割手密2个DREB2基因的克隆与比较分析

干旱应答元件结合蛋白(dehydration responsive element binding protein,DREB),在植物应对干旱、盐碱和低温胁迫的反应中起非常重要的调控作用。利用已知的甘蔗栽培种DREB2转录因子序列,设计引物,按照同源克隆的方法,获得了2个割手密DREB2基因组DNA序列,分别命名为Ss DREB2-a和Ss DREB2-f(Gen Bank登录号分别为:KU963272和KU963277)。序列分析结果表明,Ss DREB2-a基因序列全长为1 578 bp,Ss DREB2-f基因序列全长为1 729 bp,2个基因均包含1个内含子和2个外显子。Ss DREB2-a和Ss DREB2-f基因的c DNA序列全长分别为824 bp和971 bp,均编码262个氨基酸。序列比对分析显示,2个基因的序列相似性为96.6%,编码的蛋白相似性为98.9%,存在3个氨基酸变异位点。系统进化分析结果显示,割手密DREB2转录因子与高粱、牛鞭草、斑茅、玉米等植物的DREB2转录因子的同源关系最近。基因的获得为下一步了解DREB2基因表达与割手密抵御非生物胁迫能力之间的关系奠定了基础。     

割手密过氧化氢酶基因（Ss CA T-1）的克隆与比较分析

割手密是栽培种甘蔗最重要的近缘物种之一,具有较强的抗逆性。本研究以高粱过氧化氢酶基因(NCBI登录号为XM002437586.1) cDNA序列为探针,对甘蔗EST数据库进行同源检索、筛选和拼接,后经基因组PCR、分子克隆、序列分析验证成功分离了2个割手密过氧化氢酶基因cDNA序列(Ss CA T-1c和Ss CA T-1d, GeneBank登录号为KF864229和KF864230)。2条序列全长均为1532 bp,包含10 bp的5'非翻译区(UTR)和43 bp的3'UTR,以及一个1479 bp的开放读码框,编码492个氨基酸,此蛋白序列具有过氧化氢酶保守结构域,属于CAT家族。2条序列之间相似性为99.2%,存在12个单核苷酸多态性(SNP)位点,蛋白相似性99.0%,存在5个氨基酸变异位点。将推测的SsCAT-1c和SsCAT-1d蛋白序列与高粱、水稻、玉米等物种进行同源进化分析,均表现出极高的保守性。研究结果能对今后深入了解甘蔗及其近缘材料CAT基因家族的信息提供帮助,从而为进一步通过生物技术改良甘蔗品种抗逆性提供理论依据。     

割手密鸟氨酸转氨酶(Ssδ-OAT-2)基因的克隆与表达分析

鸟氨酸转氨酶是合成脯氨酸的关键酶之一,在植物适应逆境胁迫中起重要作用。本研究以割手密为研究材料,克隆得到了鸟氨酸转氨酶基因c DNA序列全长,将该基因命名为Ssδ-OAT-2(Gen Bank登陆号:KX714116)。该序列全长1 373 bp,包含一个1 365 bp的开放读码框(ORF),编码454个氨基酸,相对分子质量49.54 k D。同源比对分析表明,Ssδ-OAT-2基因同其近缘属甘蔗的同源性最高(99%),其次是高粱(98%),与其它禾本科植物的同源性约为92%。通过构建与GFP融合表达载体,转洋葱表皮细胞进行瞬时表达,结果表明,该蛋白质主要定位于细胞质和细胞膜上。Ssδ-OAT-2基因的获得为甘蔗抗逆基因工程提供候选基因资源。     

割手密DREB2类转录因子的克隆与比较分析

DREB类转录因子是一类植物中特有的,在非生物逆境胁迫中起重要作用的调控因子。本研究以割手密为材料,采用同源基因克隆的方法克隆获得2个DREB2类转录因子基因Ss DREB2-1和Ss DREB2-2(Gen Bank登录号分别为KU963264和KU963265)。序列分析表明,这2个基因的长度分别为814 bp和709 bp,分别编码262和227个氨基酸;预测其蛋白质分子量分别为28.66 k D和24.95 k D,等电点(PI)分别为5.42和6.47。氨基酸亲水/疏水性分析表明,这2个转录因子属于亲水性蛋白。多序列比对分析表明,两基因序列的相似性为98.7%。原核表达分析表明,这2个基因编码区能正常表达出目的蛋白,说明得到的这2个基因为功能基因而非假基因。     

甘蔗PIN-LIKES基因家族的鉴定与表达分析

PILS (PIN-LIKES)是一类新发现的生长素输出载体,协助生长素的极性运输。本研究立足甘蔗割手密基因组和栽培品种转录组数据,利用生物信息学分析技术,分别在割手密和栽培品种中鉴定到11个PILS(Saccharum spontaneum PIN-LIKES, SsPILS)基因和4个PILS (Saccharum spp. hybrid PIN-LIKES, ScPILS)基因。结果表明, 11个SsPILS基因家族成员分布于6条染色体上,基因内含子数量介于5～11个。系统进化树分析发现,割手密PILS与水稻PILS有较高同源性,归属于3个不同的系统发育分支。转录组数据分析显示, SsPILS1c的同源基因ScPILS1c在受高粱花叶病毒和黑穗病菌胁迫甘蔗栽培种中差异表达。通过RT-PCR扩增技术,克隆获得ScPILS1c基因序列(NCBI accession number:OM258732)。该基因全长cDNA为1332 bp,包含一个1233 bp的完整开放阅读框,编码410个氨基酸,理论等电点(pI)为6.17,不稳定系数为39.31,平均疏水性值为0.689,预测ScPI...     

甘蔗、斑茅及割手密Ⅲ型过氧化物酶基因克隆及比较分析

研究旨在通过比较分析甘蔗及其近缘种割手密和斑茅Ⅲ型过氧化物酶(Prxs)基因差异,探讨这三种植物Prxs功能差异的遗传基础。采用同源克隆方法,成功克隆获得了甘蔗、斑茅和割手密的Prxs基因DNA序列(Genebank登录号分别为KJ001797,KJ001798和KJ001799)。经测序鉴定,克隆获得的这三个基因DNA长度分别为3 030 bp、3 048 bp和3 028 bp,外显子长度均为1 083 bp,其中编码区长度为996 bp,编码331个氨基酸。蛋白质保守结构域分析表明,此三个基因均具有过氧化物酶典型保守结构域,属于依赖于亚铁血红素Ⅲ型过氧化物酶亚类,为目标基因,且在功能位点区域高度保守,只存在一个氨基酸位点差异。基因结构比较分析表明,克隆获得的割手密、斑茅和甘蔗过氧化物酶基因均包含4个外显子,与高粱、玉米和水稻的同源基因外显子个数一致,外显子长度有较小差异,而内含子长度却存在较大差异。高粱、玉米和水稻Prxs同源基因均处在靠近染色体末端的位置,说明此基因存在一定的同线性。本研究结果为深入研究Prxs基因在不同植物中功能差异提供了一定的参考,为研究植物中Prxs基因的进化规律奠定了一定的基础。     

两个烟草多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因的克隆和表达分析

为了研究多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)在烟草中的生物学功能,运用生物信息学方法,结合RT-PCR和SMART RACE技术,从烟草中克隆到2个多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)基因c DNA和DNA全长序列,分别命名为Nt PGIP1(Gen Bank登录号:KF317203)和Nt PGIP2(Gen Bank登录号:KF317204)。Nt PGIP1基因全长为1 413 bp,编码338个氨基酸;Nt PGIP2基因全长为1 185 bp,编码329个氨基酸;两基因均没有内含子序列,核苷酸序列有50%的一致性,编码的氨基酸序列有54%的一致性。两基因编码蛋白均含有植物PGIP蛋白特有的重复保守序列LXXLXXLXXLXLXXNXLXGXIPXX。对PGIP基因在烟草不同组织表达量分析发现,两基因在根、茎、叶和芽中均有表达,其中均在茎中表达量最高,其次是根,叶中表达量很低。     

甘蔗CDK基因的cDNA全长克隆与表达分析

植物细胞周期依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent kinases,CDKs)是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,与周期蛋白(Cyclins)协同作用,是重要的细胞周期性调控因子。本研究从甘蔗受花叶病毒侵染的转录组数据库中获得一条与高粱(Sorghum bicolor)CDK基因(Gen Bank登录号为XP_002466536.1)高度同源的Unigene序列,通过RT-PCR扩增获得长度为1799 bp的甘蔗Sc CDK基因(Gen Bank登录号为KR258796)。序列分析显示Sc CDK基因含一个完整的开放阅读框(65~1603 bp),编码512个氨基酸,且具有CDK典型保守结构域,如ATP结合位点、磷酸结合位点及活化环A-loop。此外,生物信息学预测显示该基因编码的蛋白定位于细胞核,为可溶性蛋白,不存在信号肽,二级结构元件多为无规则卷曲,主要参与蛋白翻译。实时荧光定量PCR分析表明,Sc CDK基因的表达具有组织特异性,其在蔗芽上的表达量最高,其次是在蔗肉、蔗根、叶鞘和蔗皮中;在PEG、Na Cl和ABA的胁迫诱导过程中,Sc CDK均表现上调作用,且受ABA胁迫后表达量最高,约为对照组的1.9倍。推测该基因的表达与甘蔗抗干旱和抗渗透胁迫有关,同时受ABA的诱导,参与细胞周期分裂。     

甘蔗β-胡萝卜素异构酶基因家族的鉴定、定位和表达分析

独脚金内酯(strigolactones, SLs)是一种广泛存在、能够抑制植物分蘖或分枝的植物激素。β-胡萝卜素异构酶(D27)是SLs合成中的关键酶,但是目前关于甘蔗D27基因家族的鉴定与分析鲜有报道。本研究通过挖掘甘蔗原始亲本之一的割手密种基因组数据鉴定了5个割手密种D27基因家族成员。系统进化树分析发现,割手密种D27s分处在3个不同系统发育分支,与高粱D27s高度同源。保守结构域预测揭示,割手密种D27s包含β-胡萝卜素异构酶的典型结构域Pfam:DUF4033。顺式元件分析结果显示,割手密种D27s主要参与调控激素和胁迫响应,以及植物生长发育等。基于甘蔗栽培种转录组数据分析发现,甘蔗割手密种D27基因家族成员(Sspon.06G0012830-1A)的同源基因同时参与甘蔗分蘖调控及黑穗病菌胁迫响应。在此基础上,我们克隆获得了甘蔗栽培种ROC22中的同源基因cDNA序列,命名为ScD27.1 (GenBank登录号为MT499895)。生物信息学分析结果显示, ScD27.1编码266个氨基酸,其蛋白等电点为8.91,分子量为30.00 kD,是不稳定蛋白且定位于叶绿体。二级结构主要包括α-螺旋和无规则卷曲,具有叶绿体转运肽,包含4个泛素化位点和18个磷酸化位点。qRT-PCR表达分析表明,ScD27.1基因受ABA及H2O2显著诱导表达,但对MeJA、SA胁迫响应不明显。亚细胞定位结果显示, ScD27.1蛋白可能定位于细胞膜和叶绿体,参与细胞内膜泡运输或由液泡前体、胞内运输小泡分拣运输。以上研究表明, ScD27.1基因可能参与黑穗病菌侵染诱导的甘蔗分蘖及ABA和H2O2相关信号通路。本研究为了解甘蔗ScD27.1蛋白在胞内运输和分蘖中的作用及其参与甘蔗-黑穗病菌互作提供一定的基础理论。     

木薯MeAnn1基因的克隆及表达分析

以华南8号木薯为材料,采用RT-PCR技术,克隆得到1个具有完整阅读框的木薯膜联蛋白基因,命名为MeAnn1(Gen Bank序列号为:KM975562),该基因CDS序列长度为951 bp,编码317个氨基酸。生物信息学分析发现,其理化性质、蛋白保守结构域及多个蛋白功能位点与已报道的植物膜联蛋白一致。进化树分析表明,木薯MeAnn1与Ptr Ann6、At Ann1、At Ann2、At Ann6和Ann Bj1具有较近的亲缘关系,具有59.9%~84%的序列相似性。细胞定位结果表明MeAnn1蛋白主要定位于细胞质和细胞核中。实时荧光定量PCR分析表明,木薯膜联蛋白基因MeAnn1的表达受多种非生物胁迫的诱导,其中低温胁迫下基因表达量上调幅度最大,为对照表达量的24倍;但对H2O2胁迫不敏感。本研究结果有助于进一步研究MeAnn1基因的功能及木薯抗逆的分子机理。     

荠菜生长素极性运输基因1(CbPIN1)的克隆与表达分析

为了探讨荠菜PIN1基因的生物学功能,根据Gen Bank中拟南芥PIN1氨基酸序列,设计同源引物,通过RT-PCR技术,克隆了荠菜PIN1基因(CbPIN1)编码区c DNA序列;生物信息学方法分析了荠菜PIN1蛋白结构特征,并进行了亚细胞定位与原核表达;荧光定量PCR方法检测了PIN1组织表达特性;构建了植物表达载体p BI121-CbPIN1,并获得转基因植株。结果表明,CbPIN1 c DNA序列全长1 869 bp,C+G含量为49%。Blast比对结果显示,CbPIN1与拟南芥PIN1基因高度同源,相似性高达93%。进一步分析发现,CbPIN1可编码1条622个氨基酸的多肽,CbPIN1蛋白分子质量为67. 05 ku,等电点为9. 02,碱性氨基酸(K、R)个数为49,酸性氨基酸(D、E)个数为42,疏水氨基酸(A、I、L、F、W、V)个数为241,极性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)个数为157。CbPIN1属于跨膜蛋白,含12个丝氨酸磷酸化位点,1个苏氨酸磷酸化位点。亚细胞定位结果显示,CbPIN1定位于细胞膜; CbPIN1在荠菜不同组织均有表达,其中,根中表达最高,种子中表达最低。原核表达显示CbPIN1蛋白大小87. 05 ku。过表达荠菜植株中CbPIN1基因表达量均显著增加。试验结果为进一步分析CbPIN1在荠菜器官发育中的作用奠定了基础。     

芝麻八氢番茄红素脱氢酶基因SiPDS的克隆与序列分析

来自芝麻的八氢番茄红素脱氢酶基因(phytoene desaturase gene,PDS)的分离鉴定尚未见报道。本研究根据已报道植物PDS基因的氨基酸保守区,设计简并引物,扩增出编码芝麻新蔡选抗PDS基因c DNA的中间片段。利用电子克隆技术,从芝麻EST数据库中比对得到一条高度同源的序列,并通过RT-PCR方法,从新蔡选抗成功克隆了八氢番茄红素脱氢酶基因的c DNA,命名为Si PDS(Gen Bank登录号:KJ191121)。c DNA序列全长2 273 bp,开放阅读框长度为1 743 bp,编码580个氨基酸。根据克隆获得的全长c DNA序列设计引物,从新蔡选抗DNA中克隆获得Si PDS基因的全长DNA,长度为5 592 bp,转录区包括14个外显子和13个内含子。序列分析表明,Si PDS与其他植物的PDS蛋白序列高度相似;系统进化树分析表明,芝麻Si PDS与黄芩的亲缘关系最近。Si PDS基因可以用作植物病毒诱导的基因沉默载体的内源检测基因,在利用基因工程技术改良芝麻农艺性状方面具有较大的应用价值。     

萼脊兰TUB基因片段的克隆及序列分析

为了给筛选萼脊兰内参基因和研究TUB基因的生理功能提供研究基础,对萼脊兰TUB基因片段进行克隆与序列分析。采用CTAB法提取萼脊兰盛花期花瓣总RNA,并运用RT-PCR方法克隆萼脊兰TUB基因序列,长度为1 055 bp,编码351个氨基酸残基,氨基酸序列中存在微管蛋白的保守区域GGGTGSG。序列分析结果表明:与其他已登录物种的TUB基因相比,其核苷酸序列的同源性达75%~96%,与朵丽蝶兰(JN185665.1)同源性高达96%,氨基酸序列的同源性也在96%以上,且与单子叶植物的同源序列表现出较高的相似性。在Gen Bank注册,登录号为KP686397。     

泸定百合泛素基因(Ls-Ub)的克隆及表达分析

泛素(ubiquitin,Ub)与植物对外界的多种胁迫反应相关。为了研究百合中的泛素基因与百合抗镰刀菌病害的关系,本研究根据百合尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.lilii)诱导的泸定百合(Lilium sargentiae Wilson)SSH文库中筛选到的Ub EST序列,通过RACE结合RT-PCR技术从泸定百合中克隆到1个Ub基因全长c DNA序列,该基因全长996 bp,包含一个长690 bp编码229个氨基酸的开放阅读框,命名为Ls-Ub(Gen Bank登录号:KY996308)。序列比对分析结果表明Ls-Ub与其它物种Ub基因编码的氨基酸序列具有高度的相似性。Q-PCR结果显示百合镰刀菌诱导后Ls-Ub强烈上调表达,且明显高于水处理对照的表达水平。推测该基因可能与百合抗镰刀菌病害相关。本研究将为揭示百合抗镰刀菌枯萎病的分子机制提供一定理论依据。     

枣树2-半胱氨酸氧化还原酶基因Zj2-CP的生物信息学分析及表达载体的构建

本研究使用生物信息学相关软件对本课题组前期获得的枣树2-半胱氨酸氧化还原酶基因Zj2-CP(Gen Bank登录号:AB812086)的c DNA序列进行了分析。结果表明:该序列是一个全长为834 bp的开放阅读框,可编码277个氨基酸,分子质量为30.65 k D,理论等电点8.95,无信号肽和跨膜区,不属于分泌蛋白,有亲水性;二级结构以无规则卷曲为主,三级结构成弯曲螺旋状。氨基酸序列相似性分析表明,Zj2-CP基因编码的氨基酸序列与豇豆、玉米氨基酸序列的同源性最高,达到90%。以Zj2-CP基因的c DNA序列为模板进行PCR扩增,用内切酶消化后与载体PEZR(K)-LNY连接并转入大肠杆菌感受态细胞DH5α中,经酶切及测序证明,植物表达载体构建成功。研究结果可为深入探讨枣树2-半胱氨酸氧化还原酶基因的功能及枣树抗逆机制提供基础。     

甘蔗独脚金内酯生物合成关键基因ScD27的克隆与表达分析

独脚金内酯(strigolactones,SLs)是一类新型植物激素,D27基因是独脚金内酯生物合成途径中最上游的调控基因,且该基因调控SLs的合成是一个可逆的过程。本研究根据水稻、玉米、高粱、二穗短柄草4种禾本科作物的D27基因核苷酸序列保守区域设计引物,以甘蔗品种ROC22的c DNA为模板,利用RT-PCR和RACE技术,从甘蔗中克隆出D27基因的c DNA全长序列,命名为Sc D27,Gen Bank登录号为KP987221.1。该基因序列全长1379 bp,包含一个867 bp的完整开放阅读框(ORF),编码288个氨基酸残基。Sc D27编码的蛋白质分子量为71.58 k D,理论等电点为5.04,是一种非分泌性蛋白,主要分布于叶绿体上,该蛋白的保守区可能具有2个锌指蛋白结构域(Zn F_TAZ和Zn F_A20),且不存在信号肽;该基因编码的氨基酸序列具有较高的保守性,与高粱、谷子、大麦、短穗二柄草等禾本科植物的D27氨基酸序列相似性在70%以上;Sc D27基因在甘蔗各组织部位均有表达,其中茎尖和腋芽中表达量较高,叶、茎和根中的表达较低。此外,Sc D27基因在甘蔗茎尖中的表达受PEG、盐胁迫、磷缺乏和营养缺乏的诱导,推测Sc D27基因是甘蔗独脚金内酯生物合成途径中响应非生物胁迫的关键基因。     

斑茅铜锌超氧化物歧化酶基因(SaSOD-1)的克隆与序列分析

斑茅是甘蔗近缘野生种之一,具有较强的抗逆性,研究并开发利用斑茅的强抗逆基因,对甘蔗育种具有重要意义。本研究以高粱Cu/Zn-SOD(登录号:XM 002445626.1)cDNA序列为探针,对甘蔗属EST数据库进行检索、比对、拼接,通过设计特异引物,PCR扩增和序列分析验证,克隆得到2个Cu/Zn-SOD(SaSOD-1a和SaSOD-1b,登录号:KJ001795和KJ001796)基因全序列,其中SaSOD-1a基因组序列全长2 473 bp,SaSOD-1b基因组序列全长2 228 bp,均有8个外显子,7个内含子,其cDNA序列长度均为692 bp,编码206个氨基酸。序列比较分析表明,SaSOD-1a和SaSOD-1b序列相似性为98.6%,有8个单核苷酸多态性位点,蛋白质相似性为99.0%,2个氨基酸变异位点。用推导出的氨基酸序列与其它植物做同源进化分析,与高粱、玉米、谷子等比较均表现出较高的保守性。研究结果可为进一步了解超氧化物歧化酶与斑茅耐旱性的关系奠定基础。     

棉花转录因子基因GhMYB的克隆及特征分析

从棉花中克隆了1个MYB基因,命名为GhMYB(Gen Bank No.HQ234875)。该基因c DNA全长1264bp,具有1个774 bp的开放阅读框,5'非编码区为250 bp,3'非编码区为240 bp,编码256个氨基酸,预测分子量约为28.867 k Da,等电点为8.56,推测的氨基酸序列中含有2个高度保守的SANT结构域。GhMYB基因组序列长度为1355 bp,包含2个外显子和1个内含子。氨基酸同源分析发现,GhMYB与来自可可、陆地棉和巴旦木的MYB同源性较高。亚细胞定位结果表明,GhMYB:GFP融合蛋白定位于细胞核中。SDS-PAGE电泳分析表明,p ET-28a-GhMYB最佳诱导表达条件为1.0 mmol·L-1 IPTG在37℃下诱导4 h。电子表达谱分析表明,GhMYB基因在棉铃中特异表达,在根和叶中受水涝胁迫的诱导表达。     

甘蔗CIPK基因的同源克隆与表达

CIPK(calcineurin B-like-interacting protein kinase)是植物特有一类的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,该蛋白在植物响应逆境胁迫中发挥着重要的作用,尤其与非生物逆境胁迫(干旱、高盐、ABA等)的信号传导密切相关。根据玉米CIPK15基因(EU957447.1,2247 bp)核酸序列保守区域设计1对同源克隆PCR引物,以甘蔗品种崖城05-179的c DNA为模板,通过RT-PCR扩增得到甘蔗CIPK基因的一条全长c DNA序列(Gen Bank登录号为KM114052)。序列分析结果表明,甘蔗Sc CIPK基因全长1782 bp,具有完整的开放阅读框(ORF,91~1631 bp),编码513个氨基酸,该基因具有CIPK基因的2个特征结构域(Kc-like superfamily和AMPKA-C-like superfamily)。生物信息学分析显示该基因编码的蛋白定位于内质网,为可溶性蛋白,不存在信号肽,二级结构元件多为α-螺旋,含有多个保守功能域,主要参与中间代谢。实时定量PCR表达分析表明,该基因表达具有组织特异性,虽在甘蔗各组织中均有表达,但在芽中的表达量最高。该基因在PEG、Na Cl、ABA、SA和Me JA的胁迫诱导过程中,受ABA胁迫后表达量最高,约为对照的5.3倍,推测该基因的表达与甘蔗抗干旱和抗渗透胁迫有关。     

菊花MADS-box基因的克隆与表达载体构建

为了给菊花CmFUL基因功能鉴定与遗传改良奠定基础,采用RT-PCR法从菊花叶片中克隆出1个MADSboxA类基因的编码区序列,命名为CmFUL(Gen Bank登录号KT894379)。CmFUL基因编码区ORF片段长度为741 bp,编码246个氨基酸。CmFUL蛋白属于亲水性蛋白,预测该蛋白内含12个磷酸化位点和2个潜在的N-糖基化位点。氨基酸序列比对和系统进化树分析表明,CmFUL蛋白与CMD41蛋白的相似性为95.6%,同属于AP1/FUL亚家族的FUL-like进化枝。实时荧光定量PCR分析表明,CmFUL基因在花期不同组织中均有表达,但表达丰度不一。在花蕾中表达量最高,其次是管状花,根和舌状花中痕量表达;同一朵花中管状花的表达量约为舌状花中的12倍。分析认为,CmFUL可能在促进开花及子房建成中起重要作用。将CmFUL基因连接到p CAMBIA1300载体上,成功构建了高效植物表达载体。