两种抗病基因双T-DNA区双元载体的构建

选择标记基因的删除是植物转基因工程中重要的步骤之一,双T-DNA区双元载体转化法以其共整合频率高、删除标记基因效率高的优点在植物遗传转化中应用非常广泛。本文通过构建天麻抗真菌蛋白基因、脂质转移蛋白基因双T-DNA区双元载体,为培育不含选择标记基因的抗病新材料奠定基础。通过PCR的方法克隆GAFP基因,产物纯化测序确定序列准确后与pSB130-35S载体进行BamHⅠ、SacⅠ双酶切;pCAMBIA2300-LTP、pSB130-35S经EcoRⅠ、HindⅢ双酶切,酶切产物纯化后连接,连接产物转化大肠杆菌。采用基因特异性引物进行菌液PCR鉴定阳性克隆,重组质粒pSB130-GAFP、pSB130-LTP双酶切产物大小分别为540bp、1200bp,与预期产物大小一致,pSB130-GAFP、pSB130-LTP双T-DNA区双元载体构建成功。载体pSB130-GAFP、pSB130-LTP转化根癌农杆菌后可以直接用于植物的遗传转化。     

豌豆终止子rbc-T在转基因小麦研究中的应用

目前常用的转基因载体元件大多为真菌或细菌来源,引发对转基因食品安全性的担忧。本研究克隆了豌豆终止子rbc-T,并用其替换农杆菌终止子nos-T构建转化载体,利用基因枪法将携带Ubi启动子、GUS基因和终止子rbc-T组成的最小表达框片段转化普通小麦,同时以带有nos-T终止子的载体为对照,经过PCR检测筛选获得T2代稳定遗传的转基因小麦株系。GUS组织化学染色及酶活定量分析结果表明,带有nos-T及rbc-T的转基因小麦中均能检测到GUS基因不同程度的表达。因此认为,豌豆终止子rbc-T可以代替农杆菌终止子nos-T用于小麦的转基因研究。     

可去除选择标记的转Bt基因抗虫玉米研究

将组成型表达的玉米泛素启动子与苏云金杆菌杀虫蛋白基因Bt连接，插入根瘤农杆菌双T-DNA质粒，构建一个T-DNA结构域含有抗潮霉素选择标记基因hyg，另一个T-DNA结构域含有抗虫基因的双T-DNA单子叶植物表达载体，用以转化农杆菌菌株，再通过共培养转化玉米胚性愈伤组织。通过潮霉素培养基抗性筛选，用特异PCR扩增和Southern杂交检测，从分化再生的T0代植株中，鉴定出4个转化Bt基因的阳性植株。目前，正结合进行田间分离纯合和DNA分子鉴定，培育去除选择标记基因的转基因抗虫玉米自交系。     

猪α乳清蛋白基因双元载体的构建和转化拟兰芥植物

将人工合成的植物化的猪α乳清蛋白基因编码区克隆到载体中,构建了带有35 S启动子--猪α乳清蛋白基因--终止子表达单元的双元载体,采用农杆菌法对拟兰芥进行植物转化.利用该双元载体上的除草剂抗性基因(Bar基因)为选择性标记进行筛选,获得了一些抗除草剂的转化植株.对转化植株后代植进行猪α乳清蛋白基因的PCR检测,证实外源猪α乳清蛋白基因已整合到植物基因组DNA中.     

葡萄糖氧化酶基因植物表达载体的构建

为进一步开展转基因研究创造条件,用限制性内切酶将葡萄糖氧化酶(GOD)基因从pMD/GO载体上切下,定向连接到植物表达载体pROKⅡ的CaMV35S启动子下游和NOS终止子上游,成功地构建了GOD基因植物表达载体pROK/GO。利用冻融法将此表达载体导入根癌农杆菌LBA4404中,提取转化质粒,经PCR和酶切鉴定表明,GOD基因植物表达双元载体构建成功。     

上西早生柿ETR5基因RNAi植物表达载体构建及遗传转化研究

据已测序的上西早生柿ETR5基因序列,设计了2对带限制性内切酶位点的特异性引物,以测序质粒为模板,PCR扩增到2个ETR5-Uenishiwase基因片段。2个片段经单酶切消化后连接成反向互补的大片断。连接片断经双酶切消化后,定向连接到植物表达载体pSMAK321的35S启动子和NOS终止子之间,构建成Uenishiwase-ETR5基因的RNA干扰植物表达载体。载体质粒经酶切鉴定正确后通过冻融法转入根癌农杆菌EHA101中。以上西柿组培苗叶片为外植体,优化遗传转化体系,结果表明:农杆菌重悬液和共培养基中均添加200μmol/L的AS及Spc梯度筛选能有效提高转化率。转化植株经PCR检测得到7株阳性植株。     

农杆枪法基因遗传转化技术初报

为提高遗传转化的效率,克服受体范围的限制,采用农杆枪法进行基因的遗传转化.根据已报导的VirD1和VirD2基因的序列设计特异引物,以农杆菌C58菌株的质粒为模板进行PCR扩增,对VirD1和VirD2基因进行克隆.将序列正确的VirD1和VirD2基因连接到植物表达栽体PBI121启动子CaMV 35S和终止子nos之间,构建VirD1和VirD2基因的表达载体pB-VirD1及pB-VirD2.经PCR及酶切鉴定,基因已成功构建到表达载体上,为农杆枪法进行目的基因转化的研究奠定了基础.     

草莓乙烯受体FaEtr2基因的克隆及其反义表达载体的构建

为了构建草莓乙烯受体FaEtr2基因的反义表达载体,在已报道的FaEtr2基因序列的基础上,设计特异引物,克隆草莓乙烯受体FaEtr2基因部分特异序列,将该片段反向插入植物表达载体pBI121的CaMV 35S启动子和NOS终止子之间,构建了反义表达载体pBI121Etr2。通过双酶切鉴定后,导入农杆菌EHA105中,酶切和PCR鉴定表明质粒已导入到农杆菌中。本研究为后期该反义基因转化草莓品种以改良草莓果实耐贮运性打下基础。     

甘蓝型油菜依赖焦磷酸的磷酸果糖激酶(PFK)基因片段克隆及hpRNAi载体构建

依赖焦磷酸的磷酸果糖激酶(PFK)是糖酵解途径的关键酶。本研究首先构建带有种子特异性napin启动子和Nos终止子的植物表达载体2300-nap及带有组成型35S启动子和Nos终止子的植物表达载体2300-35S;然后用PCR法从甘蓝型油菜(BrassicanapusL.)中油119总基因组中扩增出依赖焦磷酸的磷酸果糖激酶(PFK)基因片段,再以扩增出的PFK基因片段作模板设计引物扩增出一个相应的小片段。将两个PFK基因片段反向连接,插入到植物表达载体2300-nap的napin启动子和nos终止子之间,植物表达载体2300-35S的35S启动子和nos终止子之间,分别构建成可转录表达出发夹RNA(hairpinRNA,hpRNA)结构的种子特异型和组成型油菜RNA干扰载体,为今后油菜利用RNA干扰(RNAi)提高含油量的基因工程研究奠定了基础。     

植物乳杆菌lai基因同源重组敲除载体的构建与鉴定

植物乳杆菌中lai基因编码亚油酸异构酶可催化亚油酸转化生成共轭亚油酸,为了进一步研究lai基因的功能,利用同源重组基因敲除技术,成功构建用于敲除植物乳杆菌lai基因的同源重组敲除载体。这不仅为乳杆菌基因缺失工程菌的构建提供一个快速有效的手段,也为乳杆菌基因功能研究奠定基础。     

甘露糖正向筛选体系的建立及在拟南芥遗传转化中的应用

为了研究甘露糖正向筛选体系在拟南芥转化中的有效性,本研究参照GenBank上公布的PMI基因序列,通过PCR从大肠杆菌克隆了6-磷酸甘露糖异构酶(6-phosphomannose isomerase,PMI)基因,替换植物表达载体pCAMBIA1301中的潮霉素磷酸转移酶(hygromycin phosphotransferase,HPT)基因,并将以CaMV 35S和AmCBLIP两种启动子调摔的沙冬青AmCBL1基因成功地构建到重组载体pPMI上,并导入根癌农杆菌EHA105中,然后通过农杆菌花序浸染法转入拟南芥.将获得的阳性植株通过GUS组织化学法鉴定、氯酚红(chlorophenol red,CPR)法及PCR检测,证明PMI基因已经转入拟南芥中.在不使用抗生素和除草剂的情况下这种筛选体系为转基因拟南芥筛选提供了更加安全有效的方法,并且为以后AmCBL1基因的功能验证及植物抗逆性的改良奠定了基础.     

抗旱、耐盐基因P5CS植物表达双元载体的构建

以含有P5CS的重组质粒pBIP5CS—F129A为模板,通过PCR的方法获得了目的基因P5CS（1905bp）并将其克隆到pBS—T载体上。利用限制性核酸内切酶BamHⅠ和SalⅠ将P5CS基因从克隆载体上消化下来,定向插入到无GUS基因植物表达载体pCHF3的CaMV35S启动子和NOS终止子之间。通过冻融法将此表达载体导入农杆菌LBA4404中,经PCR鉴定表明,P5CS基因植物表达双元载体构建成功。     

家稗Pdk基因叶片特异性表达载体的构建及农杆菌的导入

【研究目的】构建含家稗Pdk基因的叶片特异性表达载体;【方法】通过PstI和SalI单酶切分别从质粒pRGN及pUCm-Pdk上获得Rubisco小亚基启动子和Pdk基因,将其连入表达载体pCAMBI1301, 并通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌EHA105;【结果】构建了由Rubisco小亚基启动子调控的Pdk基因植物表达载体p1301-Prbs-Pdk,选择标记基因为Hpt（潮霉素磷酸转移酶基因）,经酶切和PCR鉴定,表达载体已成功导入农杆菌EHA105中;【结论】丙酮酸磷酸双激酶（PPDK）是C4光合途径中的关键光合酶,本实验中构建了含有rbcs启动子的适于单子叶植物转化的Pdk基因表达载体,为提高转基因植物光合效率奠定了基础。     

GhWRKY44基因在烟草中遗传转化及功能分析

为了进一步验证GhWRKY44(登录号:KJ801807)基因在烟草异位表达后的功能,构建了Ca MV35S启动子调控、Nos为终止子的棉花抗枯萎病相关基因(GhWRKY44)的过表达载体;电击法将其导入农杆菌GV3101,菌液PCR筛选鉴定阳性菌株,采用农杆菌介导法转化烟草;T0转化植株经卡那霉素筛选、PCR检测后,随机从转基因T0中选取5株进行RT-PCR检测,均为阳性株,说明GhWRKY44基因不仅整合到烟草基因组中而且还能正常转录。对过表达GhWRKY44基因的转基因烟草T1株系进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析。结果表明,在正常生长情况下,PR5和NPR1的表达量在转GhWRKY44株系中明显增加,枯萎病菌侵染后,在转GhWRKY44株系中,PR1a、PR2和NPR1的表达量迅速增加,明显高于野生型株系,而PR5的表达量则低于野生型株系,说明该目的基因能在烟草中异位表达并能激活病程相关蛋白基因的表达,但其功能仍需进一步研究。     

苹果PGIP基因植物表达载体的构建及转化番茄的研究

为了验证苹果多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)基因表达产物对植物病原真菌的作用,获得转基因植株,培育抗病新品种,本研究用限制性内切酶SalⅠ、BamHⅠ将已克隆的苹果PGIP基因从克隆载体pMD-18T上切下,定向插入到植物表达载体pWR306的ED35s启动子和TNOS终止子中间,成功构建了苹果PGIP基因植物表达载体pWR306-PGIP及工程农杆菌,以番茄中蔬四号叶片及茎段为受体,通过农杆菌介导法转化,获得了8株PCR检测阳性的番茄植株.     

木质部特异性启动子缺失片段的克隆及功能分析

木质部特异性启动子可使外源基因在木质部中进行高效表达,本试验采用5'端系列缺失分析法,通过PCR扩增出杨树木质部特异性启动子MDCes AP中与其转录起始位点距离不同的5'端缺失的启动子片段MU2、MU4。将扩增片段替换植物特异性表达载体p BI121中的Ca MV35S启动子,使每个基因片段与载体中GUS报告基因相连得到重组质粒并转入农杆菌。通过烟草瞬时转化检测结果表明,缺失片段MU2、MU4均具有启动子功能,且两者活性均显著高于Ca MV35S启动子,并具有木质部组织特异性。木质部特异启动子结构特征和功能的深入研究将为确定其中决定木质部组织特异性的必要元件以及其他具有诱导活性的顺式作用元件奠定基础,从而为利用这些顺式作用元件调控外源基因在特定的时间、特定的组织器官高效表达提供可能。     

木霉双价基因表达载体的构建

利用几丁质酶基因和β-1,4-葡聚糖酶基因构建双价基因表达载体,为木霉转化奠定基础。利用限制性内切酶酶切得到目的基因片段,通过T4 DNA ligase将基因插入表达框中,并采用PCR、酶切和核苷酸序列分析验证双价基因表达载体的正确性。利用启动子CaMV35S和终止子PolyA构建几丁质酶基因chi42的表达框,获得表达载体pC1302-C42;利用启动子CaMV35S和终止子Nos构建β-1,4-葡聚糖酶基因glu14的表达框,获得表达载体pC1300-2-G14;在单基因表达载体的基础上,通过串联构建双价基因表达载体pC1300-2-G14-C42,该表达载体含有潮霉素B抗性基因。经检测证实表达元件35S-chi42- PolyA和35S-glu14-Nos连接成功。得到的双价基因表达载体pC1300-2-G14-C42可直接用于木霉等丝状真菌的遗传转化,为构建木霉广谱高效工程菌株奠定基础。     

携带结核杆菌Ag85B基因的植物表达载体的构建及鉴定

构建包含结核杆菌Ag85B基因的植物表达载体,并转化农杆菌LBA4404。以pcDNA3-Ag85B为模板,通过常规PCR克隆出Ag85B基因,定向克隆至含有玉米特异性启动子globulin-1的pCR2.1载体上,然后将globulin-1-Ag85B的融合片段酶切下来,并连接到经过加工修饰的含有抗除草剂基因bar的双元表达载体pCAMBIA1300上,将重组质粒转化至农杆菌LBA4404中。重组质粒双酶切可见0.8bp和10kb的两条特异性条带,与预期大小相一致。重组质粒测序表明克隆的Ag85B基因序列与Genbank上相一致,酶切从农杆菌中所抽提的质粒,片段大小与预期相一致。成功构建与转化了携带结核Ag85B基因的植物双元表达载体,为利用植物反应器生产口服结核疫苗奠定基础。     

一个含LoxP-FRT重组酶位点及易于操作的植物表达双元载体pYBA100

在农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的植物遗传转化中,常常需要用到植物表达双元载体。为便于基因工程操作并能在获得转基因植物后方便将标记基因删除,我们构建了植物表达双元载体pYBA100,以满足用于生产安全转基因植物的需要。本研究通过融合PCR方法,尽可能去除所有非必需的序列,将pYBA载体最小化。pYBA载体在大肠杆菌中为多拷贝,骨架为3.69kb。我们构建的含NptⅡ植物筛选标记基因的载体pYBA100仅为5.37kb,多克隆位点为22个,方便基因工程操作。载体pYBA100的T-DNA植物筛选基因表达框两侧预留有LoxP-FRT融合位点,方便在获得转基因植物后通过Cre或FLP重组酶将植物筛选标记基因删除。pYBA100载体能于大肠杆菌和农杆菌中自我复制,并成功转化了拟南芥,符合农杆菌介导的植物转基因要求。离体删除实验结果证明,载体pYBA100能经Cre重组酶删除植物标记基因表达框。     

乙醇酸氧化酶基因植物表达载体构建及转化苹果的研究

为了研究GO基因在植物中的功能,获得转基因植株,用限制性内切酶将乙醇酸氧化酶(GO)基因从克隆载体pBSSP5上切下,连接到植物双元表达载体pBin117的CaMV 35S启动子和NOS 终止子之间,成功构建了GO基因植物表达载体pBinGO.在此基础上以嘎拉苹果叶片为受体,通过根癌农杆菌介导法将GO基因导入苹果,获得了2个抗性芽,PCR检测初步表明GO基因已整合到嘎拉苹果基因组中.