获得高品质的玉米种质资源奠定基础。     

花粉致死基因ZmAA1对玉米遗传转化的研究

为了研究花粉致死基因ZmAA1的功能,进而创制转ZmAA1基因玉米不育新材料。在Gen Bank中找到花粉致死基因ZmAA1及启动子Pg47,并在目的片段的上下游设计増加酶切位点,基因合成构建到克隆载体puc57上,采用传统酶切连接的方法构建了植物表达载体pCAMBIA3300-Pg47-ZmAA1-35S-bar,并利用农杆菌介导法转化优良玉米自交系郑58萌动胚。成功构建植物表达载体pCAMBIA3300-Pg47-ZmAA1-35S-bar;共获得94株除草剂抗性植株,其中47株目的片段PCR呈阳性反应,对温室中表现为花粉败育的PCR阳性植株进行目的片段及筛选标记bar基因RT-PCR与蛋白免疫学试纸条检测,结果表明,花粉致死基因ZmAA1及启动子Pg47已经整合到玉米基因组并表达。     

玉米ZmMGT12基因的表达分析及拟南芥遗传转化

CorA/MRS2/MGT-型镁离子转运蛋白在植物镁离子吸收、转运、分配中有着重要作用。为了探究一个编码蛋白定位于叶绿体的玉米镁离子转运蛋白基因Zm MGT12的功能,对其表达模式、表达量与叶绿素合成间的相关性进行了分析,同时构建了过表达载体并遗传转化了拟南芥。表达分析表明,Zm MGT12在各组织部位中均表达,其中在叶中的表达量最高,大约是根的13倍;此外,Zm MGT12在叶中的表达受光诱导,且具有昼夜节律模式。相关性分析表明,Zm MGT12在叶中的表达量与叶绿素合成具有一定的相关性。转基因分析表明,过表达Zm MGT12没有改变转基因拟南芥植株的生物量、叶绿素含量、叶绿体中镁离子浓度。本研究分析了Zm MGT12详细的表达模式、表达量与叶绿素合成间的相关性,并构建了其过表达载体并对拟南芥进行了遗传转化,有助于确定其在植物中的功能。     

玉米自交系苗期耐盐性鉴定及筛选研究

旨在加强玉米耐盐性的研究和利用,本研究采用水培法,以NaCl胁迫拟田间盐生条件,在适宜的盐胁迫处理浓度的基础上,以耐盐系数为指标,通过主成分分析、隶属函数分析和聚类分析对242 份玉米自交系苗期的耐盐性进行综合鉴定。结果表明：发芽率、根干重、苗干重、根鲜重、根长和苗鲜重可作为玉米自交系的苗期耐盐性筛选和鉴定指标;通过聚类分析可将242 份玉米自交系苗期的耐盐性划分为5 类,其中B红-2 等12 份玉米自交系的耐盐性较强,NC320 等42 份玉米自交系的耐盐性中等,50K-4-1 等58 份玉米自交系的耐盐性一般,H070480 等77 份玉米自交系的耐盐性敏感,甘1 号等53 份玉米自交系的耐盐性高度敏感。     

玉米自交系萌发期耐盐性鉴定

为了完善玉米自交系萌发期耐盐性的鉴定评价标准,筛选耐盐性强的玉米种质资源,解析玉米自交系萌发期耐盐性遗传机制,为玉米萌发期耐盐性育种提供理论依据和技术支撑。对390份玉米自交系耐盐性相关的10个生理指标进行测定,利用主成分分析确定为5个综合指标,即7d发芽率、芽干重、芽鲜重、根干重和根长,可作为玉米萌发期耐盐性鉴定指标。根据隶属函数分析确定各材料的耐盐综合评价指数,并通过聚类分析将材料萌发期耐盐性分为6个等级,其中高度盐敏感型材料298份,中度盐敏感型材料49份,盐敏感型材料27份,耐盐型材料9份,中度耐盐型材料5份,高度耐盐型材料2份。     

玉米淀粉分支酶SBEIIb基因遗传转化玉米自交系的研究

以玉米自交系丹黄25为试材,用农杆菌介导法将玉米淀粉分支酶SBEIIb基因转入玉米中,探讨了农杆菌介导玉米愈伤组织转化的影响因素.结果表明:愈伤组织经过9d的继代,菌液中乙酰丁香酮(AS)浓度为10 mg/L,侵染时间为20 min,共培养60 h为最佳转化条件.获得的4株再生植株经PCR分析鉴定,其中3株表现阳性,证...     

玉米冷响应基因ZmRanBP1遗传转化分析

中国东北地区春季温度较低,玉米容易受冷害影响,导致萎蔫,甚至死亡,最终减产,所以提高玉米适应冷胁迫的能力十分重要。本研究利用RT-PCR的方法从抗冷玉米自交系‘W9816’中成功克隆冷响应基因ZmRanBP1 (RanBP1 domain containing protein)并构建过表达载体pCAMBIA-3301-35S-Zm RanBP1。通过农杆菌介导法获得了3个转基因拟南芥株系,逐代自交均获得T3代纯合拟南芥株系。对转基因拟南芥株系、突变体、野生型拟南芥进行耐冷及耐盐表型鉴定及比价分析,结果发现突变体对逆境胁迫的耐受力更强,具有较高的发芽率。利用农杆菌介导法分别侵染玉米‘Y423’的幼胚和Ⅱ型愈伤,阳性率分别为3.09%和4.15%。在拟南芥中进行逆境胁迫表型鉴定,并转入玉米自交系,可用于抗冷转基因玉米新种质的创制与遗传改良研究。     

雄性不育基因对棉花的遗传转化

利用TA29、A6、A9三启动子功能区与barnase基因融合构建的不育基因以农杆菌介导法对棉花下胚轴进行了遗传转化,通过胚状体途径获得了转基因再生植株.利用150 mg·L-1高浓度卡那霉素(Km)对转化初期筛选出的再生苗进行再次筛选,提高了转化株的选出率.通过PCR检测和Southern dot blot分析从转基因胚状体再生植株中获得了带有barnase不育基因的120株转基因植株.进行转基因植株生物学性状检测和观察表明,所获得的转基因植株对溴苯腈表现出了明显的抗性,并从不育基因转化植株中筛选出了具有明显不育特征的雄性不育株.     

马铃薯StMAPK3基因的克隆及其遗传转化

本研究以拟南芥AtMAPK3的核苷酸序列(Gen Bank accession No.NM_114433.2)作为查询序列进行BLAST搜索获得了马铃薯中的同源序列,将其命名为StMAPK3,其开放阅读框为1 122 bp,编码373个氨基酸。StMAPK3具有典型的促分裂原活化蛋白激酶的磷酸化位点TEY基序。从马铃薯栽培品种大西洋中克隆得到编码StMAPK3的基因序列,并构建了其植物表达载体p CPB-StMAPK3。用冻融法将重组质粒转入根癌农杆菌LBA4404中,然后再转化马铃薯栽培品种大西洋获得了转基因植株,为进一步明确MAPK在马铃薯信号转导过程中的作用提供帮助。     

玉米苗期耐盐性鉴定评价方法研究

旨在建立玉米苗期耐盐性有效评价方法,通过梯度微咸水处理和多元统计分析方法对10份玉米品种的苗期耐盐性进行了系统评价。四分位差分析结合玉米耐盐阈值分析表明耐盐鉴定的最佳胁迫浓度为0.5%。利用主成分分析和隶属函数分析可将7个农艺性状的耐盐系数转化为隶属函数耐盐性综合评价值（D值）。结合聚类分析可将玉米苗期耐盐等级划分为：高耐、耐、中等、敏感、高敏。利用逐步回归分析方法建立了D值与7个农艺性状耐盐系数的回归方程：D=-1.147+0.823*长径+0.713*株高。上述研究为评判玉米苗期耐盐性提供了科学方法。     

玉米冷响应基因ZmCyp40克隆及其遗传转化

从抗冷玉米自交系W9816中克隆冷响应基因ZmCyp40,对该基因进行序列分析,发现其编码389个氨基酸,与高粱中的同源基因亲缘关系较近。qRT-PCR分析玉米自交系W9816低温(4℃)处理0 h、3 h、6 h、12 h、24 h和48 h后其根、茎、叶中基因ZmCyp40表达情况,发现ZmCyp40在玉米不同部位冷响应表达趋势不同,但均受冷诱导表达。构建ZmCyp40过表达载体,采用农杆菌介导法转化玉米优良自交系Y423的幼胚和愈伤。PCR检测转化植株,ZmCyp40阳性植株率为5.9%。qRT-PCR分析发现部分阳性植株中ZmCyp40基因的表达量有极显著的升高,可用于进一步的功能分析及玉米抗冷性状的遗传改良。     

紫苏FAD3基因RNA干扰载体的构建及遗传转化

本研究利用RNA干扰的方法抑制紫苏ω-3脂肪酸脱氢酶基因FAD3的表达,以期得到低ALA含量的转基因植株。根据紫苏FAD3基因(Gen Bank登录号为KC990786.1)序列设计含有不同酶切位点的特异性扩增引物,通过扩增获得长度为258 bp的RNA干扰片段,构建以Ca MV35S启动子驱动表达的紫苏FAD3基因RNA干扰表达载体p FGC5941M-FAD3I,将该载体转入根癌农杆菌GV2301后,采用农杆菌介导法进行紫苏的遗传转化,经除草剂抗性筛选和PCR检测获得1株阳性转基因植株。利用荧光定量PCR技术对野生型和转基因阳性苗的FAD3基因进行了表达分析,结果显示,阳性植株中FAD3基因的表达受到显著抑制,FAD3基因表达量降低了80%,说明此研究构建的FAD3基因RNA干扰载体对该基因表达沉默是有效的,为FAD3基因在不饱和脂肪酸代谢过程中的功能研究提供了理论依据。     

转录因子基因ZmDREB3转化玉米的研究

利用玉米转录因子ZmDREB3基因(Gene ID:EU964828.1)构建了Ubiquitin启动子驱动的植物表达载体PGM0229-ZmDREB3-EP-SPS,以EPSPS基因为抗性筛选标记,通过花粉管通道法将农杆菌EHA105介导的植物表达载体转化到玉米自交系吉444、Mo17中,通过喷洒350mg/L草甘膦除草剂筛选,得到7株草甘膦抗性植株,用PCR检测得到2个同时整合EPSPS标记基因和ZmDREB3目的基因的转基因株系,用PCR-Southern进一步验证,结果呈阳性。以上结果证明外源基因已经被整合到玉米基因组中。     

基因枪法对大豆进行CpTI基因的遗传转化

以大豆品种合丰25的球形期体细胞胚为受体,以CpTI基因为目的基因,应用基因枪法进行了遗传转化,同时以抗性体细胞胚筛选率作为转化率的指标,对影响基因枪转化的几个参数进行了优化研究。结果表明,氯化钙浓度2.5 mol/L、氦气压力1 100 Psi、轰击次数为2次,有利于提高转化率;经卡那霉素筛选得到抗性植株,经PCR分析鉴定有2株为阳性,初步证明外源基因CpTI已转到大豆基因组内。