重组人早孕因子的表达与纯化

早孕因子(EPF)是具有免疫抑制和生长调节活性的妊娠相关蛋白,为目前最早确认妊娠的生化指标之一。为获得人早孕因子重组蛋白,利用PCR技术扩增人早孕因子基因,克隆入原核表达载体pGEX-6p-1,与GST基因相融合,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌表达菌株BL21,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,以SDS-PAGE和Western blot分析重组蛋白的表达,利用GST树脂纯化表达蛋白。结果成功构建重组表达质粒pGEX6P-EPF,在大肠杆菌中诱导表达了GST- EPF融合蛋白,表达蛋白分子量为37.3kDa,并能被抗GST单克隆抗体特异识别,GST亲和层析纯化,制备了EPF重组蛋白。     

狂犬病病毒糖蛋白胞外区基因的原核表达、纯化及鉴定

利用RT-PCR技术,将狂犬病病毒株ERA株糖蛋白胞外区基因分两段进行扩增,经克隆与序列分析,两片段大小分别为523,381 bp,各编码174,127个氨基酸,分子量分别为19.7,14.5 kDa。在原核表达载体pET-43a中分别克隆了这两段糖蛋白基因,将重组质粒转化到表达菌BL21(DE3)中,经SDS-PAGE电泳分析,在分子量约为94,89kDa处分别出现新蛋白带,和预期的目的蛋白的分子量相符。两重组蛋白主要以可溶形式表达,利用Ni2+亲和层析柱纯化了蛋白,纯度大于95%。Western-Blot分析结果显示,两种重组融合蛋白均可与兔抗RBV多抗血清反应,具有良好的反应原性。     

α-苦瓜素蛋白的原核表达及其抗体制备

α-苦瓜素是一种典型的Ⅰ型核糖体失活蛋白,具有多种生物活性,有着广泛的应用前景。本研究通过原核表达技术成功获得α-苦瓜素蛋白及制备了血清抗体。首先通过RT-PCR方法从苦瓜籽中克隆到α-苦瓜素全长基因,然后将该基因连接至原核表达载体p ET-28a(+)上,导入大肠杆菌Rosetta菌株中并少量诱导表达,筛选出重组蛋白的最适表达条件。在37℃、终浓度1 mmol/L IPTG的诱导条件下,可成功诱导出分子量约为29.7 k D左右的可溶性重组蛋白,与预期α-苦瓜素大小一致。按照最适条件进行大量诱导α-苦瓜素蛋白的表达,利用Ni-NTA柱对α-苦瓜素重组蛋白进行纯化,最后以纯化的α-苦瓜素蛋白免疫注射新西兰大白兔制备抗血清。Western blotting分析表明,制备的抗血清具有较好的特异性和灵敏度,可以特异性检测苦瓜籽中的α-苦瓜素蛋白。本研究结果为下一步探究α-苦瓜素调控植物防御生物胁迫的分子机理提供指导。     

番木瓜畸形花叶病毒HC-Pro蛋白的原核表达与纯化

番木瓜畸形花叶病毒(papaya leaf distortion mosaic virus, PLDMV, Potyvirus属)是目前威胁中国番木瓜种植的主要病原之一。辅助成分-蛋白酶(helper component-proteinase, HC-Pro)是PLDMV编码参与病毒运动、复制、媒介传播、基因沉默抑制的多功能蛋白。为了获得HC-Pro基因的纯化蛋白,本研究通过密码子优化HC-Pro基因序列,成功构建原核表达质粒p ET-30a-HCPro,经IPTG诱导后实现HC-Pro在大肠杆菌中的原核表达,在0.5 mmol/L IPTG,20℃条件下诱导过夜时其表达量最高;破碎菌体后,SDS分析全菌、破碎上清以及沉淀中目标蛋白的表达量,结果显示重组HC-Pro蛋白主要以不可溶的包涵体形式在沉淀中表达;进一步溶解包涵体通过Ni-NTA层析柱进行纯化,在500 mmol/L浓度咪唑下可以获得分子量大小约为54 kD的HC-Pro重组蛋白;Western Blot分析纯化后的目标蛋白,结果显示54 kD处有明显的条带,与预期的HC-Pro重组蛋白大小一致。本研究成功表达并纯化获得了PL...     

鸭疫里默氏菌噬菌体裂解酶的原核表达

为了原核表达鸭疫里默氏菌噬菌体RAP44的裂解酶基因,以噬菌体RAP44的基因组为模板,用PCR方法扩增裂解酶基因,与表达载体p GEX-6P-1连接,将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中表达,利用谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和柱纯化表达蛋白。结果成功构建了表达载体p GEX-N,转化菌经IPTG诱导后成功表达出了分子量约为37 k D的可溶性重组蛋白。本研究获得了纯化的鸭疫里默氏菌噬菌体裂解酶重组蛋白,为裂解酶的功能研究奠定了基础。     

抗菌肽Omiganan的克隆、表达和抑菌活性

为获得Omiganan抗菌肽并研究其抑菌活性,根据Omiganan抗菌肽的一级结构(NH_2-ILRWPWWPWRRK-COOH),通过基因工程技术,参考大肠杆菌和毕赤酵母偏爱密码子原则,分别获得Omiganan核苷酸序列,再以Omiganan核苷酸序列为模板,设计特异性引物,通过PCR技术扩增Omiganan基因,分别与pET32a表达载体和pPIC9K连接构建pET32a-Omiganan原核表达载体和pPIC9K-Omiganan毕赤酵母表达载体,对含pET32a-Omiganan重组质粒的菌株分别采用IPTG 25℃, IPTG 37℃2种温度和自诱导方式表达获得Omiganan重组蛋白,对含pPIC9K-Omiganan毕赤酵母菌株采用1%甲醇诱导获得Omiganan抗菌肽。结果表明,自诱导14 h后Omiganan重组蛋白的表达量最高,IPTG 25℃, IPTG 37℃2种温度皆能诱导Omiganan重组蛋白的表达,但两者之间无显著差异。通过毕赤酵母表达的Omiganan抗菌肽对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有很强的抑菌活性。     

羽衣甘蓝泛素结合酶ubc7基因分离、原核表达及纯化

为分离羽衣甘蓝(Brassica oleracea var. acephala)自交不亲和系(S13-bS13-b)泛素结合酶7(ubc7)基因,探讨Ubc7重组蛋白的原核表达及纯化。利用CTAB的方法提取羽衣甘蓝柱头总RNA,通过RT-PCR的方法分离ubc7基因,将编码ubc7基因的cDNA序列亚克隆到pET-14b原核表达载体中,将阳性重组表达质粒转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)pLysS中,利用IPTG进行诱导表达,并通过Ni2+-NTA树脂进行亲和层析的方法纯化重组蛋白。结果表明,获得的Boubc7含有一个长度为501 bp的开放读码框,编码一个含有166个氨基酸残基的蛋白质。预测BoUbc7的相对分子质量约为18.7 kDa,理论等电点(pI)为5.35。利用IPTG诱导的细菌蛋白中,SDS-PAGE显示出在分子量大小23 kDa处有蛋白特异性的表达,这与预测的His6融合的BoUbc7蛋白分子量相符;利用Ni2+-NTA树脂进行亲和层析纯化后,成功获得了BoUbc7融合蛋白。该试验分离了羽衣甘蓝ubc7基因,并通过原核表达系统获得了BoUbc7重组蛋白,为进一步分析其生物学功能奠定了基础。     

辣椒疫霉菌果胶裂解酶PL101基因真核表达及致病性分析

辣椒疫霉菌(Photophthora capsici)常引起辣椒等多种作物的毁灭性病害,对该病原菌重要功能基因尤其是致病基因的研究具有重要的经济学意义.果胶裂解酶(pectate lyase,PL)为植物病原菌关键致病因子,通过降解寄主细胞壁引起寄主发病.本研究以辣椒疫霉菌PL关键成员(PL101)为材料,通过真核表达系统进行诱导表达重组蛋白.真核表达载体选用pPIC9K,测序验证后的重组质粒pPIC9K/PL101经电击法转化毕赤酵母GS115表达菌株,对阳性转化子进行甲醇诱导型(Mut+)、不同浓度抗生素G418即高拷贝转化子筛选获得表达量可观的重组蛋白表达菌株.重组酵母菌经1％甲醇诱导7d获得重组蛋白,经硫酸铵沉淀法、Ni-NTA亲和层析纯化后获得纯度较高的PL101纯蛋白.经聚半乳糖醛酸反应法测得的PL101酶活达到970 U/mg,接种健康辣椒叶片测试结果表明PL101具较高致病性,表明PL101是辣椒疫霉菌重要致病因子.本研究为进一步阐明PL作用机理提供科学依据,进而为辣椒的抗病育种提供基因资源.     

小麦TaNADP-ME1基因在大肠杆菌中的融合表达及可溶蛋白纯化

NADP依赖的苹果酸酶(NADP-ME)是C4光合途径关键酶。为了确定TaNADP-ME1基因的功能,利用重组技术将前期克隆到的TaNADP-ME1基因构建到原核表达载体pET32a,双酶切和PCR鉴定阳性克隆,CaCl2法转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导融合蛋白表达,Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析柱纯化融合蛋白。成功获得了重组原核表达载体pETE1,TaNADP-ME1基因在BL21(DE3)pLysS中得到了融合表达,SDS-PAGE表明,融合蛋白分子量为80 kDa,并成功纯化到融合蛋白。     

小麦(Triticum aestivum L.)UDP-葡萄糖基转移酶TaUGT6基因的原核表达及蛋白纯化

为了研究小麦抗赤霉病相关UDP-葡萄糖基转移酶TaUGT6基因的功能,利用TaUGT6基因的编码区构建了原核表达载体pGEX-TaUGT6,转化大肠杆菌BL21 (DE3)菌株后,经异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)诱导表达对培养温度、培养时间进行了探索;然后利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)检测重组蛋白,进行蛋白纯化。结果表明:Ta UGT6的编码区为1 473 bp,导入大肠杆菌的TaUGT6基因能够被诱导表达,重组蛋白在25℃经过夜诱导和37℃经6 h诱导效果较好,表达重组蛋白的表现分子量与理论分子量基本一致,利用蛋白层析系统获得了纯度较高的重组可溶性蛋白。本研究为今后通过体外酶活分析、抗体制备等方法深入研究该基因的功能提供了依据。     

拟南芥Alpha-dioxygenase1的原核表达、纯化及活性的检测

从经水杨酸处理的拟南芥开花期植株中获得cDNA,扩增得到Alpha-dioxygenase 1(DOX1)基因,进行原核表达、纯化和生物活性检测。利用原核表达载体pMAL-c4x在T7 Express CompetentE.coli和BL21(DE3)-RIPL codon 菌株中表达DOX1,经Amylose Resin亲和层析柱纯化。SDS-PAGE结果表明,重组融合蛋白在BL21(DE3)-RIPL codon 中的表达通过灰度值比较分析以可溶性为主,表达率约3.7%,纯化的DOX1纯度可达45%。愈创木酚法表明,可溶性重组蛋白不具有过氧化物酶活性;2,4-DNP法测试表明可溶性重组蛋白具有脂肪酸双加氧酶活性。     

水稻OsDREB1A的原核表达及重组蛋白活性分析

OsDREB1A是水稻冷信号传导途径中重要的转录因子。本研究将水稻日本晴OsDREB1A基因通过双酶切方法连接至MSC-TOPOII载体,并重组构建到表达载体PGEX-4T-1,获得融合蛋白表达质粒PGEX-4T-1-OsDREB1A,转化表达菌E.coli BL21(DE3)Condon Plus,诱导表达后通过亲和层析柱Glutathione agarose 4B纯化获得了分子量大小正确的OsDREB1A-GST融合蛋白,EMSA检测发现低温18℃诱导纯化的融合蛋白可以在体外成功结合CRT/DRE顺式元件。为进一步研究OsDREB1A在冷信号传导中的生物学功能奠定了基础。     

水貂阿留申病毒VP2基因的原核表达及初步应用

将水貂阿留申病毒ADV-G株VP2基因中主要抗原表位区的两个片段,分别克隆至原核表达载体pET-28a(+)的多克隆位点中,鉴定后得到重组质粒pET-VP2a和pET-VP2b,将重组质粒转化到宿主菌BL21中,用IPTG分别以不同浓度,不同诱导时间进行诱导表达,采集样品做SDS-PAGE、Western-blot分析,并以此蛋白作为包被抗原进行ELISA检测。结果发现以终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导,4小时后表达可达到高峰,其大小分别约为23kD和28kD, 该蛋白与ADV阳性血清能发生特异性反应。将此表达产物应用Ni-NTA His-Bind纯化系统进行纯化,其纯度可达到91%,纯化后的蛋白以60μg/孔包被96孔板,检测不同地区水貂血清,同时以对流免疫电泳法（CIEP）为对照,结果发现二者的符合率高达93 %,而应用该蛋白进行检测其反应更为安全,背景低,制备简单,这为今后应用该蛋白作诊断抗原检测水貂阿留申病奠定了基础。     

三角褐指藻F-box like蛋白基因的原核表达及蛋白纯化

F-box蛋白是SCF复合体的重要组成元件之一,能通过泛素蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome system, UPS)参与调控胞内蛋白降解、受体识别、信号传导等生物学过程。为了探究一个F-box like蛋白在三角褐指藻细胞周期调控过程中的作用机制,本研究从三角褐指藻中克隆得到一个F-box like蛋白基因,构建原核表达载体Tph-pET28a-F-box,将其转入大肠杆菌BL21 (DE3)菌株中诱导表达,并对其诱导表达条件进行了优化,最后使用镍螯合亲和层析柱(Ni-NTA Agarose)对重组蛋白进行纯化并进行了生物信息学分析。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)检测。结果显示,导入大肠杆菌BL21 (DE3)的三角褐指藻F-box like蛋白基因能够被诱导表达,重组可溶性蛋白最佳诱导条件为16℃时,以浓度为0.1 mmol/L的异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导12 h,纯化后的蛋白通过Western blot鉴定,显示在相对分子质量约为72.75 kD处出现一条与预期大小相符的蛋白印迹条带。生物信息学分析结果表明,该蛋白具有F-box蛋白的典型特征,位于膜外且不含有跨膜结构域,为亲水性蛋白,α-螺旋和无规卷曲为三角褐指藻F-box蛋白二级结构的主要组成元件。本研究为进一步研究三角褐指藻F-box like蛋白的作用机制奠定了基础。     

藏猪IGF-1成熟肽基因的克隆及原核表达

旨在克隆藏猪胰岛素样生长因子1(IGF-1)的成熟肽基因,并进行原核表达的研究。提取藏猪肝脏组织RNA,通过RT-PCR扩增出藏猪IGF-1全长基因,构建重组质粒p MD19-T-IGF-1,以p MD19-T-IGF-1质粒为模板,克隆IGF-1成熟肽序列并构建成熟肽p ET-32α-IGF-1表达质粒,转入大肠杆菌BL21(DE3),对IPTG诱导剂浓度和诱导时间进行优化,Ni-NTA琼脂纯化融合蛋白后采用Western Blot对其鉴定。结果显示,IGF-1成熟肽基因(315 bp),成功构建了成熟肽p ET-32α-IGF-1原核表达质粒;重组大肠杆菌BL21-IGF-1以包涵体形式表达出分子量约31 k Da融合蛋白,最优IPTG浓度为0.5 mmol/L,最佳IPTG诱导时间为10 h;纯化获得了高纯度的融合蛋白,经鉴定IPTG诱导表达和纯化的蛋白为IGF-1融合蛋白。结果表明,成功构建了表达质粒p ET32α-IGF-1及获得重组大肠杆菌BL21-IGF-1,表达了藏猪IGF-1成熟肽融合蛋白及该蛋白具有抗原抗体反应活性。     

羊口疮病毒安徽株121基因的原核表达与生物信息学分析

为了对羊口疮病毒(ORFV)安徽株121基因进行原核表达及生物信息学分析。以ORFV AH-F10株为模板对121基因进行PCR扩增,将扩增产物克隆至p GEX-6P-1原核表达载体,构建重组质粒p GEX-6P-1-121,并进行测序鉴定。经鉴定正确后的重组质粒转化至E. coli Rosetta感受态细胞进行IPTG诱导表达,并对重组蛋白的诱导条件进行优化,确定了ORFV 121重组蛋白表达的最佳条件。SDS-PAGE及Western-blot鉴定结果表明,重组蛋白大小约为60 ku,在Rosetta中高效表达,主要以包涵体形式存在且具有良好的反应原性。包涵体蛋白经过纯化后得到目的蛋白,将纯化蛋白与弗氏佐剂进行乳化后皮下注射6周龄的BALB/c雌鼠。每14 d后加强免疫1次,4次后收集小鼠血清。对收集到的血清进行Western-blot特异性鉴定,该抗体血清可以和阳性原核表达的ORFV 121蛋白进行特异性反应,表明成功制备鼠源多抗血清。利用生物信息学相关软件对目的基因编码蛋白的理化性质、信号肽、跨膜结构域、磷酸化位点、二级结构和B细胞表位进行预测。结果显示该蛋白等电点为8. 86,属不稳定的亲水性蛋白;预测有50个可能的磷酸化位点,无信号肽和跨膜结构域;二级结构中以无规则卷曲结构居多占62. 25%,α-螺旋、β-转角、延伸链分别占27. 81%,2. 98%,6. 95%;预测该蛋白存在8个潜在B细胞优势表位。成功表达了ORFV AH-F10 121蛋白并预测其生物学特性,为该蛋白结构与功能及ORFV致病机理的深入研究奠定基础。     

花烟草NaD1基因的原核表达及纯化

花烟草的花中特异地存在一种植物防御素Nicotiala alata defensin 1 (NaD1),对多种致病性真菌具有防御活性,在天然免疫系统中起着重要作用。该蛋白还对哺乳动物肿瘤细胞具有杀伤作用。本研究构建了原核表达载体p ET28a-NaD1,将其转化到Rosetta菌株中进行诱导表达并优化了诱导表达条件,发现在25℃下,0.5 mmol/L IPTG诱导表达过夜后,目的蛋白积累量达到最高,并主要以可溶性蛋白形式存在。利用Ni柱对NaD1重组蛋白进行亲和层析纯化,产物经Western Blot鉴定发现在16.8 kD处有特异性条带,与预期的NaD1重组蛋白大小一致。本研究结果为进一步研究NaD1蛋白的作用机制提供实验依据。     

抗凋亡融合蛋白PTD-Bcl-xL原核表达载体的构建及表达纯化

人工抗凋亡蛋白PTD-Bcl-x L能保护多种因素引起的细胞异常凋亡,为了获得高纯度Bcl-x L与PTD(Protein transduction domains)的融合蛋白,首先采用TRIzol法提取SD大鼠肝脏总RNA,将RNA反转录为c DNA,设计引物以c DNA为模板,PCR扩增Bcl-x L基因,构建p UM19-T-Bcl-x L质粒,并对质粒双酶切鉴定和测序鉴定;其次设计包含PTD序列的Bcl-x L引物,以测序正确的p UM19-T-Bcl-x L质粒为模板,PCR扩增PTD-Bcl-x L序列,将扩增序列克隆入p ET28a载体,构建PTD-Bcl-x L蛋白的原核表达质粒p ET28a-PTD-Bcl-x L,并对p ET28a-PTD-Bcl-x L载体双酶切鉴定和测序鉴定;将p ET28a-PTD-Bcl-x L重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,并对IPTG诱导融合蛋白表达的浓度和诱导时间进行了优化;SDS-PAGE分析表达蛋白的可溶性情况,在变性条件下用Ni-NTA琼脂纯化融合蛋白;最后用SDS-PAGE、Western Blot及质谱对融合蛋白进行鉴定。结果表明:双酶切p UM19-T-Bcl-x L质粒出现约774 bp大小条带,p UM19-T-Bcl-x L质粒测序结果与NCBI数据库比对序列一致,表明成功构建p UM19-T-Bcl-x L质粒;双酶切p ET28a-PTD-Bcl-x L质粒出现约744 bp大小条带,p ET28a-PTD-Bcl-x L质粒测序结果与预期序列一致,表明成功构建了p ET28a-PTD-Bcl-x L原核表达载体;在IPTG诱导下p ET28a-Bcl-x L重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出36 k Da大小蛋白,最优IPTG诱导浓度为0.1 mmol/L,最佳IPTG诱导时间为6 h;SDS-PAGE电泳显示融合蛋白主要出现在菌液超声后的沉淀里,以包涵体形式表达,经Ni-NTA琼脂纯化获得了高纯度的融合蛋白;Western Blot和质谱鉴定证明IPTG诱导表达蛋白和纯化的融合蛋白为PTD-Bcl-x L蛋白。纯化得到了PTD-Bc L-x L融合蛋白,推进了PTD-Bcl-x L蛋白在猪、牛等家畜精液冷冻保存的应用进程。     

玉米Zmcen基因的克隆、表达与生物信息学分析

为研究玉米Zmcen基因的特征及生物学功能,并对其编码蛋白结构与功能进行分析。以玉米c DNA为模板,将其构建到带有GST表达标签的原核表达载体p GEX-6p-1中,构建的重组载体p GEX-6p-ZmCen转化至大肠杆菌BL21(DE3),通过0.3 mmol/L IPTG在27℃下诱导表达20 h,获得了可溶性的GST融合蛋白。采用GST亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,经12%SDS-PAGE电泳和GST标签抗体Western Blotting检测,鉴定为含有GST-Tag的融合蛋白,纯化的蛋白经Pre Scission Protease(PPase)过夜酶切切除GST标签,得到较纯的ZmCen蛋白;同时利用生物信息学的方法,解析ZmCen蛋白质的结构特征。结果表明,该基因定位于玉米第7#染色体上,全长基因含有6个外显子和7个内含子,519 bp的开放阅读框,编码172个氨基酸,分子量约为19.78 k Da,等电点为4.78。采用maize GDB数据库对玉米整个生命周期的表达水平进行分析表明,细胞分裂旺盛的部位,Zmcen基因的表达量较高。对16种植物进行系统发育树分析显示,Zmcen基因与水稻、小麦、拟南芥等的centrin基因同源性高达80.21%,该结果为探索Zmcen蛋白的未知生物学功能提供了线索。     

家蚕化学感受蛋白CSP9的抗体制备及表达分析

为了制备家蚕CSP9的多克隆抗体，研究该蛋白在家蚕中的表达特征和功能。利用PCR扩增家蚕csp9基因，构建其原核表达载体，诱导CSP9蛋白表达并纯化。纯化后的CSP9蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体，Western杂交检测CSP9在家蚕中的表达特征。最终成功构建csp9/pET-28a原核表达载体，并纯化获得与预测分子量一致的CSP9蛋白；成功制备了CSP9多克隆抗体；Western杂交结果表明，CSP9在家蚕不同时期和不同组织中都有特异表达。本研究成功表达纯化并制备了家蚕CSP9多克隆抗体，分析了CSP9在家蚕中的表达特征，为后续该蛋白在家蚕中的功能和调控研究奠定了基础。