苎麻COMT基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR法结合cDNA末端快速扩增（RACE）法从苎麻中克隆了与木质素合成相关的COMT基因的全长cDNA序列。所获得的COMT基因全长1318bp,包含一个开放阅读框1098bp,编码365个氨基酸。序列相似性检索结果表明,苎麻COMT全长cDNA与杨树COMT基因的序列同源性达82%,其编码的氨基酸序列与杏的COMT氨基酸序列同源性最高,达93%。同时还检索到该氨基酸序列包含一个O-甲基转移酶的保守结构。     

香蕉ARF3基因全长克隆及其对枯萎病菌的响应特性分析

ARF3基因属于ARF基因家族的成员,主要功能是参与细胞信号转导、跨膜运输及囊泡转运。本研究根据已获得的基因片段设计4条特异性引物,采用RACE技术克隆获得了香蕉ARF3基因cDNA全长序列,命名为MuARF3。该基因序列全长共1427 bp,开放阅读框长度为1166 bp,共编码338个氨基酸。BLAST结果显示,香蕉ARF3基因全长核苷酸序列与已报道的其它植物ARF3具有69%～74%的相似性,氨基酸序列有81%～93%的相似性。用香蕉枯萎病菌4号生理小种侵染香蕉根系后,分析得出的结果表明,侵染根系后香蕉ARF3基因的表达量在侵染后12h达到最高,并且随着时间推移逐渐降低。由此说明本研究获得的MuARF3基因对香蕉枯萎病菌4号生理小种侵染具有应急响应,为进一步利用该基因提供参考。     

异附加系小麦过氧化物还原酶基因TaPrxQ的克隆与序列分析

本研究依据消减结果克隆得到山农6306编码过氧化物还原酶TaPrxQ的cDNA序列,利用生物信息学工具对其核酸和蛋白序列进行分析。结果表明克隆得到的TaPrxQ序列与基因组DNA对比分析得到的该基因不含有内含子,全长943bp。TaPrxQ的cDNA序列包含927bp的开放阅读框,编码308个氨基酸残基,其等电点为9.41,分子量32.4kDa。相似性比对分析显示TaPrxQ同已报道的HvPrx的氨基酸序列具相似性达到88%,从进化树分析结果推断TaPrxQ属于PrxQ类。     

斑茅铜锌超氧化物歧化酶基因(SaSOD-1)的克隆与序列分析

斑茅是甘蔗近缘野生种之一,具有较强的抗逆性,研究并开发利用斑茅的强抗逆基因,对甘蔗育种具有重要意义。本研究以高粱Cu/Zn-SOD(登录号:XM 002445626.1)cDNA序列为探针,对甘蔗属EST数据库进行检索、比对、拼接,通过设计特异引物,PCR扩增和序列分析验证,克隆得到2个Cu/Zn-SOD(SaSOD-1a和SaSOD-1b,登录号:KJ001795和KJ001796)基因全序列,其中SaSOD-1a基因组序列全长2 473 bp,SaSOD-1b基因组序列全长2 228 bp,均有8个外显子,7个内含子,其cDNA序列长度均为692 bp,编码206个氨基酸。序列比较分析表明,SaSOD-1a和SaSOD-1b序列相似性为98.6%,有8个单核苷酸多态性位点,蛋白质相似性为99.0%,2个氨基酸变异位点。用推导出的氨基酸序列与其它植物做同源进化分析,与高粱、玉米、谷子等比较均表现出较高的保守性。研究结果可为进一步了解超氧化物歧化酶与斑茅耐旱性的关系奠定基础。     

谷子3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆与结构分析

3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)在谷子盐旱胁迫早期高频率表达,为研究该基因在胁迫反应及其他代谢中的详细功能,本研究利用RACE技术克隆了谷子的GAPDH基因.该基因cDNA全长1328 bp,包括1008bp的开放阅读框,共编码338个氨基酸,肽段的分子量为35911.03Da,极性氨基酸占29.12%.序列比较分析发现,谷子的GAPDH同玉米的同源序列表现了最高的相似性,同水稻和小麦同源序列的相似性次之,同双子叶植物的同源序列则相差较远.     

甘蓝KAPP编码基因的克隆与序列分析

采用PCR、RT-PCR及其他分子生物学方法,以甘蓝基因组DNA、花蕾RNA和叶片RNA为模板,分别对甘蓝KAPP gDNA和KAPP cDNA进行扩增,分别获得3247bp的KAPP gDNA片段、1699bp的KAPP cDNA片段、1578bp的花蕾KAPP2 cDNA片段和1581bp的叶片KAPP2cDNA片段。对克隆的甘蓝KAPP gDNA和cDNA(结合报道的KAPPcDNA)进行比对表明,甘蓝KAPP基因包含11个内含子,均符合"GU-AG"剪接规则,并且克隆得到的KAPP cDNA序列与报道的KAPP cDNA序列有6处单个碱基的差异,但两者的氨基酸序列完全一致。然而花蕾KAPP2 cDNA、叶片KAPP2 cDNA片段与报道的KAPP cDNA序列相似性分别为85.2%和85.0%。这两个序列分别在590bp和593bp处较早出现一个无义突变引起的终止密码子。Blast分析表明,两基因编码的氨基酸序列与拟南芥KAPP氨基酸序列相似性最高,其次为甘蓝KAPP氨基酸序列。以已报道的8种植物KAPP的CDS及本实验所克隆的两个KAPP2序列构建分子进化树,获得序列与甘蓝KAPP序列聚为一支。结合比较作图及分子进化树,推测KAPP基因在甘蓝基因组上有两个拷贝,而笔者克隆到的KAPP2 cDNA序列是其中一个拷贝,是KAPP进化过程中突变失活的拟基因。     

甘薯S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因克隆与表达

从实验室建立的甘薯冷胁迫抑制消减文库中分离出一cDNA片段,经NCBI比对后发现该片段与其它植物的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因具有90%的同源性,根据相关物种S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因cDNA序列设计引物,以甘薯总RNA为模板,经RT-PCR扩增首次获得全长1182bp的甘薯SAMS完全编码区,NCBI比对分析结果表明：该片段与不同种属植物sams基因的编码区序列的核苷酸相似性达85.48%, 所推导的氨基酸序列相似性达93.6%。根据核苷酸序列和氨基酸序列分别构建了SAMS系统进化树,从分子水平阐明了植物种属间的亲缘进化关系,为其种质资源利用提供理论依据。利用该序列与原核表达载体pET32a连接构建融合表达载体pET-SAMS,酶切鉴定后转入大肠杆菌BL21,在不同温度下诱导3h后均表达出一63KDa大小融合蛋白。     

兜兰二氢黄烷酮醇-4-还原酶基因的克隆及其表达特性

克隆同色兜兰二氢黄烷酮醇-4-还原酶基因DFR,分析其序列特征,了解其在不同组织部位的表达情况。采用RT-PCR和RACE技术从花中克隆DFR的全长cDNA,用生物信息学方法分析序列特征,并用半定量RT-PCR研究其在不同组织的表达。分离到DFR,该cDNA全长1267 bp,具有1个1074 bp的完整开放阅读框,编码357个氨基酸。序列分析表明,该DFR蛋白含有1个NADB_Rossmann superfamily保守结构域,1个NADP(H)结合域和1个底物特异性结合域,其与文心兰、石斛兰和大花蕙兰等的DFR同源性在75%~80%。系统进化树显示,该DFR蛋白与兰科植物的DFR蛋白亲缘关系比较近。半定量RT-PCR表明,该DFR在成熟花和营养叶中的表达量最高,在子房、苞叶、萼片和花瓣中的表达量相当,在唇瓣中的表达量次之,在蕊柱中的表达量较唇瓣中的低,在花茎中的表达量最低,在根中几乎检测不到。原核表达结果表明,该DFR在大肠杆菌中获得表达。从兜兰中克隆到花色代谢途径中的关键酶基因DFR,该基因可能参与调控花色素的合成。     

姜荷花叶绿素降解酶基因PPH的克隆与生物信息学分析

为了获得姜荷花叶绿素降解的关键酶基因PPH信息,本试验在前期通过姜荷花全长转录组测序获得大量转录组信息的基础上,进行筛选分析,获得了2条PPH基因,分别命名为PPH1和PPH2。PPH1基因(GenBank:MT077178),cDNA序列全长1 795 bp,开放阅读框1 437 bp (138～1 574 bp),编码一条478 aa的氨基酸序列。PPH2基因(GenBank:MT077179),c DNA序列全长1 393 bp,开放阅读框1 227 bp (70～1 296 bp),编码一条408 aa的氨基酸序列。采用BLAST、Translate tool (ExPASy)、Clustal Omega、Find Conserved Domains(NCBI)、ProtParam、TMHMM Server、SOPMA、SWISS-MODEL、ClustalX (1.81)、MEGA 4.1等预测和分析了这2个基因编码蛋白氨基酸的一级结构(包括氨基酸序列的组成,保守区,理化特征等)、二级结构、三级结构及分子系统进化关系。PPH1和PPH2的核苷酸与蛋白氨基酸序列与其它物种的PPH基因都具有很高的同源性,两者都包含有水解酶(Hydrolase)特征PLN02578的保守区。分子系统进化分析表明,姜荷花的PPH1和PPH2聚为一小类,然后与小果野芭蕉PPH (XP_018677219.1)的亲缘关系最为接近,而与双子叶植物的关系较远。本研究为后期通过遗传转化手段改良姜荷花不育苞片的颜色提供了分子基础。     

桃果实乙烯反应因子PpERF1全长基因的克隆及序列分析

以成熟肥城桃果实的cDNA为模板,根据EST库中的核苷酸序列,设计2条特异引物分别与B26进行PCR扩增,结果得到了该基因下游包括3′ 端非编码区的765 bp大小的cDNA片段。PpERF1基因全长为1 263 bp,包含一个708 bp大小的完整开放阅读框(ORF)。序列分析表明,PpERF1与番茄、拟南芥、苹果和葡萄等在DNA结合功能域的约58个氨基酸中,同源性可达68.4%-100%,且在该区域中存在1个α-螺旋和3个反平行链构成的β-折叠结构。经同源性分析,该序列与拟南芥、葡萄、豌豆等植物的氨基酸同源性为58.8%～67.5%,属于同一类ERF家族成员。     

滇牡丹(Paeonia delavayi)二氢黄酮醇4-还原酶基因的鉴定及表达

为了研究二氢黄酮醇4-还原酶基因(DFR)对滇牡丹(Paeonia delavayi)花瓣中花色形成的作用,本研究采用RT-PCR技术首次从滇牡丹中克隆得到一个具有完整开放阅读框的二氢黄酮醇4-还原酶基因(PdDFR),生物信息学分析和转录模式分析显示,该基因全长1 050 bp,共编码349个氨基酸,其蛋白序列与黄牡丹(Paeonia lutea) DFR的蛋白序列具有99.00%的一致性。序列比对分析显示PdDFR基因存在一个由21个氨基酸组成的NADPH结合位点"VTGATGYIGSWLVKTLLERGN"。滇牡丹PdDFR蛋白与黄牡丹(Paeonia lutea, ALX35996.1)、蓖麻(Ricinus communis, XP015577076.1)、木薯(Manihot esculenta, XP021607-041.1)的DFR蛋白聚为一类;转录模式分析表明PdDFR基因在红色花瓣中有表达,在根、茎、叶中不表达。本研究通过对滇牡丹转录组数据的分析,分离并克隆得到PdDFR基因,为利用基因工程技术选育优良滇牡丹花卉品种提供理论参考。     

矮牵牛DFR-A基因的克隆与表达分析

通过分离矮牵牛DFR-A基因,研究其在不同部位的表达规律和酶活性变化,为花色素苷合成的结构基因分离及其他研究奠定基础。基于已公布的矮牵牛DFR序列,直接从矮牵牛花瓣中分离了DFRA基因序列,利用实时荧光定量PCR技术研究其在不同器官中的表达特性,同时测定了不同器官中的DFR酶活性。（1）矮牵牛DFR-A基因cDNA序列为1473 bp,该基因最大开放阅读框为1143 bp,编码380个氨基酸。（2）DFR-A基因在矮牵牛各种器官中均有表达,但不同组织中表达量存在差异,在花药中的表达量最高,其次是初开和盛开花瓣中,各期花蕾中的表达量都较低,而在叶中表达量最低。（3）DFR酶在叶片及花药中几乎无活性。在初开花瓣中达到最高峰。（4）除花药以外的部位,DFR酶活性与DFR mRNA浓度存在线性相关性。矮牵牛DFR酶活性主要受转录调控,活性在初开花瓣中最高。     

粉花石榴二氢黄酮醇还原酶基因cDNA片段的分离及鉴定

为了研究二氢黄酮醇还原酶（DFR）在石榴花色形成中的作用,根据GenBank中登录的相关物种DFR基因的保守序列设计简并引物,采用RT-PCR方法,从‘重瓣粉花’石榴花瓣总RNA中扩增出cDNA片段。测序结果表明,该cDNA片段长446 bp,编码148个氨基酸,序列分析表明,该片段与蓝灰石竹、水蓼、苦荞麦、荞麦、甜樱桃、金荞麦、菠菜、马六甲葡萄、山葡萄、马蹄纹天竺葵、仙客来等物种的氨基酸同源性在78%~81%以上,存在一个底物结合特异性决定的氨基酸基序“TVNVQPVQRPVHDETSWSDLDFVWAT”,说明已成功克隆到‘重瓣粉花’石榴DFR基因的cDNA片段,在GenBank中登录号为JN381544。     

虹鳟Hepcidin cDNA的克隆及序列分析

为了从虹鳟肝脏中扩增出Hepcidinc全长DNA序列,预测出氨基酸序列,并进行序列分析。通过RT-PCR和RACEPCR的方法,从虹鳟肝脏中克隆获得了Hepcidin全长cDNA序列,利用在线工具和软件包分析。结果表明:虹鳟Hepcidin全长cDNA序列(GenBank登录号HQ711993)为883bp,5’端非翻译区211bp,3’端非翻译区为405bp,以及一段267bp的编码序列,编码88个氨基酸,由信号肽(24个氨基酸)、原肽(39个氨基酸)和成熟肽(25个氨基酸)组成,成熟肽C端含有Hepcidin类抗菌肽的8个半胱氨酸保守性结构,可形成4个分子内二硫键。与已报道的鲑形目大西洋鲑Hepcidin氨基酸序列的一致性为93%,与其他鱼类Hepcidin氨基酸序列的一致性为44%~88%,是Hepcidin家族的新成员。     

巴西橡胶树钙调蛋白基因的克隆及表达分析

为了进一步研究橡胶生物合成的分子机制,根据巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）cDNA文库中的EST序列,利用cDNA末端快速扩增（RACE）技术分离了一个巴西橡胶树钙调蛋白基因,命名为HbCAM1。分析结果显示,该基因cDNA全长775 bp,含有完整的阅读框架,编码区为450 bp,编码149个氨基酸,5’非编码区26 bp,3’非编码区299 bp。通过序列比对以及结构预测分析,HbCAM1编码的氨基酸序列与蓖麻、毛葡萄、烟草、麻风树中相应基因氨基酸序列的一致性分别达到100%、100%、99%、99%。半定量RT-PCR分析显示,HbCAM1基因可能通过对相关代谢基因表达调节参与了乙烯利刺激橡胶树增产的分子调控。     

棉花恢复系中含有26S rRNA序列的GH18Rorf392基因克隆

 以Y18R×P30A杂交F₁代自交材料播种后根据雄蕊形态学判断其育性,然后分别提取可育和不育材料现蕾3～5 d的幼蕾总RNA。通过抑制差减杂交的方法获得来自棉花恢复系的EST序列之后,以该EST序列设计引物再做5’和3’RACE,从而获得其全长cDNA序列。由于该基因来源于陆地棉（Gossypium hirsutum）恢复系Y18R,并且编码392个氨基酸的蛋白质,因此,将其命名为GH18Rorf392。该基因的5’端是一个全新的序列,3’端含有26S rRNA序列。该基因可能对研究棉花育性相关功能有帮助。     

白菜型油菜DFR基因的克隆与序列分析

By using RACE (rapid amplification ofcDNA ends) based homologous cloning strategy, we have successfully isolated the genomic and full-length cDNA sequences of a gene encoding typical DFR (dihydroflavonol-4-reductase) from black-seeded Brassica campestris L. var. oleifera DC.. The gene, designated BcDFR here, is 1 722bp in length and harbors 5 introns with typical splice sites of plant DFR genes. BcDFR cDNA is 1311bp in length with a 1 158bp ORF as well as a 25bp 5‘ UTR and a 128bp 3‘ UTR. The encoded BcDFR protein is 385 aa with a calculated Mw of 42.85kD and a pI value of 5.55. The nucleotide and amino acid sequences of this gene share extensive homologies to plant DFR genes of wide origins especially high similarities to Cruciferous DFR genes. Sequence analyses such as phylogenetic analysis, conserved domain search and substrate specificity region detection all indicated that BcDFR gene is a quite potentially biofunctional gene. Its cloning enables us to further dissect the possible relatedness between DFR gene and Brassica seed coat color traits and to create transgenic novel yellow-seeded rapeseed germplasm through antisense- or RNAi-suppression of DFR gene expression in black-seeded elite cultivars.     

香蕉MaCSase基因的克隆和表达分析

旨在克隆香蕉(Musa acuminata L. AAA group cv. Brazilian)半胱氨酸合成酶(cysteine synthase, CSase)基因,并进行序列特征、器官表达特异性和逆境胁迫下表达特性分析。通过对香蕉根的cDNA文库的测序和分析,获得了一段香蕉半胱氨酸合成酶基因的片段,运用RACE扩增技术获得基因全长,命名为MaCSase,并进行序列分析,最后利用荧光定量PCR技术分析该基因在香蕉不同器官中的表达特异性及在外源胁迫下的表达特性。序列分析显示,该基因全长1367 bp,存在1个完整的开放阅读框1065 bp,编码355个氨基酸。通过和已知植物的半胱氨酸合成酶基因相比,同源性达到79%以上。其中与水稻、苜蓿、葱、玉米的CSase编码的氨基酸序列的同源性分别为86%、85%、84%、84%,器官特异性分析表明,MaCSase在香蕉的根、球茎、叶片、花和果实中均有所表达,其中在球茎中表达量最高。通过对其在高盐胁迫下的表达分析显示,该基因在香蕉根中的表达随着处理时间的增加呈现上升趋势,在胁迫6 h时被大量诱导。