贵州桃种质资源ISSR标记体系建立及遗传多样性分析

采用正交设计方法,针对影响贵州桃ISSR-PCR反应的引物浓度、模板DNA、Master Mix及退火温度等因素进行优化,建立了适于贵州桃ISSR-PCR标记的反应体系。20μL反应体系含有Master Mix 10.0μL、引物浓度0.375μmol/L、DNA模板40 ng、退火温度为52℃。利用该体系对71份贵州桃资源进行分析,扩增条带清晰,扩增产物在175~2 300 bp之间。12条ISSR引物共扩增112条带,其中多态性条带79条,多态性比率为70.54%。供试材料的Nei's遗传多样性指数(H)为0.211 1±0.184 4,Shannon's信息指数(I)为0.325 1±0.260 8。聚类分析显示71份贵州桃资源遗传相似系数变幅为0.669 6~0.919 6,在相似系数0.80水平处可将供试材料分为8个类群,表明贵州桃资源具有较为丰富的遗传多样性。     

黑果枸杞ISSR-PCR反应体系的正交设计优化

黑果枸杞(Lycium ruthenicum Murr.)为茄科枸杞属小灌木。果实为黑紫色球形浆果,具有较高的药用价值、营养价值、生态价值和经济价值。该研究以青海省野生黑果枸杞为材料,将对黑果枸杞ISSR-PCR反应产生主要影响的五种因子(Taq DNA聚合酶, dNTP, Mg~(2+),引物和模板DNA)进行L_(16)(4~5)的正交试验,以建立黑果枸杞ISSR-PCR最佳反应体系,并对反应体系进行验证。在此基础上筛选出适宜的ISSR引物,用梯度法优化各引物的最佳退火温度。结果表明:黑果枸杞20μL ISSR-PCR反应体系中包括Taq DNA聚合酶0.02 U/20μL,Mg~(2+) 1.65 mmol/L,dNTP 0.15 mmol/L,引物0.60μmol/L和模板DNA 50 ng;在100条ISSR引物中筛选出16条最适引物,并确定了各引物的最适退火温度为44℃～54.5℃;最佳扩增程序设定为94℃预变性5 min;然后94℃变性20 s,44℃～54.5℃复性1 min,72℃延伸1 min 20 s,共进行38个循环;最后72℃延伸6 min,4℃保存。该体系在黑果枸杞不同样品中所得条带清晰且多态性丰富,有助于后续青海省黑果枸杞种质资源筛选和遗传多样性分析研究。     

藜芦ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以藜芦为试验材料,通过L_(16)(4~5)正交试验与单因素实验两种方法对藜芦ISSR-PCR反应体系中的5个主要因素(模板DNA,引物, Taq DNA聚合酶, dNTPs, Mg~(2+))进行筛选与优化,建立藜芦ISSR-PCR最佳反应体系;在此优化体系下,从100条引物中筛选适宜的ISSR引物,设置温度梯度检测各引物最佳退火温度。结果表明,藜芦20μL ISSR-PCR反应体系包括:0.30μmol/L引物、24 ng/20μL模板DNA、2 U/20μL Taq DNA聚合酶、0.20 mmol/L dNTP、1.00 mmol/L Mg2+;从100条引物中筛选出16条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物。利用14份藜芦样品验证该优化体系的稳定性,证明该体系稳定可靠,可为后续藜芦的遗传多样性分析研究提供帮助。     

山羽藓ISSR-PCR反应体系优化及引物筛选

本研究采用L16(45)正交试验设计法对山羽藓ISSR-PCR反应进行优化试验。研究结果表明,山羽藓ISSR-PCR最佳反应体系(25μL)为:Taq DNA聚合酶0.8 U,Mg2+1.5 mmol/L,d NTPs 0.4 mmol/L,引物0.6μmol/L和模板DNA 40 ng,对该反应体系的影响顺序为:Taq DNA聚合酶引物d NTPs模板DNAMg2+。同时筛选出12条适合山羽藓的ISSR引物,并确定了每条引物的最适退火温度。所建立的体系稳定可靠,条带清晰且多态性丰富,可为后续开展山羽藓种植资源、遗传多样性及分子亲缘地理学研究奠定基础。     

砂仁及其混伪品益智仁的ISSR分子鉴别

为创建砂仁及其主要混伪品益智仁的ISSR分子鉴别方法,以UBC818为引物,对影响ISSR-PCR反应体系的引物、dNTPs、DNA模板、Taq DNA聚合酶和Mg2+浓度进行5因素4水平正交优化试验,并在此基础上筛选阳春砂ISSR引物及砂仁正伪品的鉴别引物。结果表明,20μL阳春砂ISSR-PCR最佳反应体系包括引物0.5μmol/L、dNTPs 0.25 mmol/L、DNA模板40 ng、Taq DNA聚合酶1.2 U、Mg^2+2.0 mmol/L;从52条ISSR引物中筛选出10条阳春砂ISSR引物,从6条阳春砂和益智的共同引物中,筛选出扩增条带清晰、多态性强的砂仁正伪品的鉴别引物UBC808,利用UBC808对15份样品进行验证试验,结果表明鉴别体系稳定性好,可用于砂仁与益智仁的快速、准确鉴别。     

丝瓜ISSR反应体系的优化

以丝瓜基因组DNA为模板,对ISSR反应中主要5个影响因素Mg~(2+)浓度、dNTP浓度、TaqDNA聚合酶浓度、引物浓度和DNA模板浓度,建立丝瓜ISSR-PCR反应的体系。根据实验确定的最佳反应体系为:25μL ISSR体系:50 ng DNA,0.2 mmol/L dNTP,1 U Taq酶,0.4μmol/L的单条引物,2.5μL 10×Buffer,2.0 mmol/L Mg~(2+)。在此基础上,对12个引物的退火温度进行优化。最终选用60份丝瓜品种对所确定的扩增体系及扩增程序进行验证,检测结果表现为扩增产物条带清晰明亮、亮度高和重复性好,表明本试验所确定的反应体系及反应程序适用于丝瓜的ISSR分子标记为丝瓜种质资源的鉴定、分类和丝瓜的杂交育种提供参考依据。     

云南高海拔地区桃种质资源ISSR体系的建立和优化

本试验以云南高海拔地区桃种质资源的样本为试验材料,从提取的100余份DNA样品中随机抽取1份,再用初筛的引物UBC-891,用于ISSR体系的优化。根据单因素试验和正交试验设计,本研究发现了最佳ISSR-PCR反应体系。研究结果表明:25μL的ISSR反应体系中,2.5μL 10×PCR buffer(含 Mg~(2+)),1.5 mmol/L Mg~(2+),2.0 U Taq-DNA聚合酶,0.10 mmol/L dNTPs,0.40μmol/L引物,45 ng DNA组合最佳。Taq-DNA聚合酶浓度对反应影响最大。本研究为引物筛选和云南高海拔地区桃种质资源ISSR遗传多样性研究提供了理论基础。     

金银花ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以金银花叶片基因组DNA为模板,通过单因素试验,研究了退火温度、Taq DNA 聚合酶的用量及模板DNA、引物、dNTPs、Mg2+浓度等6种因素对ISSR－PCR扩增的影响,建立了适合于金银花ISSR-PCR反应体系和扩增程序,即在20 μL反应体系中,内含1×PCR反应缓冲液（Mg2＋free）、1.5 U Taq DNA 聚合酶、0.15 mmol·L-1 dNTPs、0.4 μmol·L-1引物、1.5 mmol·L-1 MgCl2、60 ng模板DNA。确定了适宜的退火温度为49.9 ℃。扩增程序为94 ℃预变性5 min ;35个循环为94 ℃变性30 s,49.9 ℃退火30 s,72 ℃延伸1.5 min;最后72 ℃延伸7 min,4 ℃保存。利用优化反应体系,从100条ISSR引物中筛选出10条稳定性和重复性高的引物;以这10条引物对22个金银花品种基因组DNA扩增,共扩增出108条带,其中多态性条带96条,多态性条带比率为88.9%。金银花ISSR反应体系的建立为利用ISSR标记技术进行金银花品种鉴别、分类、种质资源遗传多样性分析奠定了良好基础。     

苦瓜MSAP反应体系的优化及其种质资源表观遗传多样性

为研究苦瓜表观遗传多样性,通过正交设计方法优化了MSAP技术中预扩增和选择性扩增系统的关键因素,构建了适用于苦瓜的MSAP反应体系,并利用其对52份苦瓜种质资源的表观遗传多样性进行分析。结果表明:30μL MSAP双酶切反应体系中,加入Eco RⅠ和MspⅠ/HpaⅡ各10 U,于37℃水浴酶切4 h时使酶切完全;最佳预扩增反应体系20μL,包含连接产物4μL,10×PCR buffer 2.0μL(25 mmol/L),d NTPs0.3μL(2.5 mmol/μL),Taq酶0.1μL(5 U/μL),10 mmol/L上下游引物各1.0μL;最佳选择性扩增反应体系20μL,包含4μL稀释150倍的预扩增产物。从110对引物中选出扩增效果好,条带清晰的12对引物组合利用最佳反应体系对52份苦瓜种质资源进行MSAP扩增,共得到430条条带,其中多态性条带218条,多态性比率为50.70%。对DNA甲基化模式进行分析,其中类型Ⅰ(非甲基化类型)3109条,类型Ⅱ(半甲基化类型)633条,类型Ⅲ(全甲基化类型)606条,类型Ⅳ(外部甲基化)1250条,苦瓜甲基化模式主要为外部甲基化为主。Nei's基因多样性指数和Shannon信息指数分别为0.226 5、0.372 6,该结果表明试验中所用的苦瓜种质资源具有丰富的遗传多样性,遗传变异和进化水平较高。UPGMA聚类分析结果表明12个不同地区苦瓜种质资源在相似性系数0.88处可分为4大类,大部分种质被聚集在第1类中,又可以分为5个亚群,亚群Ⅰ:中国海南、中国广东、中国福建和日本;亚群Ⅱ:中国云南;亚群Ⅲ:泰国和格林纳达;亚群Ⅳ:中国北京;亚群Ⅴ:中国台湾。本研究通过利用正交优化建立MSAP反应体系,并对苦瓜种质资源甲基化表观遗传多样性进行研究,这种基因组结构水平上的研究将为苦瓜种质资源的种群分化及物种进化的进一步研究提供依据。     

川续断ISSR反应体系的建立与优化

利用两轮混合均匀设计的方法,研究引物、2×Taq master mix、模板DNA以及退火温度对ISSR-PCR扩增的影响,在此基础上获得优化的川续断ISSR反应体系,为后续开展川续断的遗传多样性分析奠定基础。试验显示川续断ISSR-PCR最佳反应体系为:在18μL的反应体系中含有2×Taq Master Mix 10.44μL,模板DNA 45 ng,引物0.35μmol/L。在此基础上,从100条引物中筛选出5条扩增较稳定、多态性丰富的引物,随后进行的温度梯度PCR实验发现引物最佳退火温度介于45℃~58℃之间。该试验表明采用混合均匀设计和单因素试验相结合的方法,可以减少实验处理次数,快速建立ISSR反应体系,经过对9份川续断种质资源进行ISSR扩增检测,证明该体系稳定可靠,可用于川续断遗传多样性分析。     

云南岩白菜资源的DNA提取和ISSR引物筛选

提取滇产岩白菜资源的基因组DNA并进行ISSR引物的筛选,为用ISSR标记研究云南岩白菜资源的遗传多样性奠定基础。DNA提取采用改良的CTAB法,质量检测采用琼脂糖凝胶电泳法和紫外分光光度计法,ISSR引物选用加拿大哥伦比亚大学开发的100条引物。结果表明,从18份云南岩白菜资源的幼叶中提取了基因组DNA,浓度在1 387.5～12 000 ng/μL之间,A260/A280的值在1.61～1.85之间,琼脂糖凝胶电泳检测呈一条带;从100种ISSR引物中筛选出了22种扩增结果好的引物。所提DNA质量较高,该提取方法适用于从酚类和蛋白质含量高的植物材料中提取DNA;22个ISSR引物可用于岩白菜资源的遗传多样性研究。     

利用RAPD和ISSR标记分析苎麻野生种质资源的遗传多样性

本文以8个地方栽培品种为参照,应用RAPD和ISSR标记从DNA水平分析了来自于不同生态区域的30份苎麻野生种质的遗传背景.在31条RAPD引物中,共扩增出358个条带,平均产率为11.5条带/条引物;而在18对ISSR引物共扩增出266个条带,平均产率为14.8条带/条引物.用NTSYs 2.0软件进行UPGMA法聚类.聚类分析结果表明:在0.73的相似系数水平上,均可将38份材料分成8大类群,对两种标记的比较和混合分析得出:RAPD和ISSR标记适用于苎麻野生材料的遗传多样性分析,但ISSR比RAPD标记更适合苎麻野生种质资源亲缘关系分析.这为我们以后的苎麻杂交育种提供了重要的依据.     

珍稀植物攀枝花苏铁ISSR扩增条件的优化

在利用ISSR技术对攀枝花苏铁（Cycas panzhihuaensis）种质资源遗传多样性进行研究的实验过程中, 对影响PCR扩增效果的一些因素如DNA的提取、模板DNA质量浓度、Taq酶用量、引物用量、dNTP的用量以及退火温度等指标进行筛选和优化。试验结果表明,20μl的反应体系中采用15~25ng 的模板DNA、2.0~2.5mmol/L的Mg2 + 浓度、0.2mmol/L的dNTPs、0.2μmol/L ISSR 引物、0.2U Tag DNA 聚合酶、48 ℃~55 ℃(退火温度随引物不同而定)的复性温度,以及35个循环数为攀枝花苏铁ISSR—PCR 扩增条件的最佳选择。攀枝花苏铁ISSR—PCR 扩增条件的优化为进行攀枝花苏铁种群间遗传分化的研究奠定了基础。     

丝瓜种质资源遗传多样性的ISSR分析

利用ISSR分子标记技术对60份丝瓜种质资源进行遗传多样性分析,100对ISSR引物中筛选出12对引物,共扩增条带154条,平均每个引物扩增条带14条,多态性条带143条,非多态性条带11条。各个引物的多态性比例范围为50%~100%,多态性比例92.9%。结果表明,丝瓜种质资源遗传多样性较高,同时也表明了ISSR分子标记能够很好的检测丝瓜种质资源的遗传多样性。通过聚类分析将60份丝瓜分为2大类,普通丝瓜和棱丝瓜。分别以0.646和0.718处为阈值,普通丝瓜和有棱根据瓜形分为短圆筒普通丝瓜、长圆筒普通丝瓜、短棍棒有棱丝瓜和长棍棒有棱丝瓜。     

油用牡丹ISSR-PCR反应体系的建立和优化

本研究采用L16(45)正交试验设计,对油用牡丹ISSR反应体系中的5个主要因素进行了优化,确立了ISSR-PCR的最佳反应体系:反应体系总体积20μL,含0.50 U Taq聚合酶,20 ng模板DNA,3.00 mmol/L Mg~(2+),0.40 mmol/L d NTPs,1.00μmol/L引物及10×PCR Buffer。基于ISSR-PCR最佳反应体系,我们共筛选出了12条多态性丰富、条带清晰稳定的引物,为油用牡丹遗传连锁图谱的构建及分子育种奠定基础。     

苦瓜ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为建立适合于苦瓜的ISSR反应体系,为后续苦瓜的遗传多样性分析和亲缘关系鉴定奠定基础,本研究以"609"苦瓜品种作为模板DNA,试验采用单因素试验设计对影响反应体系的DNA模板、引物、d NTP和Taq酶的含量进行优化,并对单因素结果进行L9(33)正交试验设计。研究结果表明,苦瓜ISSR:20μL最佳反应体系为:2μL的10×Buffer(含Mg2+),30 ng模板DNA,0.25 mmol/L的d NTP,0.5μmol/L的引物,1.25 U的Taq DNA聚合酶。在此基础上,对优化引物的退火温度,确定最适宜的退火温度。验证优化的最佳反应体系,选用引物cw39132对48个苦瓜品种进行所确立扩增体系的验证,结果显示扩增产物条带清晰明亮、多态性丰富,且特异性强和重复性好,表明本研究所确定的反应体系适用于苦瓜的ISSR分子标记。     

油菜黑胫病菌 ISSR-PCR 反应体系优化

通过正交试验设计,对油菜黑胫病菌ISSR-PCR 反应体系的各影响因素进行研究,即从 Taq 酶、Mg2＋、dNTPs、引物以及模板浓度5因素4水平进行优化,筛选并建立了适合油菜黑胫病菌ISSR分子标记的最佳反应体系,即在25μL反应体系中包含Taq DNA酶1 U,Mg2＋2．0 mmol/L,dNTPs 0．2 mmol/L,引物0．6μmol/L,模板40 ng以及2．5μL 10×Buffer。并以扩增条带丰富、清晰、稳定性强为原则,从所查找的110条引物中筛选出24条适于油菜黑胫病菌ISSR-PCR扩增的引物,同时对各引物的最佳退火温度进行了筛选确定,经对20株病原菌的稳定性检测,证实该优化体系可用于研究该病原菌的遗传多样性。     

华北蓝盆花ISSR-PCR引物筛选及反应体系优化

本研究以内蒙古自治区境内8个自然居群野生华北蓝盆花叶片作为供试材料,进行基因组总DNA的提取检测、ISSR引物筛选和引物退火温度的筛选。针对华北蓝盆花ISSR-PCR反应中的模板DNA浓度和引物浓度2个影响因素,在4个水平上对华北蓝盆花ISSR-PCR反应体系进行优化,确定最佳反应水平,最终建立华北蓝盆花ISSR-PCR扩增的最佳反应体系。结果筛选出了8条多态性较好的华北蓝盆花ISSR引物及其退火温度,平均每条ISSR引物扩增出12.3条带,多态性条带占93.88%;华北蓝盆花ISSR-PCR反应的最佳体系为总体积20μL,DNA模板1μL,DNA模板浓度为60 ng/μL,引物0.6μL,引物浓度为0.8μmol/L,Ex Taq DNA聚合酶10μL,ddH_2O 8.4μL,扩增程序为94℃预变性5 min;94℃变性0.5 min,不同引物最佳退火温度下退火1 min,72℃延伸1.5 min,35个循环;循环结束后72℃继续延伸7 min;4℃保存。本研究结果为进一步研究华北蓝盆花居群遗传多样性提供科学依据。     

马铃薯种质遗传多样性分析的AFLP反应体系优化与引物筛选

本试验主要对AFLP反应体系进行优化,并用该体系筛选适用于马铃薯种质资源遗传多样性分析的引物。酶切连接、预扩增和选择性扩增体系的优化结果表明,建立的马铃薯AFLP反应体系为:模板DNA160ng,37℃酶切连接12h;预扩增体系中dNTP浓度为0.2mmol/L,TaqDNA聚合酶用量为1U;选择性扩增体系中预扩增产物稀释20倍,引物终浓度为2.5ng/μL。利用优化后的AFLP反应体系,以5个马铃薯品种为试材筛选选择性引物,可以从81对引物组合中选出16对条带丰富且多态性较高的引物组合。本研究为种质资源鉴定、马铃薯遗传多样性以及马铃薯抗病性研究等奠定了良好的基础。     

大赖草ISSR-PCR反应体系的优化及引物筛选

本试验的目的在于建立大赖草最佳的ISSR-PCR反应体系。以大赖草基因组DNA为模板,利用单因子实验相结合正交试验设计的方法,对PCR体系的各因素(d NTPs,DNA及引物等)进行优化试验,同时筛选出扩增条带清晰、稳定性好的ISSR引物并确定其退火温度。试验表明,经优化后的PCR体系:在25μL体系中,DNA用量为50 ng、Taq DNA聚合酶用量为1.0 U、引物的浓度为0.4μmol/L、d NTPs的浓度为0.3 mmol/L、和Mg2+的浓度为2.5 mmol/L。体系验证试验表明该体系稳定、可靠,另外筛选出10条较好的引物,可用于后续的大赖草遗传多样性分析及亲缘关系分析、基因定位与克隆、连锁图谱构建等方面的研究,并对其它近缘作物有指导意义。