多重PCR技术鉴定番茄Ty-2和Ty-3基因及田间验证

本研究采用多重PCR方法对与抗番茄黄化曲叶病毒病（tomato yellow leafcurl virus,TYLCV）的Ty-2和Ty-3基因紧密连锁的共显性SCAR标记进行扩增筛选,不同基因型（Ty-2/Ty-2,Ty-2/ty-2,ty-2/ty-2,ty-3/ty-3）的材料扩增出不同长度的特异片段,建立了一种快速检测抗TYLCV基因的技术。利用该技术对22份番茄材料进行检测,同时利用普通PCR对上述材料进行检测,两者结果完全吻合。最后用田间自然发病的方法在大田对这些材料抗性进行验证,符合率达86.4%。     

番茄Ty-2、Ty-3和I-2基因多重PCR鉴定技术

本研究利用分别与抗番茄黄化曲叶病毒病(tomato yellow leaf curl virus disease,TYLCVD)基因Ty-2、Ty-3紧密连锁的共显性分子标记T0302、P6-25,与抗番茄枯萎病(Fusarium vascular wilt)基因I-2紧密连锁的显性标记Z1063,建立了能同时鉴定番茄Ty-2、Ty-3和I-2基因的多重PCR技术。利用该技术对24份番茄材料进行基因型鉴定,其结果与田间接种鉴定结果吻合率达91.7%。该体系简易快捷、无需酶切,只需一次PCR即可完成鉴定工作,不失为番茄多基因聚合育种、抗性资源鉴定的有效工具。     

多重PCR技术鉴定番茄Ty-1和Mi基因

利用同一PCR反应体系,对分别与番茄(Lycopersion esculentum)抗黄化曲叶病毒(Tomato YellowLeaf Curl virus)病的Ty-1基因和番茄抗根结线虫(root-knot nematode)的Mi基因紧密连锁的SCAR标记进行同时扩增筛选,扩增的特异性片段与单引物扩增片段完全吻合.与Ty-1基因紧密连锁的SCAR1标记为共显性标记,抗感材料均产生398 bp的特异片段,纯合和杂合抗病基因型存在TaqⅠ酶切位点,酶切后分别产生了303 bp和95 bp以及398 bp、303 bp和95 bp的特异性片段,而感病基因型无此酶切位点.与Mi基因紧密连锁的SCAR2标记也为共显性标记,抗感材料均产生750 bp的特异片段,纯合和杂合抗病基因型存在TaqⅠ酶切位点,酶切后分别产生了570bp和180bp以及750bp、570bp和180bp的特异性片段,而感病基因型无此酶切位点.酶切结果仍为750 bp的产物.经反复验证,结果准确可靠,可以用于在同一PCR反应体系中对两个抗病基因进行同时筛选鉴定.     

番茄黄化卷叶病毒病抗病基因Ty-1的CAPS标记建立

本研究旨在筛选获得与番茄黄化卷叶病毒抗病基因Ty-1紧密连锁的分子标记,为番茄抗病育种提供技术支撑。根据与抗病基因Ty-1紧密连锁的RFLP标记序列设计特异引物,以抗病杂合体（Ty-1/ty-1）、抗病纯合体（Ty-1/Ty-1）和感病纯合体（ty-1/ty-1）材料提取的DNA为模板,进行PCR扩增,而后经不同的核酸内切酶酶切处理,筛选获得与Ty-1基因紧密连锁的CAPS标记。结果显示从4个标记中筛选获得了2个稳定可靠的CAPS标记,即TG97和Mi23。TG97标记在抗病杂合体产生398 bp、303 bp和95 bp 3个特异片段,抗病纯合体产生303 bp和95 bp 2个特异片段,感病纯合体产生398 bp一个特异片段。Mi23标记在抗病杂合体产生402 bp和354 bp 2个特异片段,抗病纯合体产生402 bp一个特异片段,感病纯合体产生354 bp一个特异片段。研究结果表明TG97和Mi23这2个CAPS标记均为共显性标记,可用于番茄抗病育种的辅助选择中。     

番茄实用化PCR分子标记反应体系与程序优化

为了提高抗病性分子标记检测的效率,为番茄病害检测及多抗品种选育提供技术依据,本研究通过改良CTAB法、96孔深孔板快速提取番茄微量叶片DNA;利用抗根结线虫病Mi标记,在L16(45)正交设计试验基础上,采用直观量化分析和方差分析两种方法,对番茄实用化PCR分子标记PCR反应的5个因素(引物, Mg2+, dNTPs,模板DNA和Taq酶)进行优化;随后分别筛选黄化曲叶病毒病、烟草花叶病毒病、根结线虫病、枯萎病、叶霉病和颈腐根腐病6种病害的8个实用化PCR分子标记PCR程序的退火温度;并对循环次数进行筛选;最后利用优化后的PCR体系与程序对供试的1 442份番茄材料(包括番茄种质资源,群体材料,组合及品种)进行抗病性鉴定。结果表明番茄实用化PCR分子标记的PCR最佳反应体系(20μL)为引物0.5μmol/L、Mg2+1.5 mmol/L、dNTPs 0.3 mmol/L、DNA 480 ng DNA、聚合酶1.0 U Taq;PCR程序中8个分子标记共同最适退火温度为56℃,最佳循环次数为33次;筛选出585份多抗(含2种以上的抗病基因)番茄材料,可作为中间材料或亲本材料进行多抗品种选育。该实用化PCR分子标记的PCR体系的建立为番茄利用抗病基因分子标记检测与筛选多抗种质资源、品种或群体材料提供了标准化的程序。     

番茄黄化曲叶病毒病抗病基因的PCR检测

番茄黄化曲叶病毒病是一种严重威胁全世界番茄生产的病害,培育抗病品种已成为防治该病害的主要技术手段.番茄黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-1和Ty-3为不完全显性遗传,本研究采用PCR技术,对来自于内蒙古包头市农业科学研究所的11份番茄抗病、耐病及感病育种材料进行了抗病基因Ty-1及Ty-3的检测,并对Ty-1抗性基因进行Taq I酶切.结果发现,11份育种材料中,材料3和材料7中含有Ty-1及Ty-3抗性基因,材料1、材料4、材料5及材料7中含有Ty-3基因,其余材料无抗病基因.研究结果对准确鉴定番茄育种材料的黄化曲叶病抗病基因,抗病育种材料的辅助选择及缩短育种周期具有重要意义.     

番茄黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-3a分子标记的筛选及定位

本研究利用番茄黄化曲叶病毒病高感染株系7969-19-1-1-3及其高抗番茄黄化曲叶病毒病的株系Z3(Ty-3a)构建了包含1 404个单株的F2分离群体,并利用分子标记技术对其进行了分析。研究结果显示,在348对SSR、CAPS、SNP、Indel以及RFLP引物中,在双亲间有68对引物扩增出多态性差异,利用获得的68对引物对抗感池进行筛选,获得了7对多态性的标记C2_At3g56230、X38、H5、C4、TGS2216、X1和H12。为了进一步缩小区间,利用F2群体的1 404个单株进行连锁分析。在C2_At3g56230-H12区间寻找新的标记,最后将Ty-3a定位于标记TGS12660和TY3a-P19之间,2个标记的之间的物理距离约为29.7 kb,遗传距离约为0.3 c M。研究结果可为进一步克隆Ty-3a基因和分子标记辅助选择培养抗番茄黄化曲叶病毒番茄新品种奠定基础。     

普通菜豆抗炭疽病基因SCAR标记鉴定

利用12个菜豆品种（鉴别寄主）评价了7个抗炭疽病基因SCAR标记的可靠性和实用性,其中SBB14_1150/1050标记引物扩增没有特异性,SAS13₉₅₀没有扩增带。用5个可靠的菜豆抗炭疽病基因SCAR标记（SCAreoli₁₀₀₀、SH18₁₁₀₀、SAB3₄₀₀、SB12₃₅₀ 和SCF10₁₀₇₂）,对127份普通菜豆抗炭疽病品种进行抗炭疽病基因分子标记鉴定,82份未检测到SCAR标记,45份分别含有1~3个SCAR标记;检测到SCAR标记的资源中,13份含有SCAreoli₁₀₀₀标记,13份含有SH18₁₁₀₀标记,5份含有SAB3₄₀₀标记,9份含有SB12₃₅₀标记,11份含有SCF10₁₀₇₂标记。分析表明抗病品种含有的抗病基因标记与品种来源存在相关性。     

番茄育种种质对南方根结线虫抗性评价及Mi-1基因检测

本研究以自育的26份番茄育种种质和抗南方根结线虫番茄品种‘仙客1号’及感南方根结线虫品种‘阿乃兹’为试验材料,采用病土盘栽自然发病鉴定、苗期二龄幼虫人工接种鉴定和PCR扩增及CAPS检测相结合的方法,研究供试材料对南方根结线虫的抗性水平及基因型。鉴定结果表明,供试的28份番茄材料中,高抗17份、抗病6份(包括抗病对照‘仙客1号’)、感病2份、高感3份(包括感病对照‘阿乃兹’),无免疫材料,且病土盘栽鉴定与苗期接种鉴定的结果一致。PCR扩增结果表明,27份番茄材料均能检测到一条750 bp的特异条带;TaqⅠ酶切结果显示,具有酶切位点的22份试材中有15份含纯合显性Mi-1/Mi-1基因、5份含杂合显性Mi-1/mi-1基因、2份含180 bp+250 bp+300 bp三条特异性片段,并且这22份试材对南方根结线虫表现高抗或抗,而其余5份不含显性Mi-1基因的试材则表现高感或感,证明Mi-1是具有抗南方根结线虫能力的基因,分子检测结果与病土盘栽鉴定和苗期接种鉴定的结果吻合率达92.6%;含有180 bp+250 bp+300 bp三条特异性片段的高抗材料可能含有其它抗根结线虫基因。分子检测与抗性鉴定相结合,能为创制抗南方根结线虫新种质提供一种更加省时、省力且经济有效的科学育种方法,可为番茄抗南方根结线虫育种提供理论依据和实践经验。     

贵州小麦糯性基因多重PCR体系的优化

为建立通过单次反应过程同时鉴定出贵州小麦品种(系)中3个糯性基因(Wx-A1、Wx-B1和Wx-D1)的多重PCR反应体系,选择与小麦糯质基因(Wx-A1 a,Wx-B1 a和Wx-D1 a)连锁的3个特异分子标记MAG 264、BDFL/BRD、MAG 269对供试糯小麦杂交后代F3代中的3个糯质基因(Wx-A1,Wx-B1和Wx-D1)进行分子标记检测,优化多重PCR的反应体系及条件,筛选出含有糯质基因的部分糯小麦或全糯小麦。     

番茄枯萎病抗性基因I-2的显性分子标记及其应用

番茄是世界上最主要的蔬菜作物之一,番茄枯萎病(Fusarium oxysporumf.sp.lycopersici)的发生和蔓延使番茄生产受到严重影响,培育抗枯萎病的番茄品种是控制该病害最经济有效的方法.本研究根据I-2的基因序列设计特异扩增引物,以不同抗病基因型的番茄为材料,扩增I-2基因3 132～3 640 bp之间的单拷贝片段,基因型为I-2/-的材料均特异地扩增出一条509 bp的条带,而基因型为i-2/i-2的材料均无扩增条带.从而可建立了I-2基因的显性标记,对I-2基因进行分子识别.在此基础上,利用该标记对16个主要番茄品种进行了I-2基因鉴定,其中8个品种含有I-2基因.另外,本研究通过一次PCR和一次HindⅢ酶切建立了I-2和Tm-22双基因检测体系,为多基因鉴定及标记辅助选择提供了有力工具.     

利用分子标记鉴定白菜细胞质雄性不育类型的研究

通过对9份白菜细胞质雄性不育材料的不育胞质类型进行分子标记鉴定,以期为今后更好的利用分子标记来进行辅助育种奠定基础。通过CTAB法提取白菜的基因组DNA,根据GenBank中orf138基因保守序列设计2对特异引物,对9份白菜基因组DNA进行PCR扩增,将扩增出条带的PCR产物进行测序,在NCBI中进行同源性比对,最终确定其不育胞质类型。结果表明：2对特异引物PI/PII和PIII/PIV只在4份白菜雄性不育基因中均扩增出条带,在另外5份材料中未扩增出条带,与田间育性鉴定相符,获得4份白菜Ogura胞质雄性不育的分子标记;在GenBank中用BLAST进行同源性比对分析,发现L1-CI、L3-CI、L3-F1 3个不育材料的特异片段与已报道的青花菜Ogu CMS所具有的Ogu orf138基因（Genbank登录号：HQ149728）同源度高达100%,L1-F1的同源度达99%,出现了一个变异位点,另外5份材料的胞质不育类型有待进一步研究。通过该方法鉴定出9份材料中有4份材料是萝卜胞质雄性不育的材料,得到了4条分子标记,该结果可为白菜细胞质雄性不育的分子鉴定提供了新的标记,也为今后利用分子标记辅助育种奠定了基础。     

玉米简易多重SSR-PCR和荧光标记检测技术

玉米是世界重要的粮食和饲料作物,通过深入研究玉米分子育种技术来提高玉米产量显得尤为必要。为了获得快速、高效的玉米DNA分子标记检测技术,本研究以玉米为试验材料,开发出一套简易、快捷的多重SSR-PCR技术和荧光标记检测方法。结果表明:2次SSR-PCR反应和1次毛细管电泳荧光检测,可以鉴定11对二等位基因多态引物,扩增方面与常规PCR反应相比效率提高了5.5倍,基因型检测方面与常规聚丙烯凝胶电泳相比效率提高11倍。利用扩增试剂盒(Mutiplex)的多重PCR扩增方法简单、稳定,取得了比较理想的玉米SSR快速高效的标记检测效果,适于在不同实验室移植。     

8个水稻抗条纹叶枯病分子标记有效性的验证及评价

利用已报道的8个与水稻条纹叶枯病抗性基因Stv-bi连锁的标记,即SCAR标记ST-10;STS标记H11-8、H11-12;InDel标记M68.4和M79.1以及SSR标记RM21-8、RM21-15、H21,结合田间抗性鉴定,对24份水稻品种(系)(包括2份抗、感对照)以及2个抗感组合的F2分离世代进行抗病性分析、筛选和评价,旨在有效利用抗病资源选育抗病新品种,并对这8个分子标记的有效性和选择效率进行验证比较,筛选出高效的辅助选择分子标记。结果表明,仅有SCAR标记ST-10和STS标记H11-8的分子检测与田间表型鉴定的吻合率超过或接近90%,其余分子标记均低于80%,其中,3对SSR标记在抗感材料中几乎没有多态性。比较而言,SCAR标记ST-10更能有效地用于条纹叶枯病抗性材料的筛选,结合使用STS标记H11-8更能准确有效地检测Stv-bi基因的存在,进一步提高选择效率。     

黄化曲叶病毒分子标记在番茄育苗中的应用

用DNA分子标记技术,对21份番茄种苗进行黄化曲叶病毒病(TYLCV,TY)抗病基因及病毒病感染检测。结果表明:9份材料携带ty-1/ty-1、ty-2/ty-2和Ty-3a/ty-3a抗性基因,1份材料携带ty-2/ty-2和Ty-3a/ty-3a抗性基因;自根苗欧迪斯、嫁接苗金棚/11-8、金棚/荣威和金棚/双飞8号已经感染TY。种苗进行田间种植,其中携带抗性基因的番茄品种没有发生TY,抗性较强;在已感染TY的4份材料中,欧迪斯田间表现感染TY,其余3份未发生TY。试验表明,TY分子标记技术检测可靠,可以在番茄育苗生产中推广应用。     

番茄黄化曲叶病毒病抗性鉴定技术研究

番茄抗病材料的创制及其准确有效的抗性鉴定方法是番茄抗病育种的关键.本文比较研究了烟粉虱侵染接种鉴定技术、分子标记鉴定技术和田间自然接种法对58份番茄抗黄化曲叶病毒病材料的抗性鉴定结果.结果表明:分子标记检测与烟粉虱侵染接种鉴定方法相结合可作为鉴定材料对番茄黄化曲叶病毒病抗性的有效方法;对含有已知基因抗源材料的分离群体,...     

小麦基因组的一种简易提取方法

摘要：【研究目的】在综合分析多种提取小麦DNA方法的基础上,改良发展了一种快速简便高效的小麦基因组DNA提取方法。【方法】以春小麦Thatcher和以Thatcher为背景的近等基因系TcLr19,TcLr20, TcLr28为材料,改进后的方法提取的基因组DNA用抗叶锈基因Lr20的STS标记、Lr19和Lr28的SCAR标记、Lr28的SSR 标记进行PCR扩增,【结果】各分子标记都扩增出条带清晰正确的目的片段【结论】这表明该方法能够获得适用于STS、SCAR、SSR标记PCR扩增的高质量的DNA,而且该DNA简易提取方法加快了DNA提取速度、降低了污染源和成本,为大批量提取DNA提供了技术支撑。     

辣椒杂交种纯度快速鉴定体系建立与应用分析

为了解决辣椒杂交种快速鉴定的问题,有必要建立辣椒杂交种的室内纯度鉴定体系,以兴蔬种业的32个品种的父本、母本和F1共96份为试验材料,利用150对SSR引物对96份材料进行了PCR扩增,寻找扩增差异。扩增结果发现,150对引物中51对能扩增出清晰条带,19对多态性较好,5对引物能够区别兴蔬种业32个品种的父本、母本及其F1。SSR分子标记能够快速准确地鉴定辣椒杂交种纯度与田间鉴定结果一致且成本低廉。     

蔬菜分子育种获重要进展——自主开发实用分子标记技术并逐步应用

我国蔬菜作物分子标记辅助育种研究取得重要进展。自主开发了一些实用性较强的分子标记技术。先后建立了ERPAR、多重PCR和共显性SCAR等简单PCR标记技术。利用这些技术,成功地对甘蓝显性雄性不育基因,番茄线虫、ToMV等多种抗病性基因,番茄红素相关基因等进行了标记辅助选择。     

结球甘蓝(Brassica oleracea var. capitata)迟抽薹基因SCAR标记转CAPS标记

为了更加精确结球甘蓝迟抽薹基因标记。本研究以结球甘蓝冬性强的迟抽薹材料‘P02’和冬性弱的易抽薹材料‘A21’杂交得F1代,F1代自交至F3代为试验材料,并以课题组所设计的特定序列扩增(sequence characterized amplified regions, SCAR)标记的SCN1/248为引物。在F3代的785株结球甘蓝中有711株扩增出目的条带,有74株未能扩增出目的条带。经测序,该序列长度为248 bp,运用该序列共设计3对酶切扩增多态性序列(cleaved amplified polymorphic sequence, CAPS)引物,其中1对引物均扩增出目的条带,多态性消失,另外两对分别命名为SC01和SC02。结合田间127株结球甘蓝抽薹性状调查,有65株表现为迟抽薹,59株表现为易抽薹,3株表现为中间型,与SCAR扩增检测结果基本一致,将SCAR标记转换成CAPS标记,建立CAPS标记体系。本研究进一步精化了分子标记辅助选择,为做精确定位功能基因,选育优良的迟抽薹结球甘蓝品种提供了理论依据。