逆转录病毒载体介导的猪瘟病毒E2基因在真核细胞中表达及动物免疫试验初报

利用DNA重组技术将猪瘟病毒(CSFV)石门株囊膜蛋白E2基因插入逆转录病毒载体pBABE-puro中构建成重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E2,该重组逆转录病毒表达载体与pVSVg质粒经磷酸钙共转染法将其转入293GP细胞中包装逆转录病毒假病毒。用包装的假病毒感染SP2/0细胞,经嘌呤霉素筛选阳性细胞后进行流式细胞技术(FACS)分析,结果表明CSFVE2基因在SP2/0细胞膜上成功表达。将表达E2蛋白的SP2/0细胞腹腔免疫BALB/c小鼠,用流式细胞仪检测证明,成功诱导小鼠产生了抗E2蛋白的抗体。为下一步利用细胞免疫小鼠研制抗猪瘟病毒单克隆抗体打下基础。     

猪瘟病毒DNA疫苗的构建及动物免疫试验

利用DNA重组技术将猪瘟病毒（CSFV） C株E2囊膜蛋白全长基因克隆到真核表达载体pcDNA4.0的CMV启动子下游,采用磷酸钙转染法将重组质粒转入293T细胞,流式细胞仪(FACS)检测293T细胞瞬时表达了E2囊膜蛋白。将构建的重组质粒肌肉注射BALB/c小鼠,用流式细胞仪和酶联免疫吸附试验（ELISA）检测证明成功诱导小鼠产生了抗E2蛋白的抗体,为下一步利用DNA疫苗免疫小鼠研制抗猪瘟病毒单克隆抗体打下基础。     

猪瘟病毒E2基因的哺乳动物细胞表达

利用PCR技术扩增出猪瘟病毒主要结构蛋白E2基因的全序列,将其克隆到真核表达载体PEGPF-C1中,获得重组质粒PEGPF-E2,经PCR,酶切鉴定和序列分析证明目的基因的大小、插入位置和读码框完全正确。利用脂质体将阳性质粒PEGFP-E2转染入猪肾来源的细胞PK-15中,G418筛选出阳性的细胞克隆,通过PCR证明E2基因存在于筛选出的阳性细胞克隆中。利用荧光倒置显微观察阳性细胞发现有融合蛋白的表达,利用夹心ELISA猪瘟病毒抗原检测试剂盒检测证明表达的融合蛋白为猪瘟病毒E2基因编码蛋白。     

淀粉磷酸化酶原核表达及单克隆抗体的制备

旨在体外表达淀粉磷酸化酶,免疫小鼠制备单克隆抗体。用PCR扩增木薯淀粉磷酸化酶基因,将其克隆到原核表达载体(pET28a)中,经E.coli表达纯化淀粉磷酸化酶。用纯化的淀粉磷酸化酶蛋白免疫Babl/c小鼠,间接ELISA测定小鼠血清效价,取小鼠脾细胞与小鼠SP2/0细胞融合,制备能产生抗淀粉磷酸化酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并检测其亚型和抗体稳定性。重组质粒在E.coli中能高效表达淀粉磷酸化酶,免疫小鼠后取效价高的3#小鼠脾脏细胞和SP2/0细胞融合,共获得15株抗体效价均达到10~5以上,能稳定分泌抗淀粉磷酸化酶抗体的细胞株,与钙调蛋白、牛血清白蛋白无交叉反应,抗体亚型鉴定其中13株为IgG型抗体,其中2株抗体性能非常稳定。本实验制备的淀粉磷酸化酶单克隆抗体效价高、特异性强、稳定性好,为后续木薯中淀粉磷酸化酶研究奠定基础。     

逆转录病毒载体RNAi技术抑制猪瘟病毒在猪胚胎成纤维细胞的增殖

摘要:利用针对猪瘟病毒（Classical swine fever virus , CSFV）石门株Npro基因mRNA的shRNA逆转录病毒表达载体,转导猪胚胎成纤维细胞,在G418的筛选压力下,获得7个稳定整合shRNA表达构件的猪胚胎成纤维细胞株。以100TCID50的CSFV分别感染96孔板内的上述细胞克隆,72h后以对感染细胞克隆的进行间接免疫荧光分析及子代病毒滴度检测,结果显示,在所获得的7个抗性细胞株中,有3株细胞上猪瘟病毒的增殖显著降低,表明所构建的针对猪瘟病毒Npro 基因mRNA的shRNA逆转录病毒整合细胞基因组后转录产生的siRNA可以有效抑制CSFV的复制。     

牛结核杆菌MPB64蛋白的真核表达

利用PCR技术扩增出牛结核杆菌mpb64基因片段,克隆到真核载体pcDNA3.1(+)上,构建重组质粒pCM64,将该重组质粒转染SP2/0细胞,间接免疫荧光试验和Western blotting检测目的基因的表达情况.结果表明,在转染了重组质粒pCM64的SP2/0细胞中出现绿色荧光,转染的SP2/0细胞泳道23 kDa处出现特异条带,说明mpb64基因在SP2/0细胞中成功进行了瞬时表达.     

猪瘟病毒E2基因转化玉米研究

E2蛋白是猪瘟病毒(CSFV)表面主效抗原蛋白,具有诱导机体产生免疫应答的功能。本研究采用根癌农杆菌介导法将E2基因种子特异表达载体导入甜玉米自交系1132,转化获得128株转基因系,经过叶片PPT抗性筛选,有22个转基因株系对PPT表现抗性,RT-PCR分析显示有7个转基因株系正确表达,原核表达检测结果显示,E2基因表达产物正确。     

猪瘟病毒Shimen株p80基因的克隆及其真核表达质粒的构建

根据已发表的猪瘟病毒(classicalswinefevervirus,CSFV)Alfort株和Brescia株的全基因组序列,设计2对引物P1/P2和B1/B2,在B1和B2的5'端分别加上XhoI和ApaI位点,以CSFVShimen株细胞毒为材料一步法提取总RNA,并以此为模板采用反转录PCR(RT-PCR)和套式PCR(nPCR),成功地扩增到约2.0kb的片段,将此PCR产物回收后与pMD18-T连接、转化,获得重组质粒,经PCR扩增,限制性酶切(BamhI/HindШ)和序列部分测定鉴定为阳性重组质粒P80-T。将P80-T分别经XhoI和ApaI酶切消化、回收后,与经XhoI/ApaI酶解的真核表达载体PEGPF-C1连接、转化,获得重组质粒,经PCR,XhoI和ApaI限制性酶切和序列测定鉴定为真核表达质粒P80-P,目的基因的插入位置、方向和读码框完全正确。为下一步在哺乳动物细胞中表达猪瘟病毒p80蛋白奠定了基础。     

抗猪瘟病毒单克隆抗体的制备及其生物学特性鉴定

为对猪瘟病毒(CSFV)建立更加有效的临床检测方法.用纯化的猪瘟兔化弱毒免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与Sp2/O骨髓瘤细胞融合.经ELISA方法筛选和3次亚克隆,最终获得了5株能稳定传代并分泌抗猪瘟病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为:C7,C9,G9,G10和4E8,其分泌的单克隆抗体(McAb)为IgG1(G9,4E8)和IgG2a(C7.C9,G10)亚类.经鉴定,5株单抗细胞培养上清效价为1:1 600～1:3200,腹水效价为1:51200～1:102400.交叉试验及特异性抗原阻断试验表明,所制备的McAb与其他抗原无交叉反应性,均完全针对猪瘟病毒(CSFV)抗原决定簇,具有高度特异性.稳定性试验表明,制备的杂交瘤细胞株经连续传代25代和经3次冻存复苏后,仍能稳定分泌特异性抗体.抗CSFV McAb的成功制备,为进一步研究CSFV的生物学特性及其快速诊断方法的建立奠定了基础.     

猪圆环病毒II型ORF4真核表达载体构建及其抗体制备

为构建猪圆环病毒II型(PCV2) ORF4基因的真核表达载体,并制备ORF4抗体。用PCR方法扩增PCV2 ORF4基因,将其克隆入真核表达载体pCDNA3.1(+)或pEGFP-C1,成功构建出重组质粒pCDNA-ORF4、pEGFP-ORF4。重组质粒pEGFP-ORF4转染PK15细胞后,pEGFP-ORF4蛋白在细胞中明显表达,荧光信号主要定位于细胞核内。重组质粒pCDNA-ORF4接种BALB/c小鼠后,接种小鼠血清能与PCV2发生特异性免疫反应,经4次接种后抗体效价均达到1:26以上,表明诱导产生了PCV2 ORF4抗体。研究结果表明,构建了2种PCV2 ORF4真核表达载体,并制备了PCV2 ORF4抗体,为PCV2 ORF4基因功能研究奠定了基础。     

猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2的克隆表达

为了研究不同时间段细胞MHC分子表达的变化情况,从分子水平上说明E2基因与NHC之间的关系,本研究克隆了中国猪瘟病毒强毒石门毒株E2基因,构建了pcDNA3.0真核表达质粒P-E2基因。限制性内切酶进行双酶切和序列分析鉴定E2基因插入位置、方向和读码框架的正确性。构建成功的真核表达质粒P-E2,用脂质体转染方法瞬时转染进行体外细胞表达,转染后24,48 h后用Western-blot和间接免疫荧光技术检测P-E2基因质粒在PK-15细胞内的表达情况。结果表明：用His抗体进行间接免疫荧光检测发现E2基因得到表达,并定位于细胞浆,同时Western-blot检测后发现重组质粒P-E2转染后也在PK-15细胞中得到了表达。为进一步研究猪瘟病毒与宿主细胞之间的关系,病毒的致病机理提供了基础材料。     

猪瘟重组蛋白E2的兔体免疫保护试验

鉴于猪瘟病毒不能使家兔发病,但能使之产生免疫原性,而且猪瘟兔化弱度苗能在兔体的定型热反应.本研究选用家兔为试验模型,将自制的亚单位疫苗用弗氏佐剂乳化后免疫家兔,持续一定的免疫周期后,用猪瘟活疫苗(Ⅱ)攻击免疫及对照试验家兔.根据T淋巴细胞增殖试验、阻断ELISA及攻毒保护试验对所制备的抗原进行了全面的评价.结果表明,该免疫原具有良好的免疫原性,而且能保护免疫家兔为4/4.可以进行下一步的开发和利用价值.以期该疫苗能为猪瘟的防治做出贡献.     

昆虫细胞中表达eGFP基因的重组杆状病毒的构建

为构建表达增强型绿色荧光蛋白(eGFP)融合蛋白的昆虫杆状病毒转移载体。利用Sf-9细胞表达eGFP,用PCR法从重组Bacmid和pEGFP-C3质粒中扩增gp64SP、eGFP和VSVGED片段,利用一步法SOE-PCR将3个片段连接在一起。用Xba I和Hind III酶切融合片段与pFastBac PH,连接获得阳性质粒命名为pFB/LM-PH。转化E.coli DH10Bac,通过转座子Tn7的介导,获得重组杆状病毒Bv-LM-PH,感染Sf9昆虫细胞。结果表明：通过倒置荧光显微镜观察细胞形态及荧光表达情况,结果证实：感染的Sf9细胞可表达外源基因eGFP。重组pFB/LM-PH载体具备表达eGFP的能力,为分子生物学研究提供了一种新型可表达eGFP融合蛋白的昆虫杆状病毒表达载体。     

鸡MHCⅠ分子二聚体融合基因的构建及表达

为进一步研究主要组织相容性复合体Ⅰ类分子(major histocompatibility complex, MHCⅠ)的作用机制,提高其抗原呈递的效率,获得生物活性较好的鸡MHCⅠ分子二聚体,采用4个不同长度的连接肽G₄S、(G₄S)₂、(G₄S)₃和(G₄S)₄,通过基因重组技术将MHCⅠα和β₂m链基因共价连接,随后插入带有绿色荧光标签蛋白的真核表达载体,成功构建了4个重组质粒pEGFP-MHCⅠβ₂m-α。真核细胞表达后,荧光显微镜观察可见,各重组MHCⅠ二聚体分子均主要分布于真核细胞的内膜系统。此外,Western Blot检测均可见蛋白大小约80.0 kD左右的特异反应带,表达蛋白与鸡MHCⅠ类分子的相应抗体可发生特异性结合反应。研究结果表明各连接肽的重组质粒pEGFP-MHCⅠβ₂m-α均能够在真核细胞中顺利表达,且融合蛋白具有良好的免疫学活性。