陆地棉原生质体培养与植株再生技术研究

 分离培养陆地棉品种ZDM-3（Gossypium hirsutum L cv ZDM-3）胚性细胞悬浮系的原生质体，通过体细胞胚胎发生成功获得再生植株。试验结果表明，植物生长调节剂组合和碳源对原生质体培养具有重要的影响，添加2，4-D + KT + 1.5%（W/V）葡萄糖+ 1.5%（W/V）麦芽糖的KM8P培养基对于陆地棉原生质体培养的效果较好。激素组合0.46 μmol·L^-1 KT + 0.45 μmol·L^-1  2，4-D诱导的愈伤组织较松软，分化潜力高；胚性愈伤组织的增殖使用0.93 μmol·L^-1 KT + 2.46 μmol·L^-1 IBA的激素组合；1.2 μmol·L^-1 IBA + 1.39 μmol·L^-1 KT有利于体细胞胚胎发生，而MSB-5 + 0.67 μmol·L^-1 KT+2.69 μmol·L^-1 NAA的培养基适合体细胞胚胎萌发和植株再生。此外，愈伤组织诱导宜用葡萄糖作为碳源，而胚性愈伤组织增殖、保存和胚状体的萌发过程宜使用麦芽糖作碳源。     

大丽轮枝菌拮抗细菌B.subtilis LZ2-70产芽孢条件优化

 为了提高大丽轮枝菌（Verticillium dahilae Kleb.）拮抗细菌枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis LZ2-70菌株的芽孢形成率及芽孢数量，在摇瓶发酵基础上对影响该菌芽孢形成的主要因素进行了考察。通过单因素试验确定了最佳的碳源、氮源和无机盐等，通过正交试验研究了培养基最佳浓度和组合，以及种龄、接种量、培养液初始pH和培养时间等发酵条件。摇瓶发酵生产芽孢的最佳条件为:0.5% 麦芽糖、2% 黄豆饼粉、0.05% KH₂PO₄和0.1% MnSO₄·H₂O、培养液初始pH值8.0、种龄24 h、装瓶量30 mL/ 250 mL 、接种量10%、发酵时间48 h、培养温度为30 ℃、摇床转速为200 r·min^-1。在此优化条件下，发酵液中LZ2-70菌株的芽孢数量达到6.6×10⁹ 个·mL^-1，芽孢形成率为98.94%。     

蝉蜕诱导对球孢白僵菌生物学特性及其毒力影响的研究

利用改良蝉蜕诱导培养基对球孢白僵菌进行诱导，以无蝉蜕PDA培养基作为对照，目的是比较蝉蜕诱导后球孢白僵菌菌株的生长速率、产孢量、孢子萌发率等多个生物学指标，及二者对3龄亚洲玉米螟幼虫的毒力。经蝉蜕诱导的球孢白僵菌菌株的产孢量、孢子萌发率以及对玉米螟幼虫毒力都高于对照组，且差异显著，对玉米螟幼虫毒力处理组LT₅₀为4.73天，对照组需要6.97天。同时经蝉蜕诱导过的菌株开始产孢时间和胞外蛋白酶活性都优于对照组，胞外蛋白酶活性的变化范围是1.497×10^-2~3.538×10^-2 IU/mL，但经诱导菌株的生长速率低于处理组。鉴于球孢白僵菌菌株经蝉蜕诱导后，其产孢量和孢子萌发率增加，并且能够增强对玉米螟幼虫毒力，可利用其进行球孢白僵菌菌种保存和改良。

     

一个棉花黄萎病抗菌肽基因25a2的克隆与表达

 将棉花黄萎病抗菌肽A2的N端15个氨基酸序列在NCBI进行同源序列比较，根据同源蛋白的DNA序列设计引物，以解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）RS-25菌株基因组为模板，应用PCR扩增出一条约300 bp的DNA片段。序列分析表明，DNA片段长354 bp，编码117个氨基酸，将该基因命名为25a2。构建表达载体pET-28a-25a2，转化大肠杆菌（Eschrichia coli）BL21，37℃培养，应用终浓度为1 mmol·L^-1的IPTG诱导，表达产物经SDS PAGE分析，得到分子量约15 kDa表达蛋白条带，与理论蛋白分子量相符。     

大丽轮枝菌菌体对链霉菌胞外蛋白酶活性及抑菌效果的影响

 为研究拮抗链霉菌对棉花黄萎病原大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb.）的抑菌机理，以大丽轮枝菌菌体为唯一碳氮能源，采用液体培养法及生长速率法研究供试病原菌菌体对4株拮抗链霉菌胞外蛋白酶合成的诱导作用及抑菌活性物质产生的影响。结果表明：大丽轮枝菌菌体可以诱导供试链霉菌合成蛋白酶；诱导粗酶液对病原真菌菌丝有溶解作用；当菌体添加量为10 g·L^-1，28℃培养7 d时菌株Z13蛋白酶活性高达4.24 U；以大丽轮枝菌菌体为碳氮能源时供试链霉菌能产生活性较强的抑菌物质；当菌体添加量为20 g·L^-1，发酵液稀释5倍时菌株B49所产抑菌活性物质的最大抑菌率达95.7%。     

食用菌分子转化研究状况

遗传育种是提高食用菌产量和质量的有效途径之一。传统的遗传育种方法周期长、见效慢，现代分子转化技术则提供了一种更为高效快捷的育种方式。最早报道的食用菌转化是1991年Challen等利用PEG法把外源DNA导人双孢蘑菇的原生质体中，获得转化子；随后又相继报道了几例食用菌如双孢蘑菇、平菇、草菇、杨树菇和香菇的转化试验。但至今尚未建立起有效的食用菌转化系统。目前在食用菌的转化研究中存在的问题主要有：（1）假阳性菌落的干扰；（2）外源DNA整合率不高；（3）外源基因整合后表达率不高；（4）转化子不稳定。其中影响转化的主要因素是低整合率和低表达率。遗传育种是提高食用菌产量和质量的有效途径之一。传统的遗传育种方法周期长、见效慢，现代分子转化技术则提供了一种更为高效快捷的育种方式。最早报道的食用菌转化是1991年Challen等利用PEG法把外源DNA导人双孢蘑菇的原生质体中，获得转化子；随后又相继报道了几例食用菌如双孢蘑菇、平菇、草菇、杨树菇和香菇的转化试验。但至今尚未建立起有效的食用菌转化系统。目前在食用菌的转化研究中存在的问题主要有：（1）假阳性菌落的干扰；（2）外源DNA整合率不高；（3）外源基因整合后表达率不高；（4）转化子不稳定。其中影响转化的主要因素是低整合率和低表达率。遗传工作者围绕如何提高整合率和表达率，不断改进转化方法、转化材料、标记基因、启动子，以期提高转化率，建立一个完善的转化体系。现就筛选标记、启动子、转化方法、整合方式及将来研究方向等方面，用具体的研究实验分析食用菌转化工作现状、取得的成绩和存在的问题。     

GFP标记的马铃薯大丽轮枝菌生物学特性研究

为了研究马铃薯黄萎病菌的侵染机制,将绿色荧光蛋白基因(GFP)通过农杆菌介导的遗传转化方法转入马铃薯黄萎病菌VD012中,经过潮霉素选择性培养基的筛选和分子鉴定,获得了47株有绿色荧光信号的阳性转化子。随机挑取8株阳性转化子,以野生型菌株为对照,对转化子的菌落形态、菌丝的生长速率、产孢量、粗毒素含量和致病力进行了研究。结果表明,8株阳性转化子中有3株微菌核产生的数量明显高于野生型,1株转化子微菌核产生量低于野生型菌株;各阳性转化子的生长速率和野生型菌株差异不显著;阳性转化子的产孢量与对照相比,有2株差异不显著。其余均有不同程度的降低。保湿培养8 h,所有阳性转化子的平均萌发率低于野生型菌株。相比对照,粗毒素的含量表现为升高趋势的转化子有7株,1株表现为下降趋势。致病力测定的结果表明,致病力增强的转化子有1株,2株转化子的致病力呈现降低的趋势。     

一株脉孢菌的鉴定及其挥发性物质GC-MS分析

脉孢菌（Neurospora spp．）是常见的霉菌，有气味，为了研究脉孢菌气味挥发性物质的化学组分，采用18SrDNA序列分析对脉孢菌菌株FH．1进行鉴定，并采用气质联用45L（GC．MS）对其挥发性物质组分进行分析。结果表明：脉孢菌菌株FH—1的18SrDNA序列（登录号：KF312458）与粗糙脉孢菌（N.crglSSgt）（登录号：AY046271．1）相似度为99％，被鉴定为粗糙脉孢菌；GC—MS）LFH-1挥发性物质中分离到13个组分，鉴定了其中的9个组分，占挥发性物质总量的93．035％；挥发性物质主要由酯类和醇类组成，含量最高的组分为1-辛烯-3-醇，其相对含量为80．663％。     

山东滨海盐渍棉田盐分和养分特征及对棉花出苗的影响

 在黄河三角洲6个县区随机选择318块盐渍棉田，对0～20 cm土层盐分、有机质和主要养分含量分析表明，轻度（含盐量<2.5 g·kg^-1）、中度（2.5～4.49 g·kg^-1）和重度（>4.5 g·kg^-1）盐碱地所占的比例分别为44.3%、40.6%和15.1%。中度盐碱地N、P、K含量皆中等偏下，轻度盐碱地则是钾含量偏低；种植年限短的重度盐碱地有机质含量很低，碱解氮和有效磷含量严重不足，但含钾量高；种植年限较长的重度盐碱地有机质、碱解氮和有效磷的含量中等，但速效钾较低。滨海盐碱棉田土壤含盐量（y）和土壤溶液（水：土=5：1）电导率（x）回归方程为y=3.4058x + 0.1427（n=27，R²=0.9964^**）。当土壤含盐2 g·kg^-1 以下时，棉花基本能正常出苗、成苗；当含盐2～3 g·kg^-1时，只有60％～78%的种子可以出苗，45％～55%的种子能够成苗；含盐超过 4 g·kg^-1时，出苗率40%左右，成苗率不足30%。根据滨海盐碱地的盐分和养分特征，采取合理的成苗技术和施肥技术是实现棉花高产的保证。     

链格孢菌蛋白激发子对棉花主要性状及相关酶变化的研究

 研究了链格孢菌蛋白激发子粗提蛋白液对棉花主要性状及相关酶变化的影响。结果表明，链格孢菌蛋白激发子诱导后，显著提高了棉花成铃数且不同程度提高了株高、铃重、衣指、子指和衣分，降低了铃壳重，促进棉花早熟，获得了较好的产量。以浸种处理的子、皮棉产量最高，分别达到3800.6 kg·hm^-2、1598.2 kg·hm^-2，比对照提高了22.15%、26.11%；从纤维品质来看，适时适度喷施棉株，纤维各个指标得到了明显的改善，尤以浸种＋现蕾期喷雾处理的综合值最高，比对照提高了6.1%；从生理生化活性来分析，链格孢菌蛋白激发子诱导后POD、NR、SOD活性及MDA含量均有不同程度的变化，POD、NR及SOD活性增强，而MDH活性降低。在此基础上对链格孢菌蛋白激发子诱导棉株生长及提高棉纤维品种的可能机制作了\{探讨。     

我国棉枯萎镰刀菌小种间的营养体亲和性

采用不能还原利用硝酸盐作唯一氮源生长的突变体(nit突变体),对我国棉枯萎镰刀菌的3、7、8号小种的61个菌株作了营养亲和性研究。结果表明,第3号小种7个菌株和第7号小种42个菌株各属一个不同的营养体亲和群,第8号小种的8个菌株则属6个不同亲和群,不同小种的菌株间没有亲和性。营养体亲和性试验结果与致病性测定结果吻合,能从遗传学角度区分棉枯萎菌不同小种,用它作为鉴定手段,结果更能反映出不同菌系间的本质联系,并可克服致病力测定工作中费时、费力及结果不稳定等缺点。     

一步双重PCR检测香蕉枯萎病菌

摘要：通过设计尖孢镰刀菌ITS区特异引物PR1/PR2和SCAR特异引物ST1/ST2，优化检测体系中反应参数，建立了双重PCR检测香蕉枯萎病菌1号生理小种和4号生理小种的方法。结果表明：引物PR1/PR2和ST1/ST2能明确鉴别香蕉枯萎病菌1号生理小种和4号生理小种，检测体系的最佳退火温度为56 ℃，检测灵敏度的最低起始DNA为20 ng。     

不同寄主尖孢镰刀菌培养滤液对黄瓜胚根萌发的影响

对不同寄主尖孢镰刀菌培养滤液对黄瓜胚根萌发进行了测定，结果表明，番茄（179，F-F.1.5-031017，番茄，福州福清）上分离的尖孢镰刀菌的发酵液处理的黄瓜种子的胚根重量最低，平均重量为85.00 mg/10粒，黄瓜（120，F-H.6.5-030318-J4，黄瓜，漳州诏安）上分离的尖孢镰刀菌发酵液处理的黄瓜种子的胚根重量最高，平均为183.33 mg/10粒。不同寄主发酵滤液对黄瓜胚根重量的影响大致可以分为3类：第一类为甜瓜（128，F-T.1.7-030514-03，甜瓜，福州永泰）、番茄（179，F-F.1.5-031017，福州福清）和班兜（107，F-B.1.1-030221，福州建新），第二类为西瓜（134，F-X.1.7-030320-03，西瓜，福州永泰）和网纹甜瓜（144，F-T2.1.1-030616-01，网纹甜瓜，福州义序），第三类为黄瓜（120，F-H.6.5-030318-J4，黄瓜，漳州诏安）。     

蒿属植物提取物对棉花枯萎病菌和红腐病菌的抑制活性研究

在实验条件下，采用菌丝生长速率测定法，以棉花枯萎病菌、棉红腐病菌为供试菌，对茵陈、黄蒿、艾蒿等3种蒿属植物提取物的抗菌活性进行了研究。结果表明，供试3种蒿属植物提取物对棉花枯萎病菌和棉花红腐病菌均具有较好的抗菌活性，其中尤以艾蒿提取物的抗菌活性强而稳定，48~96h对上述两病菌的菌丝抑制率均达80%以上；丙酮提取物的抗菌活性强于乙醇提取物，前者的EC50为1.4785 mg/L ，后者的为3.2090 mg/L。间歇振荡法、超声波法、冷浸法提取物对供试菌的72h菌丝抑制率分别为84.34% 、84.56%、88.7% ，可见同种溶剂不同提取方法所得提取物抗菌活性基本一致。     

尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum Schl.）的生长特性

【研究目的】研究尖孢镰刀菌的生长特性，寻找培养过程的异质性指标。【方法】供试菌株为黄瓜尖孢镰刀菌F-H.6.5-030318-J2和花生尖孢镰刀菌F-P.5.0-030710，培养基采用PSA培养基，装液量为100ml/250ml，接菌量从培养7d的平板上打取3个6mm的菌片，培养温度为25±1℃，摇床转速为110r/min，培养10d，观察测定发酵液颜色、OD值、pH值、菌丝干重变化，并利用聚类分析方法划分生长阶段。【结果】在培养过程中，尖孢镰刀菌发酵液的颜色、OD值、pH值和菌丝干重都会随着培养时间而变化。在相同的培养条件下，来源于不同寄主的尖孢镰刀菌菌株之间在颜色和OD值变化存在着显著性差异，而pH值和菌丝干重变化未表现出显著性差异。来自黄瓜和花生的尖孢镰刀菌菌株的生长分为3个阶段：1~2d为适应阶段，3~5d为对数生长阶段，6~10d为稳定阶段。【结论】尖孢镰刀菌在培养过程的色素变异和OD值的变化可作为菌株培养的表征性特征     

核黄素对棉花枯萎病菌生长影响的研究

探讨不同浓度核黄素对棉花枯萎菌生长的影响,找出影响枯萎菌生长的最佳浓度。采用PDA培养基中加入不同浓度的核黄素,观察棉花枯萎病菌菌丝、菌落及孢子的生长变化。结果表明:菌丝生长、菌落形态及孢子形态均有不同程度变化,当核黄素浓度大于0.5mg/mL的核黄素能明显抑制菌丝生长,而且抑制效果随着处理浓度的增大而增强;当核黄素浓度大于1mg/mL的核黄素处理可诱导初生菌丝发生肿胀,分枝增多且菌体分隔增加及体细胞发生畸形等形态变化;当核黄素浓度大于1mg/mL时,孢子发生畸形。利用核黄素可以抑制棉花枯萎病病菌的生长,对开拓植物病害新的防治方法有一定的参考价值。     

珠海香蕉枯萎病菌遗传多样性的AFLP分析

为了解广东省珠海地区香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporumf.sp.cubense)的种群分化和遗传变异规律,采用AFLP技术对来自珠海、湛江、台山的20株尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)进行DNA指纹分析,以1株分离自粉蕉的木贼镰刀菌(F.equiseti)为外参。20株尖孢镰刀菌中17株来自珠海,包括3株非致菌、2株香蕉枯萎病1号生理小种、12株香蕉枯萎病4号生理小种,2株来自湛江的为香蕉枯萎病4号生理小种,1株来自台山的为香蕉枯萎病1号生理小种。8对AFLP引物对供试菌株扩增出253条带,其中多态性带97条,占总带数的38.34%,供试菌株的遗传距离变化在0.21~0.99,平均为0.85。利用NTSYSpc软件中的UPGMA算法构建了21株镰刀菌的AFLP亲缘树状图,聚类结果表明:供试菌株被聚为3个大的类群,分别为1号生理小种、4号生理小种以及非致病性尖孢镰刀菌。亲缘关系分析结果表明:1号生理小种内菌株间的遗传分化大于4号生理小种,其聚类结果与菌株的地理来源有一定的相关性。总体而言,珠海地区香蕉枯萎病菌的遗传多样性较为丰富。     

香蕉枯萎病病原菌海藻糖合成酶基因tps1

为了解tps1基因在尖镰刀菌古巴专化型生理小种1号和生理小种4号之间及与其他镰刀菌之间的差异，分析推测tps1基因与两生理小种之间的寄主选择性差异的关系，通过比对现有镰刀菌属的海藻糖合成酶基因序列，参照尖孢镰刀菌番茄专化型的tps1基因序列设计并合成引物，采用PCR和RT-PCR方法扩增了两个生理小种的tps1基因并测序进行比较分析，同时对香蕉与粉蕉苗诱导两个生理小种后的tps1基因表达量变化进行分析。结果表明，两个生理小种tps1基因全长均为1660 bp，开放阅读框均为1605 bp，编码535个氨基酸，基因序列间仅存在两个碱基位点的差异，编码蛋白间无差异；两生理小种的tps1基因序列与镰刀菌属其他种间存在较大的差异，经寄主诱导后的两个生理小种的tps1基因表达量呈现不同的变化。从tps1基因序列及其编码蛋白的氨基酸序列在两生理小种之间的差异性分析结果推测，两个生理小种寄主选择性差异与tps1基因并无明显对应关系，这为进一步研究tps1基因与病菌在无寄主下的长期生存的关系奠定了基础。     

棉花根部拮抗枯萎病菌或黄萎病菌的可培养内生细菌多样性分析

为解析棉花内生细菌的种群结构,更好地开发利用生防内生细菌,以棉花枯萎病菌、黄萎病菌为指示病原真菌,对常抗棉和泗棉3号根部分离获得的内生细菌进行拮抗活性筛选,获得87株至少对其中1个指示病原真菌具有拮抗作用的内生细菌。ARDRA分析(Amplified ribosomal DNA restriction analysis)和16S r DNA序列测定表明棉花根部可培养内生拮抗细菌可分为13个ARDRA类群,分属于芽孢杆菌属(Bacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、农杆菌属(Agrobacterium)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、不动杆菌属(Acinetobacter)和假单孢菌属(Pseudomonas)7个属。其中常抗棉根部内生拮抗细菌分属于芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属、伯克霍尔德氏菌属和农杆菌属,而泗棉3号根部内生拮抗细菌则分属于芽孢杆菌属、伯克霍尔德氏菌属、中华根瘤菌属、不动杆菌属和假单孢菌属,二者的优势种群都是芽孢杆菌属细菌。BOX-PCR分析显示这些内生拮抗细菌具有丰富的遗传多样性。通过测定这些内生拮抗细菌对棉花黄萎病菌和棉花枯萎病菌的拮抗力大小,以及是否具有产纤维素酶、几丁质酶、蛋白酶和嗜铁素的活性,表明这些内生拮抗细菌具有不同的生防作用机制。     

枯草芽孢杆菌BSD-2的GFP标记及其在黄瓜上的定殖研究

为研究枯草芽孢杆菌BSD-2在黄瓜植株上的定殖情况,采用稍加改进的电击转化方法将含有GFP基因的p GFP4412质粒导入枯草芽孢杆菌BSD-2菌株中,并测定了其生长曲线、质粒遗传稳定性及其对枯萎病菌和灰霉病菌的抑制作用。结果表明,成功获得具有绿色荧光的菌株BSD-2-GFP;标记菌株的生长趋势与野生型菌株基本一致;在无选择压力条件下连续培养56 h,菌株BSD-2-GFP的遗传稳定性为86%;其对植物枯萎病菌和灰霉病菌具有很强的抑制作用,与野生型菌株相当。通过荧光显微镜观察发现,标记菌株处理24 h后即可在黄瓜根内部发现,5 d后可在叶脉发现,且50 d后仍可在叶脉观测到。结果表明,菌株BSD-2-GFP可以很好地在黄瓜体内定殖,从而阻止病原菌的侵入。