甘蔗野生种质资源抗褐锈病基因Bru1的分子检测

在甘蔗栽培品种‘R570’上发现和定位的甘蔗抗褐锈病主效基因Bru1对世界上不同国家和不同地区的黑顶柄锈菌具有广谱抗性。针对该基因开发的两个分子标记能有效、稳定地检测和筛选含有该基因的种质资源。为筛选甘蔗野生种抗源种质,利用R12H16和9O20-F4两个标记对云南农业大学甘蔗种质资源圃保存的部分野生种质资源进行抗褐锈病基因Bru1的分子检测,包括割手密96份、蔗茅15份、滇蔗茅1份、斑茅11份、河八王4份、金茅2份、五节芒9份,共计138份。结果表明,有7份割手密含抗褐锈病基因Bru1,占参试材料的5.1%。本研究为甘蔗的转基因育种和抗褐锈病杂交育种提供优良抗源材料,为进一步开展甘蔗育种研究提供了科学依据。     

甘蔗(Saccharum species hybrid)种质资源褐锈病和黄锈病抗性位点分子检测

开展种质资源抗锈病分子检测,对甘蔗筛选抗性资源和抗锈病育种具有重要意义。本研究利用已报道的褐锈病抗性位点Bru1和黄锈病抗性位点G1对中国甘蔗育种中的亲本资源和创新材料进行分析。在164份材料中共检测到‘粤糖07-913’、‘桂糖02-281’、‘赣南05-352’等23份带有Bru1抗性标记的材料,占参试材料的14%。在180份材料中共检测到‘粤糖96-86’、‘桂糖03-8’、‘赣南81-1035’等10份带有黄锈病抗性位点G1的材料,占参试材料的5.56%。‘粤糖96-86’、‘ROC16’、‘ROC22’等6份材料同时带有Bru1和G1位点,可能兼具褐锈病和黄锈病两种抗性。本研究结果可为选择优异抗锈病基因资源,开展杂交育种提供科学依据。     

海南甘蔗野生种资源的收集与遗传多样性初析

为了进一步丰富中国甘蔗野生资源库,充分了解和发掘具有良好品性的野生材料,对海南省海口、澄迈、临高、儋州、白沙等16个县（市）的甘蔗野生种质资源进行了采集,共采集白茅8份、斑茅39份、荻7份、割手密26份、芒14份（其中五节芒4份）,涉及5个属6个种,共94份。测定株高、茎粗、锤度、叶长和叶宽5个主要农艺性状,并对斑茅和割手密进行了相关性和遗传多样性分析。初步研究表明,海南甘蔗野生种资源性状差异显著,株高、茎粗、叶长和叶宽存在较大相关性,而锤度与其他指标不相关;斑茅和割手密具有较大的遗传多样性,变异系数分别为0.187~0.558及0.206~0.432;斑茅和割手密分别分为四类群和三类群,其中斑茅Ⅱ和Ⅳ类群具有较大的生物量,而割手密Ⅰ和Ⅲ类群具有良好的锤度品质潜力,可推荐作为甘蔗育种的上游材料。     

基于ISSR标记的割手密种质资源遗传多样性分析

割手密(Saccharum spontaneum L.)是甘蔗栽培品种的原始亲本之一,当前仍是甘蔗遗传改良的重要种质资源,为了对割手密的遗传多样性进行鉴定,本研究运用ISSR分子标记的方法,测定了24份割手密的遗传多样性,结果表明:14个ISSR引物共扩增出227条带,其中多态性条带为224条,多态性百分率为98.67%;24份材料的Nei指数(h)介于0.27~0.94,遗传相似系数集中在0.3~0.5之间;基于UPGMA聚类分析,在遗传距离0.70处,可以将24个材料分成4个类群;说明割手密有着相对丰富的遗传多样性,能够广泛用于甘蔗的遗传育种改良。     

广东割手密SSR遗传多样性分析

割手密是甘蔗近缘野生种之一,在甘蔗育种中具有重要地位和作用。本研究采用Genomic-SSR和EST-SSR两种类型分子标记对来自广东各个地区的67个割手密种质进行分析。在20对SSR引物上共检测到341个多态性条带,每个引物上的平均多态性为17.05,其中11个Genomic-SSR的平均多态性为20.82,9个EST-SSR的平均多态性为12.44。广东割手密在Genomic-SSR上的多态性显著高于EST-SSR上的多态性。MantelTest分析表明:通过Genomic-SSR、EST-SSR以及Genomic-SSR+EST-SSR三种方法所计算的试验材料的遗传距离矩阵之间都呈极显著相关(p<0.01),说明应用两种类型SSR获得的各个材料间的遗传关系具有较高的一致性。广东割手密在20对SSR引物上的遗传多样性指数介于0.1064~0.2916之间,平均多样性指数为0.1943;各个材料间的遗传距离为0.0063~0.3082之间,平均为0.1935。UPGMA聚类分析表明:广东割手密之间的遗传关系和地理来源存在一定的相关,由南向北存在较为显著的地理分化。     

甘蔗PIN-LIKES基因家族的鉴定与表达分析

PILS (PIN-LIKES)是一类新发现的生长素输出载体,协助生长素的极性运输。本研究立足甘蔗割手密基因组和栽培品种转录组数据,利用生物信息学分析技术,分别在割手密和栽培品种中鉴定到11个PILS(Saccharum spontaneum PIN-LIKES, SsPILS)基因和4个PILS (Saccharum spp. hybrid PIN-LIKES, ScPILS)基因。结果表明, 11个SsPILS基因家族成员分布于6条染色体上,基因内含子数量介于5～11个。系统进化树分析发现,割手密PILS与水稻PILS有较高同源性,归属于3个不同的系统发育分支。转录组数据分析显示, SsPILS1c的同源基因ScPILS1c在受高粱花叶病毒和黑穗病菌胁迫甘蔗栽培种中差异表达。通过RT-PCR扩增技术,克隆获得ScPILS1c基因序列(NCBI accession number:OM258732)。该基因全长cDNA为1332 bp,包含一个1233 bp的完整开放阅读框,编码410个氨基酸,理论等电点(pI)为6.17,不稳定系数为39.31,平均疏水性值为0.689,预测ScPI...     

基于SSR标记的不同染色体数目割手密资源遗传多样性分析

甘蔗野生种割手密抗逆性强,是一种重要的甘蔗种质资源。本研究用23对简单重复序列标记(SSR)引物及优化后的降落PCR体系,对采自中国、缅甸、尼泊尔、印度4国不同地区的100份割手密材料(染色体数目2n=40~106),进行了遗传多样性分析。结果表明供试材料均显示出良好的多态性:共扩增出937条带,其中有920条多态性标记,多态率达97.77%,多态信息量(PIC)为89.87%;供试材料的遗传相似性系数在0.41~0.94之间,平均为0.68。经UPGMA聚类将供试材料划分为4个类群10个亚类,其聚类方式呈现出明显的区域性,群体可分为高海拔地区割手密(云南,贵州,四川,西藏,尼泊尔)、低海拔沿海地区割手密(福建,广东,海南)、缅甸地区割手密,并对割手密的染色体数、分布范围和亲缘关系进行了讨论。     

应用降落PCR和正交设计优化甘蔗“割手密”SSR-PCR反应体系

甘蔗野生种割手密抗逆性强,在甘蔗抗逆育种中具有较好的应用前景;割手密SSR分子标记技术体系的建立及优化可为割手密指纹图谱绘制、种质鉴定、遗传多样性及亲缘关系分析提供技术支持。本研究以21份割手密材料用改良CTAB法提取DNA,采用降落PCR和正交试验设计对扩增反应体系主要成分的浓度(DNA模板,引物,Mg2+,d NTPs,Taq聚合酶)进行了优化。结果表明建立的割手密Touchdown SSR-PCR分子标记技术体系操作简便,扩增条带清晰且多态性丰富,有较强的稳定性和可重复性,可为割手密资源的相关研究提供技术支持。     

甘蔗复合体种质资源野生种的组织培养比较研究

本文比较了割手密、斑茅、蔗茅、五节芒、河八王等甘蔗种质资源野生种的幼叶组织培养条件, 首次建立了五节芒和河八王的组织培养体系。结果表明, 不同的野生种在愈伤组织诱导率、继代培养再分化能力及再生苗分化率方面均表现出不同, 说明甘蔗近缘野生种间在生理和遗传上存在着对培养条件反应的差异, 不同的资源材料要选择各自适合的培养体系。     

甘蔗割手密种糖转运蛋白基因SsSWEET11的克隆与功能分析

SWEET蛋白通过调控植物体内糖分的运输、分配、转化和贮藏,广泛参与植物生长发育及响应病原菌胁迫的生理生化过程。为揭示SWEET基因在甘蔗生长发育及其与赤条病菌互作中的生物学功能,本研究基于甘蔗割手密种全长转录组文库和比较基因组学,根据注释SsSWEET11基因序列设计特异引物,利用RT-PCR技术从甘蔗割手密种cDNA文库中扩增该基因的全长序列,运用多种生物信息工具分析其特征,构建系统进化树;采用不同组织和抗、感赤条病的甘蔗品种分析SsSWEET11的表达模式;利用瞬时表达和亚细胞定位分析SsSWEET11的功能。结果表明,从甘蔗割手密种克隆获得SsSWEET11基因(登录号为OP554214),该基因全长927bp,编码308个氨基酸残基,具有2个MtN3＿saliva结构域和7次跨膜结构域。系统进化树分析显示,SsSWEET11属于SWEET蛋白家族第Ⅲ亚家族成员,与高粱SbSWEET11相似性高达97.41%。qRT-PCR分析表明, ShSWEET11基因在不同组织中组成型表达,在蔗叶和根中表达量显著高于其他组织;赤条病菌胁迫下,ScSWEET11基因在抗病品种ROC22和感...     

甘蔗种质遗传基础的AFLP分析

采用AFLP分子标记技术对54份甘蔗种质（14份祖亲种、40份栽培品种或品系）的遗传基础进行了分析。利用筛选出的4对多态性较强的引物组合（M+CAG/E+ACG,M+CTC/E+ACT,M+CTG/E+ACC,M+CTG/E+ACG）,构建了甘蔗54份种质的AFLP指纹图谱,这4对引物组合共扩增出396条谱带,其中多态带390条,占98.5%。54份种质的遗传相似系数变化     

甘蔗β-胡萝卜素异构酶基因家族的鉴定、定位和表达分析

独脚金内酯(strigolactones, SLs)是一种广泛存在、能够抑制植物分蘖或分枝的植物激素。β-胡萝卜素异构酶(D27)是SLs合成中的关键酶,但是目前关于甘蔗D27基因家族的鉴定与分析鲜有报道。本研究通过挖掘甘蔗原始亲本之一的割手密种基因组数据鉴定了5个割手密种D27基因家族成员。系统进化树分析发现,割手密种D27s分处在3个不同系统发育分支,与高粱D27s高度同源。保守结构域预测揭示,割手密种D27s包含β-胡萝卜素异构酶的典型结构域Pfam:DUF4033。顺式元件分析结果显示,割手密种D27s主要参与调控激素和胁迫响应,以及植物生长发育等。基于甘蔗栽培种转录组数据分析发现,甘蔗割手密种D27基因家族成员(Sspon.06G0012830-1A)的同源基因同时参与甘蔗分蘖调控及黑穗病菌胁迫响应。在此基础上,我们克隆获得了甘蔗栽培种ROC22中的同源基因cDNA序列,命名为ScD27.1 (GenBank登录号为MT499895)。生物信息学分析结果显示, ScD27.1编码266个氨基酸,其蛋白等电点为8.91,分子量为30.00 kD,是不稳定蛋白且定位于叶绿体。二级结构主要包括α-螺旋和无规则卷曲,具有叶绿体转运肽,包含4个泛素化位点和18个磷酸化位点。qRT-PCR表达分析表明,ScD27.1基因受ABA及H2O2显著诱导表达,但对MeJA、SA胁迫响应不明显。亚细胞定位结果显示, ScD27.1蛋白可能定位于细胞膜和叶绿体,参与细胞内膜泡运输或由液泡前体、胞内运输小泡分拣运输。以上研究表明, ScD27.1基因可能参与黑穗病菌侵染诱导的甘蔗分蘖及ABA和H2O2相关信号通路。本研究为了解甘蔗ScD27.1蛋白在胞内运输和分蘖中的作用及其参与甘蔗-黑穗病菌互作提供一定的基础理论。     

基于甘蔗热带种(LA-purple)全基因组序列的SSR开发及特征分析

现代甘蔗栽培品种(2n = 100~130)是由甘蔗热带种(2n = 80)与割手密(2n = 40~128)种间杂交而来, 形成异源多倍体、非整倍体作物, 使得甘蔗栽培品种中80%~90%的染色体来源于热带种。开发热带种基因组SSR分子标记, 有助于甘蔗遗传多样性分析、分子标记辅助选择、遗传图谱的构建等。本研究基于热带种LA-purple的全基因组测序数据的255 398个预测基因序列(累计总长为1 029 222 285 bp), 利用Perl程序与生物信息学软件结合, 发掘SSR位点, 获得了153 150个SSR位点, 平均每1.67个基因有1个SSR位点, 其中二、三核苷酸重复基序分别为39 556个和50 072个, 占总SSR位点数的58.5%。在二核苷酸重复基序中, TA/AT所占比例最高, 占41.4%, CG/GC所占比例最低, 占4.6%; 在三核苷酸碱基重复基序中, TGT/ACA所占比例最高, 为15.6%。在TA/AT重复类型中选取100个基序重复次数在60~90之间的SSR位点, 进行引物设计与合成, 在12个甘蔗属材料中进行PCR扩增分析, 从中筛选出52对具有多态性SSR引物, 其中有27对引物在研究的2个甘蔗栽培品种间表现为多态。这些基因组SSR标记的开发, 不仅可以用于甘蔗栽培品种DNA指纹图谱分析, 而且为甘蔗属不同种的遗传图谱构建、遗传多样性分析和重要性状的遗传机制解析奠定基础, 为甘蔗分子育种研究提供重要支撑。     

Survey of the Bru1 gene for brown rust resistance in Brazilian local and basic sugarcane germplasm

Bru1 is currently the major gene conferring brown rust resistance in sugarcane, and diagnostic markers are available. A survey for the presence of this gene was conducted on 391 genotypes including Brazilian cultivars, clones and basic germplasm. The efficiency of these markers for identifying resistant cultivars and artificially inoculated basic germplasm was also evaluated. The Bru1 frequency among cultivars (73.5%) suggests this gene is the prevalent source of brown rust resistance in Brazilian sugarcane breeding programmes. Most of the cultivars known to be resistant were positive for Bru1, although other genes for resistance could be present in lines not having Bru1. Only 17.8% of the basic germplasm accessions were positive for the Bru1 gene, and a low correlation between Bru1 diagnostic markers and brown rust severity was observed for basic germplasm accessions. Overall, Bru1 diagnostic markers proved to be efficient identifying resistant cultivars and clones and have potential to be in screening brown rust resistance in Brazilian breeding programmes.     

云南蔗区首次发现由屈恩柄锈菌引起的甘蔗黄锈病

为明确在国家甘蔗体系云南示范点甘蔗新品种上发生的锈病病原菌种类。采用田间症状观察,结合病原菌形态特征观察及分子生物学方法对20份锈病样品进行病原菌鉴定。鉴定结果表明：来源于云南勐海‘‘海引1号’’的4份甘蔗锈病样品属甘蔗黄锈病,病原菌为屈恩柄锈菌,其核苷酸序列与GenBank中登录的屈恩柄锈菌相应核苷酸序列（GenBank登录号：GU058021和GQ283004—GQ283009）同源性在99.9%以上,并在系统发育树中聚为一簇;来源于云南保山、临沧、勐海其他甘蔗新品种（系）的16份甘蔗锈病样品属甘蔗褐锈病,病原菌为黑顶柄锈菌,它们的核苷酸序列与GenBank中登录的黑顶柄锈菌相应核苷酸序列（GenBank登录号：EU164548,GU058001和JX036025）同源性在99.8%以上,在系统发育树中处于同一分枝。本研究首次在云南蔗区发现由屈恩柄锈菌引起的甘蔗黄锈病。     

Molecular insights into brown rust resistance and potential epidemic based on the <Emphasis Type="Italic">Bru</Emphasis>1 gene in sugarcane varieties and new elite clones

In most sugarcane cultivation areas, sugarcane brown rust (SBR), caused by Puccinia melanocephala, is an economically important fungal disease that leads to severe yield loss in susceptible cultivars. Bru1, which is the major dominant SBR resistance gene, has been widely used in the prediction of brown rust resistance in sugarcane. In this study, three panels of sugarcane germplasms, the major varieties approved over the past 10 years and new elite clones in the current national regional trial, together with one panel of Saccharum spontaneum, were employed in estimating the possibility of SBR epidemic and to assess the efficiency of 9O20-F4-HaeIII in eliminating false positives. Among the current top five varieties used as sucrose feedstock, accounting for more than 68.9% of the total cultivated area, all were highly resistant to SBR, although only three harboring Bru1. Two major varieties Yuetang60 and Guitang46 without harboring Bru1 were highly susceptible to SBR, together with highly susceptible Funong41, which need prudent promotion. Approximately 60.5% of the 38 new elite clones were Bru1 positive. Considering the susceptibility of Liucheng03-1137, which exhibits a strong promotion momentum, together with Funong41, Guitang46, Yuetang60, and Yunzhe06-47, four were favored by the enterprise due to their superior sucrose content and good stalk yield, despite their high susceptibility to SBR, and additional Yuetang93-159, one current top five varieties with declining resistance, which results in a potential risk for brown rust epidemic. Furthermore, low frequency of the wild germplasm of S. spontaneum from five different countries was Bru1 positive. In addition, a perfect molecular diagnostic result was observed in all modern sugarcane clones using two dominant markers, and HaeIII can prevent the occurrence of false positive results when the 9O20-F4 PCR products of S. spontaneum are digested by RsaI. The prevalent chewing cane Badila without Bru1 is highly resistant to SBR. Our results provide valuable information for the extension of sugarcane varieties and a batch of novel SBR resistance sources with superior comprehensive characters for crossbreeding, and for SBR-resistant gene pyramiding by crossing or through mining and using of new SBR-resistant genes.     

78份四川小麦育成品种(系)条锈病抗性鉴定与抗条锈病基因分子检测

四川省是小麦条锈菌新小种产生的重要地区之一,了解2016年以来四川小麦育成品种(系)对当前流行的条锈菌生理小种和致病类型的抗性水平以及明确其抗条锈病基因的分布状况,可为四川育种防控小麦抗条锈病和品种布局提供理论依据。本研究选择2个小种CYR32和CYR34对78份四川小麦育成品种(系)进行苗期鉴定,利用当前小麦条锈菌优势小种CYR32、CYR33、CYR34,以及贵22-14、贵农致病类群等混合菌进行成株期人工接种鉴定,并利用19个抗条锈病QTL和基因QYr.nwafu-4BL、Yr5、Yr10、Yr15、Yr17、Yr18、Yr26、Yr28、Yr29、Yr30、Yr36、Yr39、Yr41、Yr48、Yr65、Yr67、Yr78、Yr80和Yr81的分子标记对供试材料进行抗条锈病基因检测。结果表明,在78份供试材料的苗期鉴定中,对CYR32表现出抗性的有60份,占76.92%;对CYR34表现出抗性的有40份,占51.28%;同时对CYR32和CYR34表现抗性的有36份,占46.15%。78份小麦品种(系)在成株期均表现抗条锈病,其中绵麦835、蜀麦1743、蜀麦1829和蜀麦1868表现为免疫。苗期和成株期抗病性鉴定结果表明,成株期抗性材料有42份,占53.85%;全生育期抗性材料有36份,占46.15%。分子检测结果表明,可能携带QYr.nwafu-4BL、Yr15、Yr17、Yr18、Yr26、Yr28、Yr29、Yr30、Yr39、Yr41、Yr65、Yr67、Yr78、Yr80和Yr81的材料分别有5、5、45、2、30、5、30、39、3、2、22、8、23、6和24份。同时携带2~6个抗条锈病基因的聚合材料分别有24、22、11、14和3份,占94.87%。所有供试品种(系)均未检测到Yr5、Yr10、Yr36和Yr48,仅西科麦18未检测到上述19个抗条锈病基因,可能携带其他已知或新的条锈病抗性基因。本研究鉴定了78份四川小麦育成品种(系)对条锈病抗性水平整体较好,明确了其携带的抗条锈病基因,为利用其培育持久抗性小麦品种提供了科学依据。     

割手密SsWRKY1基因的克隆与表达分析

为了克隆割手密SsWRKY1基因,并对其生物信息学和表达模式进行分析。本研究通过转录组测序和RT-PCR方法相结合首次从割手密中克隆到一个WRKY基因,利用生物信息学工具对其进行分析,并利用荧光定量PCR分析其在干旱胁迫下的表达模式。从割手密中克隆到一个全长1083 bp编码360个氨基酸的WRKY转录因子的基因,含有一个WRKY基因保守结构域和一个Cx4-5Cx22-23HxH的锌指结构域,属于WRKY基因家族的第Ⅱ类成员,命名为SsWRKY1,GenBank登录号为MH687932。荧光定量分析表明,随着干旱胁迫时间的延长,其表达量呈持续上调的表达模式,说明该基因是干旱胁迫诱导型基因。SsWRKY1基因在割手密应答干旱胁迫等非生物胁迫中可能起重要的调控作用,为进一步研究割手密的抗旱机制和甘蔗抗旱新品种的选育提供了科学依据。     

Frequency and distribution of the brown rust resistance gene Bru1 and implications for the Louisiana sugarcane breeding programme

Brown rust, caused by the fungus Puccinia melanocephala, poses an increasing threat to sugarcane industries worldwide. Recently, markers R12H16 and 9020‐F4 were developed for a major resistance gene Bru1 that contributes to a significant proportion of brown rust resistance in multiple sugarcane industries. Marker‐assisted screening of Louisiana sugarcane germplasm showed a low frequency (4.3%, five out of 117 clones) of Bru1 among sugarcane cultivars and elite breeding clones. Likewise, among progeny of crosses involving wild/exotic germplasm, only 14 of 208 clones (6.7%) tested Bru1 positive. However, Bru1 frequency was higher (28.7%, 52 of 181 clones) in wild/exotic germplasm, which indicated that diverse genetic resources are available for Bru1 introgression. Commercial Bru1‐positive cultivar, ‘L 01‐299', was resistant to brown rust. However, Bru1‐positive cultivar, ‘L 10‐146’, was susceptible while Bru1‐negative cultivars, such as ‘L 99‐233’, showed resistance to brown rust. Bru1‐negative clones with brown rust resistance offer an opportunity to identify alternate sources of resistance, which can be pyramided with Bru1 for effective and durable resistance in sugarcane against the changing pathogen.