烟草不同组织总RNA的提取方法初探

【研究目的】寻找烟草各个组织总RNA最佳的提取方法。【方法】以烟草K326的根、茎、叶、蕾、花和种子为材料,分别采用试剂盒法、Trizol法和CTAB法提取烟草6个组织总RNA进行对比。【结果】烟草不同组织总RNA提取方法有所不同,试剂盒法和Trizol法只能提取出根、茎、叶、蕾和花的总RNA,而不能提取种子总RNA;CTAB法能提取出6个组织的RNA。3种方法提取的RNA质量好,均能满足RT-PCR以及后续实验的要求。【结论】试剂盒法较Trizol法和CTAB法简单、快捷,适合于烟草除种子以外其余组织总RNA快速提取,CTAB法适合烟草所有组织总RNA提取。     

辣椒cDNA-AFLP体系的优化与应用

以辣椒花蕾和嫩叶为试验材料,对影响辣椒cDNA-AFLP体系的关键因素进行了探讨,建立了适宜于辣椒基因差异表达的cDNA-AFLP体系。结果表明,Trizol法适用于辣椒花蕾和嫩叶总RNA提取;SMART法合成双链cDNA效率较高;利用Taq I/Ase I分步酶切cDNA各3h可酶切完全;连接产物最佳稀释倍数为15倍;预扩产物稀释15倍经选择性扩增,PAGE电泳可以获得带型丰富且重复性好的结果。辣椒cDNA-AFLP反应体系的建立为辣椒基因的差异表达分析奠定了基础。     

油茶叶片总RNA提取的改良Trizol法及比较

为了探讨油茶叶片高质量RNA的提取方法,改良了常规的Trizol法提取RNA的条件。运用常规Trizol法、改良Trizol法、常规的SDS法、常规异硫氰酸胍法和常规CTAB法提取油茶叶片总RNA,并运用紫外分析和琼脂糖凝胶电泳分析方法比较了各种样品RNA的质量。本研究表明,常规Trizol法、常规的SDS法、常规异硫氰酸胍法和常规CTAB法提取油茶叶片总RNA的质量较差,改良Trizol法二在RNA提取时加入了PVP和巯基乙醇和氯化钠,能很好地去除油茶叶片中多糖和多酚物质,获得的总RNA质量高,完整性强,可以用于反转录和基因扩增分析。本研究将为油茶的分子生物学研究提供帮助。     

可口革囊星虫体壁总RNA提取的有效方法

为了从可口革囊星虫体壁中提取高质量的RNA,以便深入开展分子生物学研究。采用改良Trizol法、Trizol法和十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法3种方法提取可口革囊星虫体壁中总RNA,并通过琼脂糖凝胶电泳比较不同方法提取总RNA的效果。结果表明:改良Trizol法提取的总RNA经电泳后能看到清晰完整的28S r RNA、18S rRNA和5S rRNA条带,无拖尾现象;而Trizol法和CTAB法提取的总RNA电泳条带完整性较差,缺少28S rRNA。传统的Trizol法和CTAB法不适用于可口革囊星虫体壁总RNA的提取;改良Trizol法提取的总RNA电泳条带清晰、完整性好,质量符合cDNA合成、RT-PCR扩增等后续实验要求,适用于提取可口革囊星虫体壁总RNA。     

可口革囊星虫体壁总RNA提取的有效方法

为了从可口革囊星虫体壁中提取高质量的RNA,以便深入开展分子生物学研究。采用改良Trizol法、Trizol法和十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法3种方法提取可口革囊星虫体壁中总RNA,并通过琼脂糖凝胶电泳比较不同方法提取总RNA的效果。结果表明：改良Trizol法提取的总RNA经电泳后能看到清晰完整的28S rRNA、18S rRNA和5S rRNA条带,无拖尾现象;而Trizol法和CTAB法提取的总RNA电泳条带完整性较差,缺少28S rRNA。传统的Trizol法和CTAB法不适用于可口革囊星虫体壁总RNA的提取;改良Trizol法提取的总RNA电泳条带清晰、完整性好,质量符合cDNA合成、RT-PCR扩增等后续实验要求,适用于提取可口革囊星虫体壁总RNA。     

茶梅花瓣总RNA提取方法的比较和分析

本研究分别利用CTAB多级沉淀法、改良的异硫氰酸胍法、改良的热硼酸法、Trizol法和EASY spin植物RNA提取试剂盒法等五种方法提取茶梅花瓣总RNA,并进行了对比分析,发现EASY spin植物RNA提取试剂盒法是最为简单、快速、高效的方法,CTAB多级沉淀法次之。本研究为今后有效开展茶梅分子生物学研究提供技术便利,并为其它花卉植物RNA的提取提供必要的参考。     

甘薯块根的五种RNA提取方法的比较研究

为了确立甘薯块根总RNA最适提取方法,为富含色素、多糖、蛋白质等物质的试验材料的RNA提取提供参考。本研究选择紫薯1号、徐紫薯L7和浙薯1号的块根作为研究材料,采用Trizol法、RNA prep Pure Plant Kit法、RNA plant Plus法、研卉总RNA提取法和CTAB法共五种提取方法对甘薯块根总RNA进行提取,并考察各方法 RNA提取浓度和纯度。研究显示,Trizol法、RNA plant Plus法和RNA prep Pure Plant Kit法在甘薯块根总RNA提取中存在弊端,提取的RNA质量较差。CTAB法和研卉总RNA提取法提取的RNA质量较好,可有效去除各类杂质,且可用于反转录并扩增出IbTubA基因的特异条带,其中,CTAB法步骤比较繁琐但提取的RNA浓度高,而研卉总RNA提取法操作简便但提取的RNA浓度相对较低。     

玛咖贮藏根总RNA提取方法的比较

为了筛选出适合玛咖贮藏根总RNA的提取方法,本研究比较了改良异硫氰酸胍法、CTAB法、Trizol法和E.Z.N.A.TM Plant mi RNA Kit试剂盒法等4种方法对玛咖根总RNA提取的效果。结果表明:改良异硫氰酸胍法提取效果不理想,CTAB法存在DNA污染;Trizol法和E.Z.N.A.TM Plant mi RNA Kit试剂盒法能有效去除多糖,提取出质量高、完整性好的RNA,OD260/OD280值大部分都在1.8~2.0之间,但Trizol法提取RNA的平均得率(156.3μg/g)是E.Z.N.A.TMPlant mi RNA Kit试剂盒法提取RNA的平均得率(48.6μg/g)的3.2倍,说明Trizol法可作为玛咖根总RNA提取的首选方法。     

改良Trizol法快速高效提取香石竹总RNA

因为多糖等大分子的污染,传统Trizol法难以从香石竹的叶片中获得完整RNA。本研究以香石竹为材料,对传统的Trizol法进行改良,成功地从香石竹花瓣和叶片中提取了总RNA,经琼脂糖电泳,紫外分光光度计测定总RNA完整性好,纯度大,花瓣的OD260/OD280=1.96,每0.1g花瓣可获得RNA61μg,叶片RNA的OD260/OD280=1.94,每0.1g幼叶可获得RNA33μg,花瓣的RNA产量普遍高于叶片。经改良Trizol法提取的被香石竹斑驳病毒侵染的植株的花瓣和叶片的总RNA,经RT-PCR获得了特异性条带,说明用改良Trizol法从香石竹花瓣和叶片中提取的RNA质量好、产率高、完整性强,完全适合于香石竹进一步的分子生物学研究。     

银杏叶片RNA提取方法的研究

为了获得一种银杏（Ginkgo biloba L.）叶片总RNA提取的理想方法,为后续的分子生物学研究打下基础,笔者以不同生长期的叶片为材料,利用生物分光光度计和凝胶电泳法比较了改良CTAB法、乙二醇丁醚法以及改良Trizol法提取的银杏总RNA的产率和纯度。结果表明：改良Trizol法所提取RNA的OD260/OD280比值介于1.8~2.0之间,并且OD260/OD230在1.9~2.1之间,具有较高的纯度。凝胶电泳结果表明,改良Trizol法有28S rRNA和18S rRNA 2条清晰的条带,且很少有降解;CTAB法获得的RNA品质也较好,但存在降解和弥散现象,乙二醇丁醚法提取效果较差。这表明改良Trizol法提取的总RNA具有很高的纯度,可以满足进一步分子生物学研究的要求。     

小麦抗病基因类似序列BRG1的分离与功能分析

利用cDNA-AFLP技术筛选到1个在抗黄矮病的小麦-中间偃麦草易位系YW642中特异表达的小麦抗病基因类似序列(BYDV resistance-related gene1, BRG1)的基因片段。利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)和RT-PCR技术,从YW642中分离出BRG1基因全长cDNA序列,获得了一个通读的抗病同源基因cDNA序列,编码由645个氨基酸组成的蛋白质,包含1个NB-ARC保守结构域和3个LRR结构域,该蛋白属于nucleotide-site binding, leucine-rich repeats (NBS-LRR)家族。荧光定量或半定量RT-PCR表达分析表明,BRG1在抗病小麦易位系YW642叶片中优势表达,受BYDV的诱导,BYDV接种后48 h表达量最高,BRG1在感病小麦亲本中8601中表达量始终较低,随BYDV接种时间延长呈轻微的下调趋势;而且外源激素水杨酸(SA)与茉莉酸(JA)处理可上调该基因在YW642中的表达。利用病毒介导的基因沉默技术分析了BRG1基因的功能,结果表明该基因沉默的抗病小麦易位系YW642中BYDV相对含量增加,但未造成抗病性表型显著改变,说明该基因参与抗黄矮病反应,但不是小麦抗黄矮病重要基因。     

小麦抗叶锈病近等基因系TcLr41基因的差异表达

为了研究与小麦抗叶锈病相关基因的表达情况,从分子水平阐明小麦的抗病机制.以Thatcher和Thatcher为遗传背景的小麦抗叶锈病近等基因系TcLr41为材料,利用cDNA-AFLP技术,开展了与小麦抗叶锈病基因Lr41相关的差异表达基因研究.共选用180对引物组合对Lr41差异表达的基因进行了分析,获得了61对能够在小麦近等基因系TcLr41和感病对照Thatcher之间扩增出差异条带的多态性引物.获得5对能够扩增出5条对小麦抗叶锈病近等基因系TcLr41具有特异性条带的引物,分别是P-AC/M-CAA、P-AG/M-CAT、P-AG/M-CCC、P-CC/M-CCA、P-GA/M-CAA.将重复性好的4条差异片段进行回收、克隆、测序,经序列同源性检索发现了1条与小麦抗叶锈病基因Lr1编码蛋白同源性较高的序列,其他的3个序列功能未知,研究结果为探明TcLr41的抗病机制和进行该抗病基因的克隆奠定了基础.     

利用BSMV-VIGS技术快速分析小麦TNBL1基因的抗黄矮病功能

小麦黄矮病是由蚜虫介导的大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf virus, BYDV)侵染引起的小麦重要病害之一。利用cDNA-AFLP分析,筛选出在抗黄矮病小麦易位系YW642中特异表达的长度为292 bp的 cDNA片段,以此片段为启始序列,利用RACE和RT-PCR技术克隆出该基因的全长cDNA序列,推导该基因编码1个NBS-LRR蛋白,将其命名为TNBL1。本研究利用大麦条纹花叶病毒(BSMV)诱导的基因沉默(virus-inducing gene silencing, VIGS)技术,快速分析TNBL1是否参与小麦抗黄矮病反应。通过PCR添加酶切位点、定向酶切与连接,将TNBL1特异的292bp片段反向整合到BSMV-γ链的多克隆位点上,获得重组载体BSMV-γ: TNBL1as,体外转录BSMV-VIGS载体的3个组分(BSMV-TNBL1as、BSMV-α和BSMV-β),等量混合、摩擦接种到抗黄矮病的小麦易位系YW642幼苗叶片上,使YW642中TNBL1基因沉默,然后接种BYDV病原进行黄矮病抗性鉴定。结果表明,TNBL1基因沉默后的YW642对BYDV敏感、显现感病症状,其体内BYDV含量较未发生基因沉默的YW642中的明显增加,证明TNBL1基因是正向调控小麦抗BYDV反应的1个重要基因。     

高质量的小麦种子总RNA的快速提取方法

提取高质量的RNA是从基因表达水平上研究小麦种子发育的必要条件。现有提取方法难以快速得到高纯度的小麦种子总RNA。本试验将冷酚法和Trizol一步法相结合，在5h左右就可得到高质量的总RNA。通过琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度计检测，提取的总RNA具有清晰的28S rRNA、18S rRNA条带，OD260/DO280比值在1．90-2．00之间。将提取的总RNA用于反转录，可获得高质量的cDNA，在cDNA—AFLP分析上可得到清晰的条带。说明这种方法获得的总RNA纯度和完整度非常高，完全满足分子生物学研究的要求。     

小麦杂交种与亲本之间穗下节间基因差异表达分析

以株高和穗下节间长度表现杂种优势的小麦杂交组合矮9×冀矮8号的杂种及其亲本为材料, 应用cDNA-AFLP技术分析杂种、亲本的穗下节间基因差异表达情况。分离差异表达基因段后, 对其克隆、测序并在GenBank进行Blast-x分析和功能推测, 发现差异表达的基因包括分别受赤霉素和细胞分裂素诱导表达、与细胞分裂有关的基因cdc2和PAS1基因, 它们在小麦杂种节间中分别特异表达和偏高亲表达。另有一个与细胞快速膨大有关的液泡质子泵H⁺-PPase基因在杂种中偏高亲表达。其他差异表达的基因包括蛋白激酶等与植物信号传递相关基因、与物质代谢相关的基因、参与基因转录调控的基因、与泛素参与的蛋白降解相关的基因等。小麦杂交种与亲本的穗下节间, 大量基因涉及细胞分裂、膨大和物质代谢、转录调控等过程, 初步推测它们的差异表达可能与穗下节间及株高杂种优势形成有关。     

小麦抗/感白粉病近等基因系基因表达差异的研究

采用cDNA-AFLP(cDNA-amplified fragment length polymorphism)技术,对小麦抗白粉病近等基因系Mardler/7*百农3217和百农3217材料的不同处理,于接菌后不同时间点的基因表达进行了表达分析。Mardler/7*百农3217及其感病轮回亲本百农3217在表达上存在差异;利用46对引物在抗/感近等基因系和感病轮回亲本DCINA处理发现283条差异带,对其中42条片段进行克隆测序,同源性分析发现包括信号转导相关的基因片段、与细胞壁的组成和结构相关的基因片段和与过敏性反应相关的基因片段。此研究结果发现其中的一些差异显示片段对小麦的抗白粉病机理的揭示具有重要作用。     

优质面包小麦品种济南17和豫麦34灌浆期高温胁迫差异表达基因的分离

选用品质相对不稳定的小麦品种济南17和品质较稳定的品种豫麦34,于开花后15~18 d（灌浆中期）及30~33 d（灌浆后期）分别进行连续3 d的高温胁迫处理（昼夜温度为38℃,25℃）。提取籽粒总RNA,通过cDNA-AFLP分析获得差异条带。回收差异条带,再经过克隆、测序、BLAST比对,济南17、豫麦34分别获得85个和99个高温胁迫下差异表达基因片段的序列。经过反向Northern杂交验证后,济南17获得25个信号明显的序列,其中22个来自热诱导表达的基因,主要与小麦的胁迫响应基因、热激蛋白等同源;豫麦34获得31个信号明显的序列,其中25个来自热抑制表达的基因,主要与乙烯合成酶、吡咯啉-5-羧酸合成酶等同源。说明高温胁迫总体上诱导品质不稳定品种的基因表达,而抑制品质稳定品种的基因表达。济南17的序列有15个来自灌浆中期样本、10个来自灌浆后期样本,豫麦34的序列则分别有29个来自灌浆中期样本、2个来自灌浆后期样本,说明高温胁迫对灌浆中期基因表达的影响比灌浆后期显著,在品质稳定品种中则比品质不稳定品种中更为明显。2个品种在高温胁迫下的基因表达模式存在显著差异,济南17诱导表达胁迫响应基因,豫麦34抑制表达乙烯合成酶和吡咯啉-5-羧酸合成酶及胁迫响应基因,这可能是二者品质稳定性不同的重要原因。     

cDNA-AFLP技术及其在植物基因表达分析中的应用

cDNA-AFLP是一种新的mRNA指纹图谱技术,具有重现性高、准确、可靠的特点,可对生物体转录组进行全面分析,广泛应用于基因表达特性研究、植物遗传标记分析和分离植物基因等方面.近年来随着该技术的不断发展和应用,在研究中取得了很多成果.本研究就cDNA-AFLP技术的原理和特点,在植物基因表达研究中的应用现状和发展前景进行了综述.     

山葡萄cDNA-AFLP体系的建立及引物的筛选

以山葡萄品种左山一的叶片和花芽为材料,对cDNA-AFLP体系的几个关键因素进行摸索,建立了适宜山葡萄的cDNA-AFLP反应体系.结果表明,提取山葡萄的花芽RNA适宜用改良的CTAB法,提取叶片RNA适宜用SDS-酸酚法.在2x Y/T Buffer的作用下,500 ng的cDNA利用Mse Ⅰ与EcoR Ⅰ双酶切4 h即可酶切完全,将16℃连接过夜的产物稀释5倍作为预扩增的模板,预扩增产物稀释20倍作为选扩模板能获得带型稳定可重复性好的结果.     

黄瓜cDNA-AFLP分析体系的建立

以黄瓜为研究材料,研究了影响cDNA-AFLP反应体系的几个关键因素,建立了适宜黄瓜的cDNA-AFLP分析体系,并得到了较为清晰可辨的cDNA-AFLP指纹图谱。结果表明,适用于黄瓜dscDNA的酶切组合为TaqI和VspI,dscDNA酶切用量为300 ng,用作预扩增模板的连接产物稀释倍数为1倍,作为选择性扩增模板的预扩增反应产物的适宜稀释倍数为30倍。