大豆KTI1基因表达方式分析及其启动子预测

为明确大豆胰蛋白酶抑制剂基因(KTI1)在不同逆境、ABA条件下及大豆不同组织中的表达方式,本研究采用实时荧光定量PCR技术检测,结果表明KTI1基因受低温、盐、干旱和ABA诱导,分别在处理10、5、24和1 h时获得诱导最高值,相对表达量分别是未处理的288.65,274.35,136.04和56.48倍;KTI1基因在大豆种子中的表达量相对较高,叶中的表达量为1时,种子中的表达量为8.70。根据大豆基因组序列,扩增KTI1基因ATG上游启动子序列1 831 bp;生物信息学预测分析表明启动子中存在多种常出现在逆境胁迫诱导型启动子中的顺式调控元件,推测大豆KTI1基因启动子可能是受低温、盐、干旱和ABA诱导的诱导型启动子。本研究为进一步研究和应用大豆KTI1基因及其启动子提供理论基础。     

大豆sbp基因表达方式分析及其启动子调控活性研究

研究大豆蔗糖结合蛋白基因(sbp)的表达方式及其启动子的调控活性,为揭示sbp基因表达本质及其启动子功能研究、利用提供理论依据。利用qRT-PCR方法,检测sbp基因在不同逆境胁迫条件下及不同组织中的表达方式;利用PCR方法,克隆sbp基因5'端上游序列并对其进行预测分析;在转基因烟草中,研究sbp基因启动子在干旱胁迫条件下及不同组织中的调控活性。sbp基因受干旱诱导上调,而在盐、低温、ABA诱导下表达下降。sbp基因在大豆根、茎、叶、花中的相对表达量低,而在种子中的相对表达量高。克隆获得sbp基因5'端上游942 bp序列,命名为SP,预测分析表明,SP序列中含有多种典型的种子特异表达元件及与激素、逆境诱导相关的元件。组织化学分析表明,在转基因烟草中,SP启动子驱动gus基因在干旱胁迫下及种子中高表达。推测SP启动子兼具干旱诱导表达活性和种子特异表达特性。     

拟南芥逆境胁迫诱导表达基因rd29A启动子的克隆与序列分析

以拟南芥基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到逆境胁迫诱导表达基因rd29A的启动子片段,将其克隆到pUC19质粒中进行序列分析。结果表明,获得的启动子片段大小为937bp,与已报道的该启动子序列比较,其核苷酸序列同源性为99．8％。     

甘蔗ShSAP1基因启动子的克隆与序列分析

启动子在转基因育种中具有重要地位,为了发掘高效的胁迫诱导和组织特异型启动子,提高目的基因的表达效率,根据甘蔗逆境相关蛋白家族基因ShSAP1的基因组序列,利用Genome Walking法对ShSAP1的启动子进行了分离,并对其序列进行了生物信息学分析。分离获得了1243 bp的启动子序列,该序列具有启动子的核心元件,还包含了干旱等胁迫相关的应答元件、MYB/MYC转录因子识别与结合元件、光应答元件及组织特异性相关元件,说明ShSAP1的启动子可能具有逆境应答及组织特异表达特性,值得开展进一步的功能研究。     

大豆低温诱导启动子GmERF9P的克隆及活性鉴定

为获得低温诱导基因GmERF9启动子,并分析该启动子的功能,利用PCR技术从大豆叶片基因组DNA中克隆1885bp的GmERF9启动子序列GmERF9P。序列分析表明,GmERF9P序列中含有多种与逆境相关的顺式作用元件。将GmERF9P构建到植物表达载体pCAMBIA1301上并转化烟草。通过PCR检测共获得6株T_1阳性转基因烟草株系。对野生型烟草和转基因烟草进行低温处理2h,通过GUS组织化学染色和实时荧光定量PCR检测GUS基因的表达量。结果显示GmERF9P在低温处理下能够提高GUS基因的表达量,具有低温诱导启动活性。     

葡萄逆境胁迫诱导启动子的克隆及表达分析

为了研究葡萄抗逆基因(CAN70200.1)的表达特性,采用PCR技术从葡萄中克隆了CAN70200.1基因上游一段长度为1 354 bp的启动子片段,命名为PCAN。采用Plant CARE和PLACE启动子在线预测工具分析表明,PCAN启动子序列具有CAAT-box、TATA-box基本的顺式作用元件和一些参与非生物胁迫、光和植物激素应答相关的顺式作用元件。为验证启动子的表达特性,将PCAN启动子连接到p CAMBIA1391Z载体GUS基因的上游,构建成植物表达载体p1391Z-CAN,并通过农杆菌介导法转化烟草,经PCR鉴定,获得转基因植株。对转基因烟草植株进行逆境胁迫处理发现,在干旱处理120 min后,PCAN启动子活性达到最强;而4℃低温处理30~60 min时,PCAN启动子活性达到最强,表明PCAN启动子具有低温和干旱胁迫诱导表达特性。     

绵果荠CBF基因启动子克隆及诱导特性分析

CBF基因不仅是植物CBF抗冷途径的枢纽,而且可以提高植物的抗冷能力。而植物的抗冷能力的提高是由于CBF基因调控下游抗冷基因的表达来实现的。本研究根据前期已克隆得到的绵果荠Ll CBF基因(JQ687132)序列,利用TAIL-PCR方法从新疆早春短命植物绵果荠基因组DNA中分离得到Ll CBF基因编码区上游1 172 bp启动子序列;将该序列连入克隆载体并测序,通过生物信息学分析表明,该序列含TATAbox、CAAT-box等典型的真核生物核心启动子元件,同时具有等逆境响应相关元件。在烟草叶片中的瞬时表达分析,进一步表明,在低温、干旱及盐胁迫诱导下该启动子序列具有驱动GUS报告基因表达的特性。本研究对新疆早春短命植物种质资源的开发利用及丰富作物逆境基因工程诱导启动子资源具有重要的实践意义。     

大豆种子成熟蛋白PM40基因表达方式分析及其启动子预测

研究大豆种子成熟蛋白PM40基因在不同逆境条件下及大豆各组织中的表达情况,并对其上游启动子序列进行生物信息学预测,为揭示PM40基因表达本质及其启动子的功能研究、利用提供理论依据。利用qRT-PCR方法,检测PM40基因在干旱、盐、低温、脱落酸条件下的表达;比较该基因在大豆根、茎、叶、花、30DAF、60DAF和90DAF中的表达;克隆PM40基因5′端上游启动子序列,并预测其含有的顺式作用元件。结果表明,PM40基因在干旱、低温和脱落酸处理不同时间下,与未处理相比,表达量均下降,在盐处理条件下,只有处理2 h时表达升高,其余处理时间基因表达下降,说明PM40基因受干旱、低温和脱落酸诱导表达下降,在盐诱导2 h时表达升高;PM40基因在大豆种子中的表达相对较高,尤其是60DAF和90DAF的种子中,相对于根的表达量为35.76,239.75倍;以大豆基因组DNA为模板,克隆PM40基因5′端上游启动子序列1 581 bp,生物信息学预测表明,PM40基因启动子序列中包含多种与种子高表达相关的顺式元件。推测大豆PM40基因启动子可能具有种子特异表达特性。     

棉花转录因子GhSNAC3启动子的克隆与表达分析

为研究棉花NAC转录因子基因GhSNAC3启动子的结构和功能,以鲁棉研32号基因组为模板,用PCR扩增的方法得到棉花基因GhSNAC3的启动子序列,利用分析网站PlantCARE、PLACER和BDGP对启动子上存在的顺式作用元件进行了预测与分析,在此基础上利用该启动子及GhSNAC3基因构建植物表达载体,并通过烟草遗传转化进一步研究启动子的转录活性。结果表明GhSNAC3启动子除含有CAAT-box等基本顺式作用元件外,还含有茉莉酸、赤霉素和脱落酸响应元件以及大量光顺式作用元件和逆境胁迫诱导相关的顺式调控元件。采用不同胁迫处理转基因烟草并进行表达分析,结果显示GhSNAC3在盐胁迫下植株根部有高水平的表达,而在茎和叶中表达量极低,表明GhSNAC3在逆境胁迫应答过程中可能具有重要功能,其启动子是一个盐诱导型启动子,具有组织特异性。研究结果为棉花NAC信号通路研究和耐盐基因工程改良提供了理论依据。     

百子莲ApCathB启动子克隆及其对超低温保存的响应分析

组织蛋白酶B基因(ApCathB)是影响百子莲胚性愈伤组织超低温保存冻存率的关键基因,为探究ApCathB如何响应超低温保存复合逆境,利用染色体步移法扩增获得ApCathB的启动子序列,使用PlantCARE在线软件分析该启动子中含光、激素和非生物胁迫相关的顺式作用元件。将ProApCathB::GUS表达载体转化拟南芥,获得转基因植株,GUS组织化学染色表明ApCathB启动子在拟南芥幼苗时期和小花等部位活性较高,在成熟叶中较低。转基因拟南芥萌发60 h幼苗在超低温保存处理过程中,GUS基因和蛋白的表达量在脱水处理后显著提高,暗示ApCathB启动子受到脱水处理的诱导进而响应超低温保存复合逆境,这为进一步研究ApCathB在百子莲超低温保存中的功能及其相关调控机制提供了数据参考。     

水稻耐旱性基因OsERF65的克隆、表达及转录自激活活性分析

ERF家族转录因子普遍存在于植物中,在植物生长发育、抵抗逆境的过程中发挥着重要作用。本研究从‘珍汕97B’中克隆到一个耐旱相关基因OsERF65,属于ERF转录因子家族的成员。生物信息学分析表明,OsERF65含有一个保守的AP2结构域,与AtERF73等同源蛋白的亲缘关系较近。OsERF65的启动子区域含有多个响应非生物胁迫及激素处理的顺式作用元件,定量PCR结果显示该基因的表达明显受干旱、高盐等非生物胁迫处理的诱导;酵母中转录激活活性结果显示OsERF65具有一定的转录自激活活性;烟草瞬时表达结果表明Os ERF65蛋白定位于细胞核中。本研究为进一步研究OsERF65的生物学功能奠定了一定的基础。     

木薯转录因子基因MeHDZ14的克隆与分析

HD-Zip家族基因在植物生长发育和逆境胁迫中起重要作用。为了研究MeHDZ14基因在非生物胁迫(尤其是干旱)应答中的作用,选用对干旱信号反应灵敏、相对耐旱的木薯品种"SC124"作为实验材料,利用RT-PCR克隆了MeHDZ14基因。生物信息学分析发现,MeHDZ14基因编码的蛋白具有典型的HD-Zip保守结构域。将该基因编码的蛋白与GFP融合,亚细胞MeHDZ14:GFP重组蛋白定位于细胞核。同时,酵母Y187中的转录自激活试验结果也表明,MeHDZ14蛋白具有明显转录自激活功能。推断MeHDZ14是一个典型的HD-Zip I转录因子。MeHDZ14启动子区具有多个ABA响应元件ABRE(ABA response element)。基因差异表达分析结果表明,MeHDZ14基因在叶片和根中的表达受干旱胁迫的诱导,并对外源ABA具有明显的响应。因此,认为MeHDZ14基因通过ABA依赖信号传导途径参与调控木薯干旱响应。此外,还发现MeHDZ14基因的编码区虽然存在数个SNP,但表现出高度保守性,且在不同木薯品种中的表达对干旱胁迫均有明显的响应,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

海藻糖酶基因RNA干扰载体对花烟草的转化

为了能够使花烟草更好地应用于园林美化,需要进一步提高其抵抗非生物胁迫的能力。海藻糖在植物抗逆性方面具有重要作用。利用RNA干扰技术抑制植物海藻糖酶基因的表达,可以阻断海藻糖降解过程,从而使植物体内海藻糖含量增加,有望以此提高植物抵抗非生物胁迫的能力。本实验利用叶盘侵染法将带有拟南芥海藻糖酶基因干扰载体(iTre-1285)的农杆菌导入花烟草中,经过抗生素筛选初步获得阳性植株后,对阳性植株提取DNA,完成了目的基因的PCR鉴定,初步证明目的基因已转入花烟草植株中。通过本试验,在建立起花烟草基因转化方法的同时,成功地将海藻糖酶干扰基因转入花烟草中。转基因花烟草植株的获得为后期能够进一步筛选出具有抵抗非生物胁迫的转基因植株奠定了基础。     

CBF1转录因子基因的克隆及两种启动子调控下的植物表达载体的构建

CBF1转录激活因子能调控一组抗干旱、抗低温基因的表达,更有效地提高植物抗干旱、抗低温的能力。现在国内外许多研究机构已经利用导入该转录因子来提高植物的抗寒性、抗旱性,并且获得一定的成功,但在园林植物上的应用还有待探讨。因此,本研究以拟南芥叶片为材料,通过PCR方法对其基因组DNA扩增,成功地克隆了逆境诱导型启动子和CBF1转录因子并分别构建了花椰菜花叶病毒CaMV35s启动子和rd29a启动子调控下的CBF1融合基因表达载体,为下一步转化园林植物,利用CBF1基因综合改良园林植物抗逆性及进一步探讨CBF1基因的抗逆分子机理奠定了物质基础。     

银杏GbASR基因的克隆、生物信息学及表达分析

为了明确银杏ASR(ABA-stress-ripening)在应答非生物逆境胁迫中的作用,以便为ASR基因功能、环境胁迫研究提供材料。本研究以银杏(Ginkgo biloba)为材料,利用分子生物学技术对ASR基因进行了克隆,构建pCAMBIA1300-ASR-GFP融合表达载体,进行亚细胞定位分析。采用序列比对方法分析GbASR蛋白结构域及系统进化;利用qRT-PCR方法进行组织特异性表达及非生物逆境胁迫下的基因表达分析。结果表明,银杏ASR基因编码区全长546 bp,共编码182个氨基酸;蛋白质等电点为5.33,分子量大小为20111.24 Da,为亲水性稳定蛋白;GbASR蛋白含有1个高度保守的ABA/WDS结构域,且与火炬松PtASR蛋白同源性较高;GbASR蛋白定位于细胞核。此外,GbASR基因在银杏幼苗根、茎、叶各组织中均有表达,且在叶部有较高的表达;在高盐、干旱和高温胁迫下,GbASR基因均受诱导,且在不同胁迫处理时间0 h、6 h、24 h和48 h的表达存在显著的差异。以上分析说明GbASR基因参与响应高盐、干旱和高温等非生物胁迫,这为植物的育种及解释ASR基因功能提供依据。     

小叶杨TMM基因启动子克隆及表达模式分析

气孔作为植物与外界进行气体交换的通道,对植物自身的生长发育至关重要。研究表明植物TMM蛋白与植物气孔的形成发育密切相关。本研究利用PCR技术克隆了小叶杨(Populus simonii Carr.)TMM基因5’端上游的调控序列pPsTMM,长度为2336 bp。生物信息学分析结果表明:小叶杨启动子pPsTMM除了含有TATA-box、CAAT-box等核心启动子元件之外,还含有多种光响应元件、植物激素响应元件、抗逆胁迫相关元件以及生理代谢和生长发育相关元件等,说明转录活性还可能受到光、植物激素、逆境胁迫等因素诱导。利用双酶切法构建植物表达载体pBI121-pPsTMM-GUS,叶盘法稳定遗传转化烟草,GUS化学组织染色显示GUS主要集中在叶芽起始发育部位表达,说明pPsTMM启动活性具有组织特异性。对非生物胁迫的转基因烟草进行GUS化学染色以及进行荧光定量PCR,结果显示pPsTMM对不同因素的非生物胁迫响应程度存在差异性,干旱和盐胁迫下启动活性很低,高温和低温对其调控作用也不明显,但对外在施加的植物激素(GA,NAA,ABA)和水杨酸(SA)响应程度很高,说明pPsTMM启动子对物理因素的响应值要远低于化学因素的诱导。本研究为进一步阐明TMM蛋白表达模式与小叶杨气孔发育特性及抗旱性之间的分子机制提供理论基础。     

小麦类钙调素TaCML79基因的克隆和表达分析

为了研究小麦类钙调素基因的功能和在植物逆境响应中的分子机制,以电子克隆结合RT-PCR的方法,在小麦中克隆到一个类钙调素基因TaCML79。该基因的开放阅读框长度为588bp,编码的蛋白长度为195个氨基酸,推测的分子量为20.45kDa,等电点为4.6,属于酸性蛋白,具有2个典型的和一个不完整的EF-hand结构域。多序列比对和系统进化树分析表明,TaCML79与野生稻的ObCML35和水稻的OsCML10亲缘关系较近,相似性分别为84.6%和86.8%。该基因的表达在根和地上部分受到热激、NaCl、渗透和冷胁迫的诱导或抑制,初步推断该基因可能与植物抗逆有密切的关系。     

马铃薯HD-Zip I家族ATHB12基因的克隆及功能鉴定

HD-Zip I是一类植物特异转录因子, 在植物应对外界逆境胁迫过程中有重要的调控作用。本研究从马铃薯栽培品种甘农薯2号中克隆了HD-Zip I转录因子ATHB12基因, 其开放阅读框为759 bp, 编码252个氨基酸残基。该基因位于马铃薯1号染色体, 其启动子区含有ABRE、LTRECOREATCOR15和WBOXATNPR1等多种响应非生物胁迫(ABA、低温、脱水及高盐)的顺式作用元件。ATHB12基因在马铃薯根、茎和叶中均有表达, 其根中表达量最高。qRT-PCR分析证实该基因的表达受聚乙二醇(PEG)、NaCl和ABA诱导, 受低温抑制。构建了由组成型表达启动子CaMV 35S驱动的ATHB12基因的过表达载体, 通过农杆菌介导法转化马铃薯获得了转基因植株。干旱处理后, 转基因植株叶片中丙二醛含量显著低于非转基因植株(P<0.05), 而脯氨酸含量显著高于非转基因植株(P<0.05); 转基因植株根鲜重和干重均高于非转基因植株; 说明马铃薯ATHB12基因可能参与了逆境胁迫的响应。