黄果柑XET基因的克隆及其序列分析

以成熟的黄果柑果实为材料,根据已登录植物的XET基因并参考甜橙基因组设计特异性引物,采用同源克隆方法,获得黄果柑XET基因完整的编码区序列,命名为Cit XET。运用生物学软件对该序列及其编码的氨基酸序列进行相关生物信息学及结构功能分析,结果显示黄果柑XET基因长960 bp,与其它植物序列具有较高的同源性。该基因编码319个氨基酸,蛋白质分子量为37.4547 k D,等电点为9.05,分子式为C_(1724)H_(2548)N_*(448)O_(466)S_(14),是一个具有跨膜结构的亲水性蛋白。序列比对及进化树分析,XET在进化的过程中具有高度的保守性。同时,Cit XET蛋白二级结构有21%的α-螺旋,30.72%的延伸链,9.09%的β-转角,39.18%的无规蜷曲。黄果柑XET具有GH16等结构域,属于糖苷水解酶GH16超家族的成员,其含有该家族的特征基序DEIDFEFLG和β-卷芯(β-jellyroll)折叠结构,同时预测该蛋白质可能参与碳水化合物代谢,木葡聚糖代谢,细胞壁生物合成等过程。本研究分离鉴定了黄果柑XET基因,同时初步了解该基因的生物学信息,有助于进一步探讨其的表达模式和具体功能,为黄果柑果实品质的改善提供理论依据。     

大叶蛇葡萄类黄酮-3'-羟化酶基因(F3'H)的克隆及生物信息学分析

类黄酮-3'-羟化酶(F3'H)是黄酮化合物生物合成过程中的关键酶之一,本研究从大叶蛇葡萄转录组数据库中筛选出类黄酮-3'-羟化酶基因(F3'H),利用RT-PCR等技术克隆了其全长序列,并分析F3'H基因编码蛋白的理化性质和结构特征。结果表明,该序列全长为1 718 bp,开放阅读框(ORF)长度为1 530 bp,相对分子质量为55.89 kD,编码509个氨基酸,等电点为7.3,分子式为C_2(513)H_(3974)N_(696)O_(70)5S_(21),不稳定指数为38.26,为稳定蛋白;脂肪族指数为96.42,总平均疏水性为-0.004,为亲水性蛋白;具有多个磷酸化位点,有信号肽,存在一个跨膜区,亚细胞定位于内质网膜,二级结构以α-螺旋为主。系统进化分析和多重序列比对表明该序列与藤茶的亲缘关系最近。密码子偏性分析表明该基因以G/C结尾的密码子使用频率较高,最适合该基因的异源表达宿主是大肠杆菌。本研究结果为进一步研究大叶蛇葡萄F3'H蛋白功能,以及揭示该植物中具生物活性的黄酮类成分的生物合成机制提供了一定的基础。     

绒毛白蜡smh1基因编码区的克隆及序列分析

为探究绒毛白蜡smh1端粒结合蛋白基因在端粒中的作用以及在植物生长发育过程中的调控机制,进行绒毛白蜡smh1端粒结合蛋白基因克隆及分析。以绒毛白蜡幼苗为试材,Illumina Hi Seq 2000高通量测序技术获得的绒毛白蜡转录组Unigene数据为基础,采用RT-PCR方法克隆绒毛白蜡smh1基因编码区序列并进行生物信息学分析。结果表明:从绒毛白蜡叶片中成功克隆出一个smh类端粒结合蛋白基因编码区序列。基因编码区长度为879 bp,可编码292个氨基酸,分子量为31.66 k Da,等电点为6.5,原子总数为4457个,分子式为C_(1371)H_(2242)N_(392)O_(439)S_(13)。Conserved Domains数据库对蛋白质的保守结构域进行分析,结果显示该蛋白序列具有植物端粒结合蛋白Smh(single myb histone)亚家族典型的结构特征,包括位于N-端的Myb样结构域以及中间的组蛋白H1/5样结构域。将Fv Smh1端粒结合蛋白与含有telobox基序的其他端粒结合蛋白进行系统进化树的构建,结果显示SMH端粒结合蛋白与TRF1和TRF2同属一个分支,具有较近的关系。从上述分析结果可以推断所克隆的绒毛白蜡smh1基因可能对植物端粒结构的维持和功能的发挥具有重要作用。     

‘库尔勒香梨’自交不亲和S-RNase等位基因全长的克隆与分析

‘库尔勒香梨’是新疆重点发展的特色果树品种之一,具有自交不亲和性。本研究以新疆轮台国家果树资源圃栽培梨品种‘库尔勒香梨’为试材,利用梨S基因的保守序列设计合成的引物:‘FTQQYQ’/‘antiIIWPNV’初步确定‘库尔勒香梨’S-RNase等位基因型后,设计等位基因特异性引物,利用RT-PCR克隆两个花柱S-RNase等位基因cDNA片段,RACE(cDNA末端快速扩增)技术进行cDNA全长克隆,采用BLAST进行序列比对,Protparam等在线软件分析两个S-RNase等位基因的编码蛋白特性。根据NCBI上已登录的63条梨属S-RNase基因的全长序列,用DNAMAN软件对其氨基酸序列进行比对并用MEGA 4.0构建进化树。本试验从‘库尔勒香梨’中克隆得到了S_(22)-RNase(Gen Bank接受号:KX214125)/S_(28)-RNase(Gen Bank接受号:KX214124)等位基因cDNA的全长序列,为分子手段调控梨自交不亲和性状奠定了基础。S_(22)-RNase基因cDNA全长904 bp,ORF(开放阅读框)长684 bp,编码227个氨基酸;S_(28)-RNase基因cDNA全长921 bp,ORF长687 bp,编码228个氨基酸。BLASTP比对显示,这两个基因都具有保守的RNase-T2基因结构,属于RNase-T2家族。预测相对分子质量分别为25.6 k D和25.9 k D,等电点9.36和9.30,都属于亲水性蛋白。进化分析表明,‘库尔勒香梨’的S_(22)-RNase和S_(28)-RNase处在不同的两个分支上,表明两基因亲缘关系较远。     

马铃薯StNF-Y核转录因子基因的克隆和生物信息学分析

为了研究马铃薯StNF-Y基因在非生物逆境中的作用与功能,在马铃薯抗青枯病基因型ED13中克隆了1个新的NF-YC转录因子(StNF-Y),并对其进行生物信息学分析,预测其生物学功能。结果表明,StNF-Y基因的全长cDNA为1 132 bp,其开放阅读框为693 bp,编码230个氨基酸,氨基酸分子式为C_(1112)H_(1735)N_(317)O_(339)S_(10),等电点为5.37,含有13个磷酸化位点;StNF-Y蛋白分布在胞质中,无信号肽,属于亲水性蛋白,含有高度保守的结构域,属于BUR6 superfamily家族;二级结构显示,StNF-Y蛋白主要由45.65%的α-螺旋、5.65%的延伸链、45.22%的无规则卷曲和3.48%的β-转角组成。系统进化分析结果显示,马铃薯StNF-Y序列与番茄、辣椒和烟草NF-YC序列亲缘关系较近。此外,StNF-Y在多种植物胁迫中起作用。因此,推测StNF-Y可能参与马铃薯相关胁迫抗性的调节。研究结果可为以后进一步深入研究马铃薯StNF-Y的功能以及对逆境胁迫的抵抗机制提供理论依据。     

大豆GmVE2基因克隆及其在大豆籽粒维生素E动态积累中的表达分析

大豆GmVE2基因是一种NAD(P)H脱氢酶,主要存在于高等植物叶绿体类囊体膜上,可参与氧化应激反应以及叶绿体PSⅠ电子循环传递。为了探究其功能,通过RT-PCR方法从东农50中克隆获得GmVE2基因的CDS全长序列。利用ExPASy-ProtParam等在线软件对GmVE2蛋白序列进行理化性质分析,预测结果表明,GmVE2基因编码区共编码167个氨基酸,分子式为C_(904)H_(1326)N_(208)O_(246)S_(10),分子质量为19.364 3 ku,总原子数为2 694,理论等电点(pI)为4.78,脂肪指数为87.01;蛋白正负电荷残基数分别为11和23;GmVE2蛋白的不稳定系数和GRAVY值分别为25.02和0.043,说明该蛋白是稳定的疏水性蛋白;蛋白存在跨膜结构、信号肽和磷酸化位点。将线性植物表达载体与目的片段进行连接,成功构建pCambia3300-GmVE2植物表达载体。通过qRT-PCR技术和高效液相色谱(HPLC)分别对动态籽粒及组织基因表达量和维生素E含量进行测定,结果表明,该基因表达量与生育期籽粒维生素E含量呈负相关(-0.951~*),且维生素E含量在绿色组织中显著高于其他组织。本研究对大豆基因GmVE2与维生素E含量的调控关系进行初步研究,为高大豆维生素E含量的大豆新品种选育提供理论和实践基础,为后期研究GmVE2基因功能提供科学依据。     

胡桃楸成花相关LFY同源基因的克隆和序列分析

通过对胡桃楸成花相关LFY基因进行研究,对缩短胡桃楸童期,促进其提早开花结实有着极为重要的意义。采取PCR扩增技术,在NCBI数据库中进行搜索,查找到与目的基因有关联的同源序列;并根据这些有关联的序列来进行引物设计,扩增目的基因全长。克隆LFY基因cDNA序列全长为1 297 bp,其中CDS序列长1 158 bp,编码385个氨基酸。NCBI数据库Blast比对表明胡桃楸LFY同源基因与其他物种的LFY同源基因同源性均在80%以上。将胡桃楸LFY同源基因命名为JmLFY(GenBank登录号:KX364241)。通过BioEdit软件和ProtParam ExPASy在线软件分析胡桃楸JmLFY蛋白质分子式为C_(1878)H_(2962)N_(566)O_(578)S_(13),分子量为43 134.4 Da;理论等电点pI值为6.78;不稳定指数为39.92,属于不稳定蛋白质。该研究为进一步探索LFY基因对胡桃楸成花的影响提供依据。     

赤桉EcNha1蛋白结构预测与生物信息学分析

为了深入预测赤桉Nha1的蛋白结构与生物学功能,本研究使用生物信息学的方法对其进行分析。结果显示:该基因所编码蛋白的氨基酸残基数为365个,该蛋白的分子式为C_(1756)H_(2730)N_(504)O_(648)S_8,分子量为41.5 kD,蛋白等电点pI为4.27,带正电残基(Arg+Lys)为41个,带负电残基(Asp+Glu)为105个,不稳定系数为76.45,脂肪系数为59.48,总平均亲水性系数为-1.270;Nha1蛋白含有一个保守域Leo1;二级结构显示该蛋白主要由56.44%的无规则卷曲、25.21%的α-螺旋、15.89%的延伸链和2.47%的β-转角组成;三级结构的预测结果显示含有α-螺旋和β-转角;该蛋白定位于细胞核中,不存在信号肽序列,为非分泌性亲水蛋白,没有跨膜蛋白,共有19个磷酸化位点;进化树分析表明EcNha1蛋白是赤桉蛋白LEO1的同源体。结果为后续深入了解植物Nha1基因作用机制和赤桉EcNha1基因生物学功能研究提供参考。     

毛白杨PtoMnSOD基因克隆及生物信息学分析

为了揭示毛白杨锰超氧化物歧化酶基因PtoMnSOD在植物抗逆中的功能。本研究通过RT-PCR方法获取毛白杨PtoMnSOD基因序列,并对该基因及其编码蛋白进行生物信息学分析。结果显示:PtoMnSOD基因开放阅读框(ORF)为699 bp,编码232个氨基酸,具有PF00081和PF02777两个保守结构域,属于MnSOD亚家族。其编码的蛋白含有20个磷酸化位点,是无跨膜结构、无信号肽且定位于线粒体的不稳定亲水性蛋白。同源序列比对显示,不同物种的MnSOD氨基酸序列具有很强的保守性。研究结果为进一步开展毛白杨锰超氧化物歧化酶基因PtoMnSOD的功能研究奠定了理论基础。     

大豆异黄酮相关基因GmUGT73克隆及功能初步鉴定

UGT是一类糖基转移酶,它对黄酮类化合物进行糖基化修饰,合成异黄酮糖苷,在异黄酮的合成、转运、存储等方面发挥了重要的作用。为了探索UGT功能,通过RT-PCR方法从中豆27中克隆获得GmUGT73基因的CDS全长序列。利用ProtParam tool等在线软件对GmUGT73蛋白序列及理化性质进行分析,预测结果表明,GmUGT73基因的编码区编码464个氨基酸,分子质量为51.186 5 ku,理论等电点(pI)为6.27,总原子数为7 176,分子式为C_(2281)H_(3580)N_(608)O_(685)S_(22)。GmUGT73蛋白总正电和负电残基数分别为37和41,蛋白的不稳定系数为36.93,表明该蛋白较稳定,蛋白的脂溶指数为86.19,GRAVY值为-0.111,说明该蛋白为亲水性蛋白。将线性植物表达载体与目的片段进行连接,成功构建pCambia3300-GmUGT73植物表达载体,通过发根农杆菌介导法转化大豆毛状根并获得转基因阳性根系,利用高效液相色谱(HPLC)对根系进行异黄酮含量测定,结果表明,转基因阳性根中异黄酮含量与对照相比极显著提高(P0.01),说明该基因可能具有促进合成大豆异黄酮的功能。     

小麦抗坏血酸过氧化物酶TaAPX基因克隆与表达分析

为了研究非生物胁迫处理下小麦抗坏血酸过氧化物酶(APX)的作用,以小麦百农207为试验材料,根据小麦APX基因序列,采用RT-PCR技术对小麦APX基因进行克隆、生物信息学分析及组织表达模式分析;对小麦进行非生物胁迫处理,分析小麦APX基因在环境胁迫条件下的表达特征。结果表明,TaAPX基因包含876 bp的开放阅读框,编码1个291个氨基酸组成的蛋白质,分子质量为31.73 ku,等电点为7.74,分子式C_(1417)H_(2246)N_(394)O_(423)S_5,TaAPX可能是两性蛋白,无信号肽,为非分泌蛋白。蛋白质序列比对和进化树分析表明,小麦与大麦的APX编码蛋白的氨基酸全长序列相似性最高达到97.25%,亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析表明,TaAPX在小麦幼根、茎、茎节、幼叶、叶鞘、雌蕊和雄蕊中均有表达,其中在幼叶中表达量最高,其次是茎、茎节,在幼根、叶鞘中表达量较低,在雌、雄蕊中表达量最低。在非生物胁迫条件下该基因受干旱、低温胁迫表达增强,而在NaCl胁迫和渗透胁迫下表达降低。综上,获得了TaAPX基因的编码区序列,分析发现其响应干旱、低温和盐等逆境胁迫,提示该基因可能与小麦抗逆境机制密切相关。     

油茶CoSAUR32和CoSAUR50基因的克隆及表达分析

本研究以油茶‘华硕’为试验材料,通过PCR克隆获得两个生长素响应SAUR (Small auxin upregulated RNA)基因家族的基因,命名为CoSAUR32和CoSAUR50。CoSAUR32基因开放阅读框(ORF)为372 bp,编码123个氨基酸;CoSAUR50基因开放阅读框(ORF)为318 bp,编码105个氨基酸。序列分析发现CoSAUR32和CoSAUR50蛋白均无信号肽与跨膜结构,在叶绿体和细胞核中均可表达。对其进行同源性比对及进化树分析发现,油茶两个SAUR与茶树SAUR亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果表明,CoSAUR32和CoSAUR50基因在自交授粉子房中36 h时的表达量显著高于异交子房,在自交授粉花柱中24 h时的表达量显著高于异交花柱。推测CoSAUR32和CoSAUR50可能参与油茶自交不亲和过程。本研究为挖掘SAUR基因的功能及解析油茶自交不亲和分子机制提供参考依据。     

小麦谷胱甘肽S-转移酶基因的克隆及原核表达

为了进一步研究小麦谷胱甘肽-S-转移酶基因(TaGST)的功能,采用RT-PCR方法分离了小麦谷胱甘肽-S-转移酶基因(TaGST)的ORF全长c DNA,并进行了生物信息学分析。结果表明:小麦TaGST基因的ORF全长690 bp,编码229个氨基酸;TaGST蛋白分子质量为25.81 k Da,p I为5.29。系统进化分析表明,该基因编码蛋白与水稻OsGST蛋白的氨基酸同源性最高,与已知植物GST家族成员的氨基酸序列聚类分析将TaGST聚为Phi类GST。构建原核表达载体p ET32-TaGST,对TaGST基因进行原核表达,SDS-PAGE结果表明,其所表达蛋白与预期蛋白大小一致。为进一步研究该基因的特性和功能奠定了理论基础。     

橡胶树胶孢炭疽病菌Cg4LysM基因对菌丝生长的影响

本研究通过PT-PCR技术克隆了橡胶树胶孢炭疽病菌的1个候选效应蛋白基因并命名为Cg4LysM。该基因含1 983 bp的完整开放阅读框(ORF),编码660个氨基酸的多肽。生物信息学分析结果表明,该蛋白含有4个LysM保守结构域,不含任何跨膜结构域,其1~20位氨基酸是典型的信号肽序列,推测为胞外分泌蛋白。氨基酸序列比对结果表明,Cg4LysM与草莓胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides Nara gc5)、高粱炭疽病菌(Colletotrichum sublineola)、石膏样小孢子菌(Microsporum gypseum CBS)的LysM蛋白同源,同源性分别为97%、59%、55%。此外,本研究根据同源重组的原理构建了该基因的敲除突变体△Cg4LysM,进一步分析发现,△Cg4LysM的生长速度慢于野生型菌株,暗示Cg4LysM与胶孢炭疽菌的生长有关。     

石蒜LrCMO基因的克隆及表达分析

以石蒜(Lycoris radiata)为试材,采用同源克隆和RACE的试验方法,克隆得到LrCMO基因全长cDNA,并对其进行了基因表达分析。结果表明:LrCMO基因全长1 472 bp,其中开放阅读框(ORF)为1 281 bp,编码427个氨基酸残基,预测编码蛋白质的分子量为47.92 kD,理论等电点为5.72;LrCMO是一个稳定的疏水蛋白,不具有跨膜结构,含有叶绿体导肽;LrCMO基因编码的氨基酸与植物其他CMO蛋白具有较高的一致性,且与海枣PdCMO、香蕉MaCMO及油棕EgCMO亲缘关系最高,聚为一类。实时荧光定量PCR分析表明,LrCMO在根、鳞茎和叶片中有表达,且在鳞茎中的表达量最高;LrCMO受聚乙二醇(PEG)处理的诱导表达,其基因相对表达量在处理后12 h达到最高。随着处理时间的延长,LrCMO基因相对表达量逐渐下调至对照水平。     

胡杨耐盐基因PeuHKT1的克隆与表达分析

阳离子转运载体HKT(high-affinity K~+transporter)类蛋白既是高亲和的K~+转运载体,也是一种Na~+转运体,具有Na~+和K~+转运的双重功能,对调节细胞内Na~+/K~+动态平衡起着决定性作用。胡杨长期生长在盐渍化和干旱的土壤环境,对高盐和干旱形成了极强的适应能力,是典型的耐盐抗旱植物,成为研究多年生林木抗逆适应机制的理想材料。以胡杨根系为材料,本研究克隆鉴定了一个胡杨Peu HKT1基因,该基因含有3个外显子和2个内含子;其c DNA全长为1 076 bp,包括13 bp的5'端非翻译区(5'UTR)和232 bp的3'端非翻译区(3'UTR);长831 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF)可编码276个氨基酸;其编码蛋白含有丰富的α-螺旋,存在多个跨膜结构域,蛋白质相对分子量(MW)为31.54 k D;理论等电点(p I)9.36;实时定量PCR技术构建了Peu HKT1基因在高盐胁迫条件下的动态表达模式,探讨了该基因参与胡杨高盐胁迫响应的信号转导途径。     

转基因烟草中半胱氨酸跨膜基因CYS生物信息学分析

在烟草中过量表达MYB转录因子LrAN2,能够激活上调花青素生物合成代谢通路,但富含半胱氨酸跨膜结构域蛋白A (CYS)的表达量明显降低。作为植物中一种重要的生物氨基酸,CYS的生物学研究鲜有报道。本研究克隆烟草的CYS基因,其全长为282 bp,编码氨基酸数94个。预测编码的蛋白分子量和等电点分别为24 019.84 Da和5.23,并且序列中没有保守区。实验结果显示该蛋白具有亲水性,主要由α-螺旋(19.35%)和无规则卷曲(65.59%)构成,CYS蛋白质不通过跨膜区,在膜外进行作用。系统发育树显示,烟草CYS基因与辣椒CYS基因亲缘关系最近,其次是番茄的HTC基因和WIH2基因。本研究结果克隆并分析CYS基因编码区序列,为CYS基因的功能研究提供参考依据。     

橄榄类黄酮3'-羟化酶CaF3'H基因的克隆及其表达特性分析

以‘清榄一号’橄榄(Canarium album)果肉为材料,通过RACE技术克隆得到橄榄类黄酮3'-羟化酶(F3'H)cDNA序列全长,命名为CaF3'H(GenBank登录号KY189088.1)。CaF3'H全长为1 649 bp,包含一个1 554 bp开放阅读框(ORF),编码517个氨基酸,5'和3'非编码区(UTR)长度分别为40 bp和55 bp,编码的氨基酸序列含有P450结构域和半胱氨酸亚铁血红素结合域保守区。氨基酸多重比较分析表明:橄榄和芒果的氨基酸序列相似性为78.89%,较之于其他物种相对最高。蛋白结构预测结果显示,CaF3'H蛋白呈弱亲水性,存在跨膜结构域,没有信号肽。实时荧光定量PCR分析显示,CaF3'H在‘清榄一号’和‘檀香’2个橄榄栽培品种的表达量在花后50 d达到最大值,此后其表达量随果实的成熟呈现出波动,总体表达量比花后50 d都低,这与橄榄生长发育时期多酚含量的变化趋势相符,推测CaF3'H基因在调控果实多酚含量过程中发挥着重要作用。     

巴西橡胶树膜结合NAC转录因子HbNTL1的克隆及生物信息学分析

本实验根据巴西橡胶树胶乳cDNA文库中筛选到的NAC EST序列,克隆了橡胶树膜结合NAC转录因子,HbNTL1的cDNA和基因组DNA序列。生物信息学分析显示HbNTL1基因包含6个外显子和5个内含子,开放阅读框(ORF)为1704bp,编码了567个氨基酸。HbNTL1编码蛋白的相对分子量为62.52 kDa,理论等电点PI为4.62,N-端具有保守的NAC结构域,高度变异的C-端有一个跨膜结构域(TM)。序列比对和系统进化分析表明HbNTL1蛋白属于NAC转录因子家族中的NAC2亚族,推测其可能与橡胶树生长发育和胁迫应答有关。     

葡萄CO4基因的克隆及其对光质响应的表达分析

为了探究不同光质以及转光条件对葡萄CO4基因表达水平及试管苗叶绿素荧光参数的影响,利用RT-PCR技术,从葡萄贝达试管苗中克隆了一个光质响应基因CO4(Gen Bank登录号为KY652090),并对其进行生物信息学以及q RT-PCR分析。结果表明,CO4基因片段全长663 bp,编码了248个氨基酸,其开放阅读框为747 bp;葡萄CO4有4个跨膜区,预测其为跨膜蛋白;葡萄CO4的分子式为C_(1253)H_(1990)N_(324)O_(340)S_(11),预测是疏水性不稳定蛋白。系统进化树分析表明,该蛋白与巨桉CO4最为相似。经荧光实时定量PCR分析表明,在红光转蓝光处理下葡萄CO4表达量显著高于白光(对照),是对照的5. 39倍;其次为蓝光处理;在白光转蓝光条件下CO4表达量最低,是对照的54%;红白转光处理下CO4表达量与对照无显著差异。叶绿素荧光参数分析结果显示,红光转蓝光处理后的Fv/Fm(最大光化学效率)、Fv/Fo(潜在活性)和q P(光化学猝灭系数)均显著高于对照,NPQ在该处理下(非光化学猝灭系数)最低;在红光处理下NPQ最高,Fv/Fm、q P最低。葡萄CO4对光质敏感,且在不同光质及转光条件下其响应水平不同,红光转蓝光处理下上调表达显著,且该光照条件下能显著促进葡萄试管苗的光化学能力。为深入研究CO基因在葡萄试管苗感光机理中的作用提供理论依据,并为葡萄光质改良奠定基础。