棉花根系总蛋白质提取及双向电泳方法的改良

对棉花根系蛋白的双向电泳提取技术进行改良,以获得更好的分离效果,为棉花根系蛋白质组学研究奠定基础。以鲁棉研28为材料,分别采用TCA/丙酮法、改良TCA/丙酮/SDS法、饱和酚-甲醇醋酸铵法这3种根系蛋白质提取方法,提取棉花幼苗根系总蛋白,并进行双向电泳进行蛋白质分离。在蛋白质含量、蛋白纯度和电泳图谱等方面对3种方法进行比较。利用饱和酚-甲醇醋酸铵提取法提取的棉花根系蛋白,其蛋白样品纯度高,SDS-PAGE电泳图谱清晰,蛋白点数量最多为601个点;TCA/丙酮法提取得到的蛋白总量最高约为7.53 mg/g,但样品纯度低,SDSPAGE电泳图谱模糊,蛋白点数量最少为417个点。采用考马斯亮蓝染色,上样量为1 500μg获得的凝胶图谱效果较好。总之,适合棉花根系蛋白质提取的方法为饱和酚-甲醇醋酸铵法,在考马斯亮蓝染色蛋白质上样量为1 500μg时能获得优良的分离效果。     

适合双向电泳的植物全蛋白提取方法比较

样品处理是双向电泳实验最基础也是最关键的环节之一,样品制备成功与否直接关系到双向电泳图谱的质量和蛋白质组信息的完整性。应用于双向电泳中提取植物全蛋白的常用方法有：TCA-丙酮沉淀法、Tris-HC1法、酚法、Trizol沉淀法、Tris-丙酮-酚法、尿素/硫脲提取法。不同的方法适合不同特征的植物样品,比较了用于双向电泳的六种植物全蛋白提取方法的优缺点,并对每种方法适用的植物组织作了简要概述。     

适用于蛋白质组分析的粉红单端孢菌蛋白提取方法的建立

为了优化一种适用于粉红单端孢菌双向电泳的蛋白质提取方法,以期为蛋白质组学水平研究粉红单端孢菌的致病机制奠定基础。以分离纯化后的粉红单端孢菌为试验材料,分别采用超声-TCA-丙酮、超声-磷酸-TCA-丙酮、超声-SDS、超声-TCA/丙酮-酚/SDS联合抽提和TCA/丙酮-酚/SDS联合抽提等5种方法提取菌体蛋白质,通过对比分析蛋白质含量以及纯度筛选出2种较好的提取方法。在筛选聚丙烯酰胺电泳凝胶浓度的基础上,再通过双向电泳对比分析,得出最佳的蛋白质提取方法。结果表明,12%的聚丙烯酰胺凝胶浓度获得的单向电泳图谱背景清晰且无严重的拖尾现象,超声-TCA/丙酮-酚/SDS联合抽提法获得蛋白样品的质量浓度和含量分别为6.650 mg/mL和2.993 mg/g,该法提取蛋白通过SDS-PAGE分析条带清晰,双向电泳分析可获得1 238个独立清晰的蛋白点。由此可知,超声-TCA/丙酮-酚/SDS联合抽提法获得的粉红单端孢菌体蛋白适合于双向电泳分析及蛋白质组学研究。     

玉米叶片2种总蛋白质提取方法的比较

为比较不同方法提取的玉米叶片蛋白质对双向电泳效果的影响。采用TCA-丙酮沉淀和TRIzol试剂盒2种方法,提取国审玉米品种郑单958叶片全基因组蛋白质,并对提取的蛋白质样品进行双向电泳。结果表明:TCA-丙酮方法提取的蛋白质一向水平聚焦电压上升缓慢且达不到程序设置的电压,而TRIzol试剂盒方法实时监测图与程序设置图相吻合;对电泳胶图分析后可知,TRIzol试剂盒法分离出的蛋白点多于900个,低丰度蛋白质得到充分显现,大多数蛋白点分子量为20~80 k Da,p H值为4~7,蛋白点的形状较规则;TCA-丙酮沉淀法分离出的蛋白点仅有350个,表明样品中蛋白质分离种类较少,高丰度蛋白质过度显现,低丰度蛋白质检出率大大降低。     

圆果种黄麻功能叶总蛋白提取方法及双向电泳体系的优化

蛋白质提取方法和电泳条件是蛋白质组学研究中双向电泳的关键。本文初步建立起一套适合圆果种黄麻功能叶总蛋白双向电泳(2-DE)分析的高效提取方法及电泳条件,在双向电泳技术中,比较了TCA丙酮、Tris-base/丙酮、Tris-HCl的蛋白提取方法,并优化了上样量和样品制备方法。结果表明, TCA丙酮法提取蛋白质产量高,达79.0 mg g^–1,比Tris-base/丙酮法和Tris-HCl的产量分别高出44.2%和114.1%。该法得到的2-DE图谱背景清晰,蛋白点数最多,约602个,较其他两种方法更适合用于黄麻功能叶总蛋白双向电泳分析;350 mg为最佳上样量。这为黄麻蛋白质组学后续研究奠定了基础。     

玉米蛋白质组研究中双向电泳技术条件的优化

为了优化玉米叶片双向凝胶电泳技术条件,通过比较3种总蛋白提取方法对玉米双向电泳结果的影响,并对蛋白质上样量、IEF等电聚焦条件及SDS-聚丙烯酰胺凝胶浓度等参数进行探索、优化;结果发现,与酚提取法和磷酸缓冲液法相比,采用改进的TCA/丙酮法提取总蛋白操作简单、方便,所得的2-DE图谱中蛋白质点数量多、背景清晰,是一种适用于提取玉米苗期叶片总蛋白的有效方法;同时筛选出:第一向IEF等电聚焦样品上样量为800μg,聚焦条件为20 000 V/h,在浓度为12.5%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳,能够在17 cm的IPG胶条上获得背景低、分辨率较高、重复性好的双向电泳图谱,该优化体系适用于玉米叶片蛋白质组双向电泳分离,对玉米蛋白质组学研究具有重要参考价值。     

叶用莴苣幼苗幼叶总蛋白SDS-PAGE和Western-blot方法的优化

为建立一套适合叶用莴苣(Lactuca sative L.)热激蛋白研究的SDS-PAGE和Western-blot方法。以叶用莴苣W7为材料,采用改进的TCA/Acetone法提取叶片蛋白,比较了两种电压下SDS凝胶分离蛋白质的效果,使用4℃保存两周的抗体稀释液并且得到了较清晰的热激蛋白70和内参蛋白Rubisco条带,初步确定了叶用莴苣叶片热激蛋白的western-blot实验条件。     

向日葵幼苗全蛋白提取及双向电泳技术体系的建立

本研究以向日葵幼苗为材料,比较TCA-丙酮提取法、Tris饱和酚提取法以及水溶法三种提取蛋白的方法,并且对双向电泳技术进行研究,初步建立向日葵幼苗蛋白的双向电泳体系。研究结果表明,用Tris饱和酚提取法提取蛋白含量最高,经蛋白定量后显示含量可达43.359 ug/u L;用不同浓度分离胶进行SDS-PAGE凝胶电泳,结果显示用8%分离胶可分离条带数较多,最多可分离20条蛋白条带;用不同聚焦时间以及不同上样量进行双向电泳,结果显示一向IEF聚焦时间为6 h左右,上样量为1 mg的条件较为适合,用Image Master5.0软件分析检测到蛋白点为102个。     

绿盲蝽取食诱导赤霞珠冬芽全蛋白双向电泳体系的建立与优化

建立绿盲蝽取食胁迫下赤霞珠冬芽防御反应的蛋白质组学双向电泳技术体系,旨在为后续筛选和分析差异蛋白相关研究提供参考。选取赤霞珠葡萄冬芽,分别设置绿盲蝽取食胁迫和空白对照试验,于24 h后采集样品用液氮带回,-80℃冻存;利用TCA-丙酮法、TCA-丙酮法+酚抽提法提取粗蛋白干粉;利用CBB G-250染色法进行蛋白质浓度测定;确定上样量及凝胶染色技术。扫描得到凝胶图像,进行对比分析。结果显示,利用不同蛋白质提取方法均可获得双向电泳所需粗蛋白,采用TCA-丙酮法获取的粗蛋白量明显多于TCA-丙酮法+酚抽提法;2种方法所提取的全蛋白浓度差异较大,TCA-丙酮法操作更为简便,蛋白丢失少。不同上样量对双向电泳图谱效果的影响差异显著,400μg蛋白上样量比800μg所得的凝胶图片上的蛋白点清晰,易于分离。考马斯亮蓝染色结果表明,R-350更适用于葡萄冬芽全蛋白双向凝胶电泳技术。利用TCA-丙酮法抽提蛋白,400μg蛋白上样,pH值4～7 NL 17 cm的IPG胶条,G-350热染色双向电泳技术体系得到的赤霞珠冬芽全蛋白凝胶图谱,符合绿盲蝽取食诱导赤霞珠防御反应产生防御蛋白的检测要求。     

苹果叶片蛋白质双向电泳样品制备方法的比较

为探索适用于苹果叶片蛋白质组学研究的样品制备方法,比较了三氯乙酸/丙酮沉淀法（TCA）、酚-甲醇/醋酸铵沉淀法和Tris-HCl提取法等3种总蛋白质的提取方法。制备的样品经双向电泳分离采用银染显色。结果3种方法分别得到450、374和1032个蛋白质点。认为Tris-HCl提取法为最适方法,所得图谱背景清晰,蛋白质信息量最大。     

鸭沙门氏菌鞭毛抗原的提取与抗原性鉴定初报

【研究目的】提取沙门氏菌鞭毛蛋白并鉴定其抗原性;【方法】选用鸭沙门氏菌经半固体培养基诱导鞭毛,经肉汤培养后,用酸裂解、经差速离心、硫酸铵沉淀,分离出粗制鞭毛蛋白。将粗制的鞭毛蛋白用SDS-PAGE和磷钨酸负染投射电镜观察,并包板做ELISA检测其抗原性;【结果】SDS-PAGE显示提取的鞭毛蛋白相对分子质量约为58.0 KD,且纯度较高,抗原性较好,每1000 ml培养液可获得32.8mg鞭毛蛋白;【结论】酸裂解法可获得高质量的鞭毛蛋白,抗原性较好,为禽副伤寒沙门氏菌病诊断方法的建立奠定了基础。     

发酵型金耳多糖的分离纯化及其降血糖活性

【目的】研究发酵型金耳多糖(FTAP)的分离纯化方法及其降血糖生物学活性;【方法】比较沸水煮提法和碱水热提法的差异,确定FTAP的提取工艺。Sevage法除蛋白,利用sephadex G-75凝胶柱层析进行分离纯化。采用四氧嘧啶诱导的高血糖大鼠模型,灌胃给药,监测血糖,测定脂代谢指标,对FTAP进行降血糖活性评价。【结果】沸水煮提法最大多糖得率为15.5%,碱水热提法最大多糖得率为14.9%,选择沸水煮提法为制备FTAP的方法。利用sephadex G-75凝胶柱层析得到单一对称洗脱主峰,表明得到的FTAP为均一多糖。连续口服FTAP 7天时,44mg/kg•d和264mg/kg•d剂量组小鼠与模型组空腹血糖比较降血糖作用明显,血清甘油三酯水平也显著下降。【结论】FTAP可降低高血糖模型小鼠的高血糖水平。     

白僵蚕高效毛细管电泳指纹图谱研究

【研究目的】采用高效毛细管电泳法(HPCE)建立白僵蚕的指纹图谱。【方法】：电解质溶液由以10mmol/L磷酸二氢钠-20mmol/L的硼砂溶液(pH8.62)作缓冲液，在25℃，20kV的压力下进行电泳，201nm波长处检测，线性关系良好，在25min内完全分离。【结果】：上述条件下，白僵蚕成分得到了较好的分离，方法学考察结果符合定量测定和定性研究的要求。【结论】：该方法具有较好的分离效果和良好的精密度，可考虑作为白僵蚕的质量控制方法     

清远市郊菜地土壤营养和叶菜产量状况及施肥建议

摘要：【研究目的】通过调查清远市郊蔬菜地养分状况,为叶菜生产提供科学的施肥依据,【方法】2008年10月-11月采用均匀布点随机抽样的方法,采集了市郊的7个区点的土壤样品,按照国家土壤营养成分测定标准方法,测定了土壤的主要营养成分和pH值。按当地菜农施肥量的1/4量分期施肥,盆栽小白菜、生菜和油麦三种叶菜,并称取各自的经济产量。【结果】结果显示,土壤整体肥力接近华南地区的水平,属于低肥力菜地,各点土壤的碱解氮、速效磷、速效钾和有机质含量和叶菜产量差异程度很大,氮、磷、钾的比例明显失调。【结论】测土配方合理施肥对于清远市蔬菜生产具有重要的意义。     

15种蔬菜营养成分评价

【研究目的】通过对河北省15种蔬菜品种的营养成分进行分析测定,为人们日常的膳食结构提供科学的依据。【方法】试验采用室内测定的方法测了土豆、胡萝卜、豆角、番茄等15种蔬菜的矿质元素、蛋白质和维生素C含量测定。【结果】在这15种蔬菜中茴香蛋白质含量最高(7.77g/100g·FW),苦瓜中维生素C含量最高(106.52 mg/100g·FW),钙含量最高为油菜(6.72g/100g·DW),胡萝卜镁含量最高(56.09mg/100g·DW),黄瓜铜含量最高(1.84mg/100g·DW),锌含量最高是莴苣(8.86mg/100g·DW)。【结论】所测定15种蔬菜的蛋白质、镁、铁、锌不能满足人体的日常需求,但油菜(6.72g/100g DW)、黄瓜(2.03 g/100g DW)、芹菜(2.95 g/100 DW)含钙量较高,可以满足人体的需要。     

水果中8种外源性植物生长调节剂的液相色谱-串联质谱测定

摘要：【研究目的】建立水果中8种外源性植物生长调节剂乙烯利、丁酰肼、抑芽丹、赤霉素、玉米素、氯吡尿、矮壮素、α－萘乙酸的液相色谱-串联质谱测定方法。【方法】样品制备后,采用乙腈提取,经过certify Ⅱ固相萃取柱净化处理后,采用LC-MS/MS由电喷雾(ESI),多反应监测（MRM）,负离子模式检测（其中矮壮素是正离子模式）,外标法定量。【结果】在2.0～100.0?g/L范围内,8种植物生长调节剂的回收率在70.0～101.0%,相对标准偏差（RSD）均在10%以内。【结论】所建立的方法简便快捷,可满足检验检疫实际需求。     

藏灵菇源嗜热链球菌Tx菌株胞外多糖的纯化研究

摘 要：【研究目的】本文为了获得藏灵菇嗜热链球菌Tx菌株胞外多糖(EPS)的纯品,探索了EPS粗品的纯化方法;【方法】利用Sepharose CL-6B进行凝胶分级纯化,并对EPS纯品采用紫外全波长扫描、凝胶色谱鉴定及EPS纯度测定;【结果】最佳纯化条件：采用0.05～0.06 mol/L氯化钠溶液梯度洗脱,流速为0.25 mL/min,样品上样浓度为1.0 mg/mL,上样量为1.0 mL;【结论】在最佳纯化条件下得到的EPS纯度为98.01%,是纯化前的1.4倍,为今后进一步研究EPS结构与功能提供了实验基础。     

棉花株高动态模拟与预测方法初探

【研究目的】为棉花高产栽培提供科学、实用的株高动态模拟模型、诊断指标和预测方法。【方法】分别采用传统的日期-株高法和创新的叶龄-株高法、叶龄-相对株高法对两年6点棉花超高产试验中的株高资料进行统计分析。【结果】与传统方法相比,叶龄-相对株高法模拟精度高,适用范围广;用此法所制定的株高诊断指标,有广泛的适用性和灵活性;根据该方法提出的株高预测方法,简便、实用、可靠。【结论】叶龄-相对株高法不仅适用于对棉花株高的模拟、预测和诊断指标的制定,也可在其它作物上试用。     

不同加工处理大豆对瘤胃干物质消化率及活体外瘤胃发酵参数的动态影响研究

(目的)本文旨在研究不同加工处理大豆对瘤胃干物质消化率及活体外瘤胃发酵参数的动态影响。（方法）以豆粕、膨化全脂大豆和焙烤大豆为试验材料,利用活体外人工瘤胃产气量法,模拟奶牛TMR(DM)条件下研究不同添加水平(0、5、10、15、20%)对反刍动物活体外产气量、活体外干物质消化率及瘤胃发酵参数的影响。（结果）结果表明：（1）同一原料不同梯度之间,膨化全脂大豆24h产气量在10%添加量最小,与对照组差异显著（P＜0.05）;（2）10%、20%豆粕添加组乙酸含量、乙:丙比例与对照组差异显著（P＜0.05）;（3）豆粕与焙烤大豆24h DMD呈逐步增加的趋势,10%添加组与0%、5%添加组差异显著,膨化全脂大豆DMD呈倒抛物线,在15%添加量时最低,与对照组及5%添加组差异显著;（4）膨化全脂大豆理论最大产气量10%添加组与对照组差异显著,继续增加添加量差异不显著,产气速度在10%添加组最低,与对照组及其它试验组相比差异显著。（5）不同原料相同梯度之间,当添加量达到10%后,乙:丙比例发生显著变化（P＜0.05）,豆粕与膨化全脂大豆、焙烤大豆间乙:丙比例呈相反的变化趋势。15%添加组乙:丙比例最低,（结论）说明膨化全脂大豆与焙烤大豆以15%添加比较合适。     

乐果液相色谱与气相色谱检测方法的比较

摘 要：【研究目的】通过应用液相色谱法（HPLC）和气相色谱法（GC）对乐果测定的参数进行比较,为乐果检测方法的选择提供参考。【方法】分别应用气相色谱和高效液相色谱法对乐果检测条件进行优化,对这两种测定方法的灵敏度、线性相关性、稳定性及添加回收率的等参数测定结果进行比较。【结果】用液相色谱法测定乐果最低检测限为0.01mg/L,比用气相色谱法（最低检测到0.1mg/L）测定时有更高的灵敏度;HPLC检测（r＝0.9990）较GC（r＝0.9937）有更好的线形相关性;在乐果浓度低于0.1mg/L时,用液相色谱法对乐果进行测定有很好的稳定性,在浓度高于0.1mg/L,两种测定方法的稳定性相当。【结论】用液相色谱法测定乐果完全可以达到农药登记残留试验准则的要求,它比气相色谱法更适合乐果的微量及常量的检测。