盐胁迫下小麦叶片蛋白的双向电泳及图谱分析

本研究以河南省主导小麦品种周麦18为实验材料,利用氯化钠（NaCl）溶液模拟盐分胁迫,考察了NaCl胁迫对小麦种子萌发和幼苗生长的影响;对NaCl 胁迫下小麦幼苗生长和生理学相关指标进行了分析;并在此基础上建立小麦幼苗双向电泳技术和图像分析体系,对NaCl胁迫下的小麦幼苗进行差异蛋白质组学初步分析。结果表明：72小时1.0%氯化钠溶液胁迫下,小麦幼苗蛋白表达组发生了变化;其中共有332个点得到匹配,获得61个差异表达的蛋白点,29个表达量显著上调,32个显著下调。本研究探讨了有关双向电泳和蛋白图谱软件分析中存在的问题,为进一步研究打下良好基础。     

盐胁迫下棉花叶片差异蛋白表达的分析

以耐盐的陆地棉品种中07为研究材料,在其生长的三叶期,用未处理和0.4%NaCl胁迫处理24h的幼苗,分别提取其叶片全蛋白。通过等电聚焦和第二向SDS-PAGE技术获得完整的棉花叶片总蛋白图,利用ImageMaste-2DElite5.0软件分析各个差异蛋白在对照和0.4%NaCl胁迫24h后棉花叶片中的相对表达量,并选取质量好、实验重复性高的10个特异的差异表达蛋白质点进行基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOF/MS)鉴定。结果表明,从对照和盐胁迫处理的双向电泳图谱中共检测到24个差异蛋白质点,这些差异蛋白质点的等电点分布集中在5.0～6.5之间,分子量分布集中在40.0～110.0kD之间;进一步质谱(MALDI-TOF-TOF/MS)分析鉴定的10个差异蛋白质点,其中4个蛋白质点获得了鉴定结果,这4个差异表达蛋白质点分别为1,5-二磷酸核酮糖羧化/氧化激酶α2(编号4)、1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/氧化酶大亚基(编号5)、未知蛋白产物(编号19)和OEE2(编号32)。我们初步推测OEE2和1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/氧化酶可能与棉花耐盐胁迫特性有关。     

硝普钠和Ca2+对盐胁迫下棉花幼苗生长的影响

试验以抗虫棉99 B为材料,通过测定发芽率、幼苗叶片电导率、根系活力、POD酶活性和叶绿素、脯氨酸、丙二醛含量等相关指标,研究了硝普钠和Ca2+混合浸种对盐胁迫条件下棉花幼苗生长的影响。结果显示:硝普纳和Ca2+混合液浸种,显著提高盐胁迫条件下99 B棉花种子发芽率、幼苗根系活力、POD酶活性、叶绿素及脯氨酸含量,显著降低幼苗叶片的电导率及MDA含量。其中0.1 mmol/L硝普纳和5 mmol/L Ca2+混合浸种处理,对提高盐胁迫条件下棉花幼苗的抗性效果最佳。     

6-BA对养分胁迫下水稻幼苗根系生长影响的蛋白质组学分析

为了揭示养分胁迫下6-BA维持水稻幼苗根系生长的分子机理,本研究采用蛋白组学分析技术,对养分胁迫下6-BA培养的水稻幼苗根系的蛋白质组差异表达进行比较分析。经过双向凝胶电泳分离,从水稻幼苗根系中获得20 个响应6-BA的差异表达蛋白质,其中14 个蛋白质得到质谱鉴定,这14 个蛋白质按其功能可以分为四大类：包括7 个参与呼吸代谢的蛋白质,4 个参与生长发育的蛋白质,2 个参与逆境胁迫的蛋白质以及1 个未知功能的蛋白质。分析结果表明,养分胁迫下,6-BA诱导了根系中参与呼吸代谢及生长发育相关蛋白质的表达量上调,增强根系的呼吸作用,促进根系的生长。     

水稻根系对1,2,4-三氯苯胁迫的应答

应用蛋白质组学、电镜观察、脂质过氧化物测定等方法研究了二个不同类型水稻品种的根系对有机污染物1,2,4-三氯苯（TCB）胁迫的应答。结果表明,TCB胁迫抑制水稻根系生长,影响根细胞结构,导致脂质过氧化。TCB胁迫对水稻根系蛋白质组也有显著影响。TCB胁迫能诱导根系内不同类型蛋白质的表达,它们是：解毒酶（包括脂酶、醛/酮还原酶、谷胱甘肽-硫转移酶）,细胞壁物质代谢相关酶（包括蛋白转葡萄糖基酶、GDP-甘露糖-3,5-异构酶1）,激素代谢或调节相关酶（包括酸式-还原酮二加氧酶、β-葡萄糖苷酶、病程相关蛋白家族10中的2个不同蛋白）,原初或次生代谢相关酶（包括转录延长因子、细胞质磷酸丙酮酸双激酶、磷酸丙糖异构酶、丙氨酸氨基转移酶和异黄酮还原酶）。TCB胁迫诱导矮仔占根系中β-葡萄糖苷酶和病程相关蛋白家族10蛋白的表达,及汕优63根系中谷胱甘肽-S-转移酶和酸式-还原酮二加氧酶的表达,这种诱导蛋白的差异可能是汕优63较矮仔占对TCB胁迫有较高耐性的机理之一。     

NaCl胁迫对水稻品种中花11幼苗根系生长发育的影响

以水稻中花11幼苗为材料,探讨高浓度NaCl处理对其根系生长发育的影响。结果表明,200 mmol/L NaCl胁迫下,幼苗胚根生长受到抑制,不定根数目减少,根毛数量减少长度变短;幼苗根系出现褐化,且根系木质素含量增加,根系过氧化物酶(POD)活力显著上升;半定量RT-PCR检测显示,盐胁迫应答基因OsCDPK7表达显著下降,P 5 CS 1表达上升,OsHKT 1;5、OsNHX 1在处理初期表达上升,其后随处理时间延长而下降。     

拟南芥G蛋白α亚基GPA1互作蛋白铜离子结合蛋白AtBCB的鉴定及功能分析

拟南芥G蛋白复合体(异源三聚体包括α、β、γ亚基)参与植物多个信号转导途径,G蛋白复合体通过膜上的G蛋白偶联受体(GPCR)接受胞外信号后通过3个亚基将信号传递给下游效应器。目前,有关植物G蛋白复合体的效应器及其信号传递途径的报道较少,寻找新的G蛋白的效应器有助于阐明G蛋白复合体相关的信号传导途径。本研究以拟南芥G蛋白α亚基GPA1为诱饵蛋白,利用泛素分离系统筛选拟南芥cDNA文库,获得一个与GPA1互作的铜离子结合蛋白AtBCB。荧光双分子杂交(BiFC)试验证明,GPA1与AtBCB的互作发生在细胞膜上。基因表达特性分析结果显示,GPA1和AtBCB受金属铝胁迫的诱导表达。进一步以野生型拟南芥(WT)、GPA1拟南芥突变体gpa1-4和AtBCB拟南芥突变体bcb为材料,研究该基因对植物耐金属铝胁迫的功能,结果显示,在无胁迫情况下,2个突变体和WT根部的丙二醛含量无显著差异;在100 µmol L^–1 Al³⁺处理下,gpa1-4突变体根部丙二醛含量显著(P<0.05)低于WT低;bcb根部丙二醛含量极显著(P<0.01)高于WT。对3个铝胁迫响应基因(苹果酸转运体基因AtALMT1、半类型ABC转运蛋白基因ALS1和ABC转运蛋白基因ALS3)的表达进行Real-time PCR分析,比较它们在突变体和野生型之间的表达差异,发现在有铝和无铝处理情况下,ALS1和ALS3的表达水平在突变体和WT间均无显著差异;在铝处理下,gpa1-4中AtALMT1的表达量极显著高于WT;在bcb中的表达量显著低于WT。以上结果表明,植物通过细胞膜上的G蛋白α亚基GPA1和铜离子结合蛋白AtBCB的相互作用调控下游基因AtALMT1的表达,参与植物对铝胁迫的响应,其中GPA1对铝胁迫耐受起负向作用,AtBCB对铝胁迫耐受起正向作用。     

梭梭HaNAC1基因的亚细胞定位、转录激活及表达分析

HaNAC1为本课题组前期从梭梭幼苗中克隆得到的一个NAC家族(ATAF亚家族)转录因子编码基因,本研究将对该基因进行进一步的活性验证和功能分析。通过烟草叶片细胞中的绿色荧光蛋白瞬时表达系统对表达蛋白进行亚细胞定位,结果表明HaNAC1蛋白位于细胞核中。构建AH109酵母pGBKT7-HaNAC1表达载体,证明该转录因子在酵母中具有转录激活活性。利用实时荧光定量PCR方法测定HaNAC1在盐、旱胁迫条件下的表达水平,结果显示该基因的表达量与盐胁迫的浓度呈现正相关,表明HaNAC1参与调节梭梭的盐胁迫响应。本研究探索了HaNAC1的定位和表达,为梭梭抗逆体系的功能基因挖掘及胁迫应答机理提供科学依据。     

一氧化氮和亚甲基蓝对盐胁迫抗虫棉根系的抗氧化能力的影响

 通过检测抗氧化酶活性和抗氧化物含量,研究一氧化氮和亚甲基蓝对盐胁迫抗虫棉根系的抗氧化能力的影响。在正常条件和盐胁迫条件下分别用一氧化氮和亚甲基蓝处理抗虫棉幼苗,检测抗坏血酸(ASA)含量、抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性、谷胱甘肽还原酶(GR)活性、谷胱甘肽(GSH/GSSG)值、脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)活性、单脱氢抗坏血酸还原酶(MDAR)活性,并作对比。结果表明：正常生长条件下添加NO能促进棉花幼苗生长,而添加亚甲基蓝(MB)显著抑制抗虫棉幼苗的生长;添加NO显著缓解了盐胁迫对棉花幼苗生长的抑制,提高了根系的抗氧化能力,盐胁迫下添加NO的同时添加MB可不同程度地降低以上抗氧化物质含量和抗氧化酶活力,解除NO对盐胁迫的促长作用。     

甘蔗ATP柠檬酸裂解酶基因的克隆与表达分析

ATP柠檬酸裂解酶(ACL)为细胞质中乙酰辅酶A合成途径的关键调控酶,在生物体正常生长发育中扮演着重要角色。本研究通过Race和电子克隆技术获得编码甘蔗ACL蛋白2个亚基的基因SoACLA-1和SoACLB-1,其编码框长度分别为1 272 bp和1 827 bp,编码423个和608个氨基酸,推测的氨基酸序列与其他物种具有高度相似性,都优先与禾本科植物聚于同一进化分支。2个基因在ATP-grasp功能域、柠檬酸结合位点、组氨酸磷酸化位点和ATP结合、CoA结合、磷酸化区域等,序列高度保守。实时荧光定量PCR结果表明,2个基因均受外源ABA、水分胁迫、水分胁迫加ABA处理诱导表达,且叶中表达量显著高于根系,其中又以水分胁迫处理下的表达量最高,2个基因表现出协同表达模式。SoACLA-1和SoACLB-1的表达与ABA、ROS含量具有相关性,说明它们可能参与了ABA调控的植物对逆境胁迫反应的代谢过程。     

低温胁迫对燕麦种子萌发期蛋白质组影响的研究

为探析燕麦种子萌发时蛋白质的差异表达及其相关蛋白的生理功能,采用室内生测法比较了不同温度下种子萌发力和幼苗的生长能力,同时采用双向电泳(2-DE)结合基质辅助激光解析飞行时间质谱的方法,比较低温条件下(5℃)吸胀25 h和128 h(萌发)与正常温度下吸胀25 h(萌发)时种子蛋白质组的差异表达.结果表明,随着温度的降低,燕麦种子的萌发活力降低.燕麦种子蛋白质组在低温胁迫下萌发时,有7个蛋白质点发生了变化,其中5℃低温吸胀25h时,有3个蛋白质点的表达量降低;5℃低温吸胀萌发128h时,有5个蛋白质点表达发生了改变,其中3个蛋白质点的表达量增加.经MALDI-TOF质谱鉴定分析和Mascot搜索NCBI非冗余数据库,确定了4个蛋白质,分别为燕麦蛋白、燕麦蛋白N9和丝氨酸蛋白酶抑制剂等.这些蛋白质的质量变化与燕麦种子萌发时的低温胁迫可能有关联.     

盐碱胁迫对海岛棉种子萌发及幼苗根系生长的影响

为明确海岛棉种子萌发及幼苗根系对盐胁迫的响应,并筛选出耐盐能力较高的海岛棉品种。以新疆阿克苏地区主推海岛棉品种新海31号、新海35号、新海43号和新海48号为试材,采用NaCl、Na2SO4以及NaCl、NaHCO3以物质的量1∶1混合分别模拟中性盐混合盐(中性盐)和碱性盐混合盐(碱性盐)两种盐类型,胁迫处理总盐浓度(Na+)为0、120、180、240、300、360 mmol L~(–1),研究了盐胁迫下海岛棉种子萌发和幼苗根系生长参数。结果表明,在两种盐类型下,随着盐浓度的增加,海岛棉种子的萌发参数、生物量、根冠比、盐敏感指数、盐耐受指数、根系长度、根系表面积及根系体积均呈下降趋势;高盐浓度下,海岛棉株高、根系生物量及茎叶生物量与盐浓度呈显著负相关,说明高盐环境抑制了棉种发芽及幼苗的正常生长。120 mmol L~(–1)浓度下,中性盐处理的新海48号的根系总长度比对照无显著增加,其余品种均有显著增加,各品种根系总体积与总表面积均无显著差异,低盐促进了各品种细根(d≤0.5 mm)的伸长及生长,新海43号的中根(0.5d≤2.0 mm)长度比CK增加显著,导致此品种根系的总体积与总表面积有显著增加;碱性盐处理的根系总长度、表面积及体积除新海31号与对照差异不显著外,其余品种均有显著降低。180～240mmolL~(–1)浓度下,中性盐处理的根系总长度、表面积及体积与对照相比除新海43号有显著下降外,各品种均差异不显著;碱性盐处理的各品种均是下降显著,其中新海35号的根系总长度下降幅度比其余品种缓慢。300～360mmolL~(–1)浓度下,两种盐处理的各品种的根系总长度、体积与表面积均急剧下降。碱性盐胁迫比中性盐胁迫下降的趋势更为显著。本试验条件下,海岛棉幼苗正常生长所能承受的盐浓度为240 mmol L~(–1),但碱性盐对于海岛棉幼苗的伤害远大于中性盐,供试品种耐盐碱程度为新海35号新海43号新海31号新海48号。     

赤霉素对盐胁迫抑制水稻种子萌发的缓解作用的蛋白质组分析

用粳稻日本晴(Oryza sativa L. cv.Nipponbare),研究了盐胁迫对水稻种子萌发的抑制作用和赤霉酸(GA₃)对盐胁迫的缓解作用;分别以H₂O (对照）,5 g L^-1 NaCl (处理I),5 g L^-1 NaCl + 100 μmol L^-1 GA₃(处理II)培养水稻种苗48 h,提取芽中的蛋白质,利用双向电泳(2-DE)和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术分析了水稻蛋白质组的变化。结果表明,在盐胁迫条件下,日本晴种子的萌发显著受到抑制,而GA₃能显著缓解这种抑制作用;用ImageMaster软件分析2-DE凝胶,发现有4个蛋白质斑点表现出显著的变化,在盐胁迫下斑点S1、S2和S3表达下调而斑点S4消失,在GA₃与盐共处理时,这4个蛋白质点的表达均有不同程度的恢复;经MALDI-TOF MS分析,其中2个蛋白质斑点(S1,S3)分别被鉴定为isoflavone reductase-like蛋白与葡萄糖磷酸变位酶,这些蛋白可能与GA₃提高水稻耐盐性途径相关。     

Chilling Stress Accelerates Degradation of Seed Storage Protein and Photosynthetic Protein during Cotton Seed Germination

Low temperature is one of the major abiotic stresses limiting the productivity and geographical distribution of many important crops. To gain a better understanding of chilling stress responses in cotton ( Gossypium hirsutum L . ), we carried out a comparative proteomic analysis. Cotyledon proteins of 1-week-old cotton seedlings treated with or without chilling treatment at 4 °C were extracted, separated by a two-dimensional gel electrophoresis and compared. Among 1500 protein spots reproducibly detected on each gel, 25 protein spots were down-regulated and 29 were up-regulated. Seven cotton proteins were identified by mass spectrometry analysis as beta-globulin A precursor fragments. One was identified as a Rubisco large subunit fragment, providing evidence of both seed storage protein and photosynthetic protein destruction by chilling stress. The related physiological and biochemical analysis showed that there was a significant increase in endopeptidase activity and activated oxygen generation rate, and an obvious decrease in carboxylation efficiency and maximum net photosynthetic rate of cotton seedlings under chilling stress. Based on the above results, the degradation mechanisms of beta-globulin and Rubisco under chilling stress were discussed. In conclusion, our study provides new insights into chilling-stress responses in cotton and demonstrates the advantages of proteomic analysis.     

Ionic Homeostasis and Expression of Na+ Related Genes of Cotton under Different Salt and Alkali Stresses

[Objective] Maintaining intracellular ion homeostasis is one of the important salt-tolerant mechanisms of crops. This study aims to analyze differences in response characteristics of cotton ionome and salt-tolerant gene expression under different saline-alkali stresses, which provides a basis for understanding the mechanism of salt tolerance and improving salt tolerance of cotton. [Method] Using Lumianyan 24 as the experimental material, three kinds of salt and alkali stress types (salt stress, alkali stress, and mixed salt-alkali stress) and two concentration gradients (low and high concentrations) were set under pot cultivation conditions. Meanwhile, non-saline-alkali stress treatment was set as control. The dry matter weight of cotton plants and root morphological parameters including root length, root surface area, and root volume were measured in this study. The concentrations of 13 elements such as P, Na, K, Ca and Mg in different organs of cotton plants were determined by inductively coupled plasma atomic emission spectrometry (ICP-AES). The relative expressions of salt tolerance related genes GhDFR1, GhSOS1, GhNHX1 and GhAKT1 were determined by the quantitative real-time polymerase chain reaction method. [Result] 1) Salt and alkali stresses significantly inhibited cotton growth. The growth inhibition rate of cotton under mixed salt-alkali stress treatments (48.7%–57.9%) was significantly higher than that under salt stress (27.6%–49.9%) and alkali stress (21.2%–35.5%) treatments. Under salt stress and mixed salt-alkali stress treatments, both shoot and root growth of cotton were significantly inhibited, dry matter weight, root length, root surface area and root volume were significantly reduced, while root growth was less inhibited under alkali stress treatments. 2) Under three types of saline-alkali stresses, Na content and Mo content in different organs of cotton plant increased significantly, but N content in leaves and roots decreased. 3) Under salt stress treatments, the uptake of Ca, Mg, Fe, Mn and Zn in cotton was inhibited, and the ion balance was maintained by promoting the transport of these ions and P, K. 4) In addition to Ca, Mg, Fe, Mn and Zn, P uptake was also inhibited under alkali stress treatments, but K uptake and P, K, Ca, Mg, Fe, Mn and Zn transport were promoted. 5) Under mixed salt-alkali stress treatments, especially under high salinity and pH conditions, most of nutrients uptake was inhibited, and the transport capacity of Ca, Mg, Zn, Mn and Fe was reduced. 6) The relative expression of GhSOS1 and GhAKT1 genes increased significantly under salt stress treatments, but increased first and then decreased under alkali stress and mixed salt-alkali stress treatments. The relative expression levels of GhSOS1 and GhAKT1 genes under three types of saline-alkali stresses were alkali＞salt＞mixed saline-alkali stress. With the increase of soil salinity and pH value, the relative expression of GhNHX1 gene increased first and then decreased. The expression levels of GhNHX1 gene were salt＞alkali＞mixed salt-alkali stress. [Conclusion] Due to high salinity and pH value, mixed salt-alkali stress significantly inhibits cotton growth and ions uptake, which restricts the transport of P, K, Ca, Mg, Zn, Mn and Fe. The decrease of K and Na regulation ability leads to ions imbalance.     

冠菌素对棉花幼苗盐害的缓解效应

 以转基因抗虫棉(Gossypium hirsutum L.)中棉所45为材料,通过水培试验研究了冠菌素对盐胁迫下棉花萌发出苗和幼苗生长的影响。结果表明,盐胁迫严重抑制棉花种子萌发和幼苗生长,且对地上部的抑制程度大于对根系的抑制。盐胁迫对棉花萌发出苗和幼苗生长的抑制程度能被0.01 μmol·L^-1 的冠菌素缓解。苗期盐胁迫21 d内,冠菌素处理的棉花根、茎和叶的生物积累量较未施加冠菌素的盐处理增加1倍;活体组织化学原位检测结果显示,低浓度冠菌素处理降低盐胁迫诱导的主根H₂O₂含量。上述研究结果说明低浓度的冠菌素能提高棉花萌发出苗和苗期的耐盐性。