花生病程诱导蛋白基因AhPIP1和启动子的克隆、序列分析及原核表达

本文采用RACE法克隆了花生病程诱导基因(pathogenesis-induced protein gene)全长,命名为AhPIP1,并在GenBank登录,登录号为EU860093.序列分析表明该基因的开放读码框579 bp,编码193个氨基酸.以YY20基因组DNA为模板PCR扩增获得AhPIP1基基因组序列长1 883 bp,包含3个外显子和长度分别为602 bp和600 bp的2个内含子.同源性比较发现AhPIP1与辣椒病程诱导蛋白CaPIP1(ABF72432,AAT35532)相似性达82%.采用Genome Walldng方法获得AhPIP1启动子,序列分析表明该启动子序列长513 bp,包含干旱胁迫、病程胁迫应答元件和生长素、赤霉素应答元件.构建pET32a-AhPIP1原核表达载体,转化表达受体菌Ecoli BL21,原核表达获得大小约40 kD AhPIPl融合蛋白,与推测的AhPIP1基因编码产物的大小一致,表明AhPIP1基因在大肠杆菌中能够表达.     

樱桃病毒A外壳蛋白基因克隆及其原核表达

为制备樱桃病毒A(Cherry virus A,CVA)抗血清,克隆CVA外壳蛋白基因(CP),构建原核表达载体,优化蛋白表达条件。根据CVA全基因组序列(NC_003689.1)设计特异引物,RT-PCR方法扩增CVA外壳蛋白基因,克隆、测序,构建原核表达载体pET30a-CVACP,转化大肠杆菌BL21(DE3)株系,采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达。序列分析显示,该区段长为603 bp,编码201个氨基酸,与法国分离物PF(HQ267856.1)的同源性为96.8%,与印度分离物JKSPMi-5(FN669548.1)同源性为86.3%。成功构建了原核表达载体pET30a-CVACP,SDS-PAGE电泳分析显示,转pET30a-CVACP载体的BL21(DE3)菌株表达分子量约24 kDa的重组蛋白,该重组蛋白在37℃、1.5 mmol/L IPTG、诱导4 h条件下表达量最大。     

高粱中SbDREB2基因的克隆与表达分析

干旱应答元件结合蛋白(DREB)在植物非生物逆境胁迫中调节下游一系列抗逆基因的表达。本研究利用电子克隆和RT-PCR方法从高粱中克隆到1个DREB类基因SbDREB2,该基因ORF 789 bp,推测编码蛋白含262个氨基酸残基,相对分子质量28.6 kD,理论等电点为5.52,在DNA序列内包含1个740 bp的内含子,符合GT-AG剪接规则。氨基酸序列分析表明,该蛋白在82~145区含有DREB类转录因子家族特有的AP2保守结构域,与玉米DREB2A及水稻DREB1蛋白相似度分别为84%和69%。成功构建了原核表达载体pET28a-SbDREB2,经IPTG诱导获得32.5 kD左右蛋白,与理论值一致。Real-time PCR表达特性分析显示,该基因为组成型表达,在根、茎、叶中均表达,根中表达量约是茎中的2.5倍;受干旱、高盐和外源ABA的强烈诱导,但对低温几乎没有响应。     

李矮缩病毒外壳蛋白基因克隆及原核表达研究

为制备李矮缩病毒(Prunus dwarf virus, PDV)抗血清,克隆PDV外壳蛋白(CP)基因,构建原核表达载体,优化蛋白表达条件。以阳性感病甜樱桃叶片为试验材料,提取总RNA,根据PDV CP基因(L28145.1)设计特异引物,RT-PCR方法扩增,克隆、测序,构建原核表达载体pET30a-PDVCP,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株表达。PDV CP基因（Genbank登录号：JF333587.1）全长657 bp,编码217个氨基酸,与GenBank其他PDV分离物CP基因核苷酸序列的同源性为89.2%~93.9%,推导的氨基酸序列同源性为97%~99%。根据完整CP基因核苷酸序列构建系统进化树显示：12个PDV分离物可分为3组,泰安分离物与巴西、土耳其等分离物属于Ⅰ组。成功构建原核表达载体pET30a-PDVCP,并在体外条件下诱导表达出融合蛋白。转pET30a-PDVCP载体的大肠杆菌BL21（DE3）菌株表达分子量约24 kDa的重组蛋白。该重组蛋白在30℃,1.0 mmol/L IPTG、诱导4 h表达量最大。     

红鳍东方 SREBP-1和 SREBP-2基因克隆及表达分析

为了研究红鳍东方 SREBP-1和 SREBP-2基因的功能及在脂肪代谢中的分子机制，从红鳍东方脂肪组织提取总 RNA，反转录获得 cDNA 模板，利用设计的引物 PCR 扩增获得 SREBP-1和 SREBP-2开放阅读框（ORF）， SREBP-1基因 ORF 区的 cDNA 序列长度为3330 bp，编码1109个氨基酸，SREBP-2基因 ORF 区的 cDNA 序列为3444 bp，编码1147个氨基酸。实时荧光定量 PCR 检测 SREBP-1基因在红鳍东方不同组织中的表达特征，结果表明， SREBP-1在脑组织中表达丰度最高，其次为眼、脂肪组织、肠、鳃、脾脏、心脏及肝脏，在肌肉中表达丰度最低。将SREBP-1连接到原核表达载体 pET32a 上，利用 IPTG 对重组质粒 pET32a-SREBP-1在大肠杆菌 Rosetta（DE3）进行诱导表达，SDS-PAGE 电泳显示在141 kDa 处有特异性的条带出现。     

菠菜SoGSNOR基因的克隆及原核表达

亚硝基谷胱甘肽还原酶(S-nitrosoglutathione reductase,GSNOR)在生物体中调控信号分子一氧化氮(NO)的代谢和平衡。为了深入研究GSNOR的功能,利用RT-PCR和RACE(Rapid-amplification of cDNA ends)技术从菠菜根中克隆了SoGSNOR基因的全长序列,该基因编码框1 140 bp,编码379个氨基酸,GenBank登录号为KR381778。将其克隆到原核表达载体pET32a上,构建原核表达载体pET32a-SoGSNOR,并转化大肠杆菌BL21 star(DE3),通过IPTG诱导重组SoGSNOR在大肠杆菌BL21 star(DE3)中高效表达,表达的融合蛋白分子质量约为65 ku,且在上清液和包涵体中均有表达,可溶性部分经Ni~(2+)NTA亲和柱纯化,获得纯化蛋白,并注射昆明小鼠,制备多克隆抗体,并对其进行了Western Blot检测,结果表明,稀释10 000倍的抗血清能够检测到与预期SoGSNOR大小一致的目的条带。试验结果为进一步研究菠菜SoGSNOR基因功能奠定了基础。     

鹅坦布苏病毒非结构蛋白NS1的原核表达及纯化

根据鹅坦布苏病毒JS804株非结构蛋白NS1基因序列,设计1对特异性引物,利用PCR方法扩增得到完整的NS1基因,并将其克隆至原核表达载体pET28a和pET32a上,构建出重组表达质粒pET28a-NS1和pET32a-NS1,转化至BL21(DE3)中,经IPTG诱导得到NS1融合蛋白(His-NS1),其分子质量约分别为44,58 kDa,均在诱导后6 h达到表达量高峰。分析显示,2种融合蛋白均以包涵体形式存在,包涵体经过变性和复性后均可获得单一、高表达量的目的蛋白,为进一步开展关于鹅坦布苏病毒NS1蛋白的研究奠定了基础。     

油菜GDSL脂肪酶基因BnLIP1的克隆及其原核表达

克隆油菜GDSL脂肪酶基因BnLIP1,实现该基因在原核系统中重组表达,为研究其功能奠定基础。采用TRIzol法提取总RNA,通过RT-PCR法扩增BnLIP1编码序列,构建原核表达载体pEL1并转化大肠杆菌,IPTG诱导表达后通过SDS-PAGE检测目的蛋白。根据GenBank报道的序列设计引物,从萌发的油菜种子黄化幼苗中成功克隆到BnLIP1的编码序列,长度为1170bp。将该编码序列构建到原核表达载体pET32a( )并与标签序列融合,在E.coliBL21菌株中成功表达了与标签蛋白融合的BnLIP1蛋白,大小约为61kDa。首次实现了油菜GDSL脂肪酶基因在原核系统中的表达,为GDSL脂肪酶Bn-LIP1蛋白的分离纯化及活性研究奠定了基础。     

草莓FaUVR8基因的cDNA克隆、生物信息学分析及原核表达条件优化

紫外线B(UV-B)对于植物生长发育具有重要调节作用,其中UV RESISTANCE LOCUS 8蛋白作为UV-B的光受体在植物响应UV-B过程中起关键作用。草莓是一种重要的经济果树,目前关于草莓的UV-B光受体报道较少。为研究草莓中UV-B受体蛋白,本研究采用同源克隆的方法获得‘丰香’草莓中编码UV-B光受体蛋白的c DNA序列,进行了生物信息学的分析并构建了原核生物表达载体p ET32a-UVR8,利用中心点响应面法优化了重组蛋白的诱导条件(包括诱导温度,IPTG浓度,菌液浓度和诱导时间)。结果表明:克隆得到了编码草莓UVR8蛋白的全长c DNA序列,命名为Fa UVR8,生物信息学分析表明该序列长1 317 bp,编码438个氨基酸,预测分子量为47.28 k D,等电点p I为5.85,重建蛋白质三维结构表明该蛋白包含7个β-片状螺旋结构;原核表达得到69.7 k D的融合蛋白,对四个诱导条件优化表明将工程菌培养至菌液OD600=0.7,加入浓度为0.55 mmol/L的IPTG,在27.72℃下诱导9 h,可获得最大量重组蛋白79μg/m L。研究结果可为后期寻找与Fa UVR8蛋白互作的下游蛋白,以及进一步开展其功能研究提供参考。     

草莓果实小分子量热激蛋白基因FaHSP17.4的克隆及表达分析

为了探究小分子热激蛋白(s HSP)在草莓果实发育成熟中的作用,以及其在果实发育成熟时期和不同温度下的表达和调控模式。本试验采用RACE方法克隆了草莓Fa HSP17.4的c DNA全长序列并进行生物信息学预测分析;利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术检测其在不同温度下、不同草莓果实发育成熟期的表达水平。序列分析表明:Fa HSP17.4全长为784 bp,含有一个471 bp的完整开放阅读框(ORF),预测编码156个氨基酸,分子量为17.4 k D,p H值为6.55,属于Ⅰ型s HSP。q RT-PCR结果表明:在丰香和甜查理不同组织器官中Fa HSP17.4均有表达,在果实发育成熟期表达水平持续下降。Fa HSP17.4基因对温度的响应因品种而不同,丰香更为敏感,为30℃;而甜查理的响应温度为35℃。获得了草莓Fa HSP17.4的全长c DNA序列,其基因表达水平与果实发育成熟和温度刺激有着关系密切,推测Fa HSP17.4可能参与草莓果实的发育成熟进程。