辣椒14-3-3蛋白基因家族全基因组鉴定与表达特征分析

14-3-3蛋白(GRF)基因家族通过与靶蛋白相互作用,广泛参与植物激素信号转导和生理代谢过程,在植株生长发育和逆境响应中发挥重要作用。本研究以辣椒(Capsicum annuum)为材料,利用生物信息学研究方法,鉴定得到15个辣椒14-3-3基因家族成员,命名为CaGRF1～CaGRF15。系统分析了CaGRF基因家族成员的结构、进化关系、启动子顺式作用元件、组织及冷胁迫表达,并对CaGRF蛋白互作网络进行预测。结果表明,根据进化关系CaGRF家族成员被分为ε类和非ε类,ε类CaGRF含有更多外显子和内含子;启动子序列分析发现CaGRF启动子中有多个响应激素、胁迫、光的顺式作用元件;表达分析表明CaGRF各成员在辣椒各组织和冷胁迫响应中特异性表达;蛋白互作网络预测发现CaGRF可能与氮代谢、质子转运、转录调控相关蛋白互作。本研究为深入研究辣椒14-3-3家族成员功能及调控途径提供了参考。     

大豆转录因子GmMYB52的克隆、表达及结合功能分析

MYB类转录因子在植物的生长发育和逆境响应中有重要的调控作用。依据课题组前期获得的盐胁迫相关的数字表达谱(DGEP)数据,获得盐胁迫响应显著上调基因GmMYB52,利用RT-PCR方法从栽培大豆(Williams 82)中克隆该基因片段,并与已公布的Williams 82基因组数据库序列比对,该基因与GmMYB52序列一致。生物信息学分析表明,GmMYB52编码区(CDS)全长1083 bp,编码360个氨基酸。其编码的氨基酸序列具有MYB类转录因子的共同特征,其距N端110~160氨基酸残基处有MYB结构域;系统进化树分析表明,该基因编码的蛋白与GmMYB62、拟南芥AtMYBSt1、苜蓿Mt MYB52、水稻Os MYBS3及木豆Cc MYB-like protein J的亲缘关系最近;实时荧光定量PCR结果表明,大豆根部GmMYB52的转录水平受外界非生物逆境的调控,用脱落酸(ABA)和低温(4℃)处理后12 h明显上调,用氯化钠和PEG处理0.5~24.0 h后检测到GmMYB52的转录水平在50%~600%区间内呈现出先上调后下调再上调的趋势。GmMYB52为组成型表达,在大豆的幼苗期和开花期表达较多,在成熟期表达相对较低。GmMYB52在茎叶与开花期的花中表达较强,在根的表达较弱,而在成熟期的豆荚中几乎不表达。亚细胞定位的结果表明,GmMYB52定位于细胞核,符合典型转录因子的定位特征。酵母杂交系统检测表明,GmMYB52具有转录激活特征,并且能够与MYB相关顺式作用元件基序相结合。本研究结果表明,GmMYB52编码典型的MYB转录因子,具有转录激活活性及DNA结合活性,在大豆中的表达可能与大豆的非生物胁迫和ABA信号转导途径有关,推测其可能参与了大豆对非生物胁迫的响应。     

木薯MYB转录因子基因MeMYB60表达特征分析及其互作蛋白筛选

Myeloblastosis (MYB)类转录因子在植物对非生物胁迫的响应过程中起重要调控作用。本研究在分析栽培木薯MYB家族成员表达模式的基础上,筛选并克隆到了一个R2R3-MYB转录因子基因MeMYB60。基因表达特性分析表明,该基因在叶片特异表达,受干旱、低温负调控,同时对ABA处理也有响应。启动子活性分析发现,MeMYB60可以在保卫细胞表达,预示着该转录因子基因的表达可能与木薯气孔开闭调节有关。MeMYB60编码蛋白主要定位于细胞核中,具有转录激活活性,其转录激活结构域在蛋白C端第194～343氨基酸残基范围内。以MeMYB60蛋白N端第1～194氨基酸残基片段为诱饵,从干旱胁迫后木薯叶片的cDNA文库中筛选到18种可能与MeMYB60互作的蛋白,酵母双杂确定了MeCatlase1和MeCatalase2分别与MeMYB60存在互作关系。本研究为深入研究转录因子MeMYB60在木薯响应非生物胁迫过程中的功能并解析其调控网络奠定了基础。     

苦荞14-3-3基因家族生物信息学分析

14-3-3蛋白是普遍存在于真核细胞中的蛋白质,在植物的生长发育、信号传导、抵御胁迫等方面发挥着重要的作用,编码14-3-3蛋白的基因以基因家族的形式存在。本试验利用BLASTp从苦荞全基因组中查找到19个14-3-3基因家族成员,其编码蛋白中ε类蛋白序列8条,非ε类蛋白序列11条。利用生物信息学软件对14-3-3蛋白的氨基酸序列进行理化性质分析,发现它们的长度介于101～242 aa,等电点范围为4.27～9.59,大部分表现为酸性亲水蛋白,通过亚细胞定位预测其存在于细胞质、叶绿体、胞外、细胞核和细胞骨架中。通过对苦荞14-3-3蛋白的结构分析,发现该蛋白以α-螺旋、延伸链、无规则卷曲为主来维持蛋白质结构的相对稳定性且蛋白质序列高度保守,共含有8个保守基序,分布在7条染色体上。根据苦荞14-3-3蛋白的理化性质、结构、进化等方面的分析对其功能进行了初步的预测,推测苦荞14-3-3蛋白在靶蛋白亚细胞定位、基因转录、物质跨膜运输、非生物胁迫、代谢调控中发挥着重要的作用。本研究为后续苦荞14-3-3蛋白复杂结构和生物学功能等方面的深入研究提供科学依据。     

紫粒小麦高原115中R2R3-MYB转录因子TaMYB3-4A的克隆及功能分析

花青素在小麦生长发育中参与多种生理生化过程,关于花青素合成机理已被深入研究。本研究利用同源克隆从紫粒小麦高原115中克隆到Ta MYB3-4A基因。Ta MYB3-4A基因组为序列为853 bp,其完整开放阅读框序列为729 bp,含有一个124 bp的内含子;编码蛋白为242个氨基酸,具有典型的MYB结构域,属于R2R3-MYB蛋白。利用不同的MYB蛋白构建系统发育树,Ta MYB3-4A编码蛋白与调控花青素合成的MYB蛋白聚为一类。Ta MYB3-4A与b HLH基因共同瞬时表达能够诱导白色胚芽鞘中花青素的合成。不同组织特异性表达分析,Ta MYB3-4A基因在高原115胚芽鞘和种皮中表达量高,茎中次之,叶片和颖壳中表达量弱,但在根中并未检测到。研究表明Ta MYB3-4A基因编码蛋白为R2R3-MYB转录因子,调控小麦高原115不同组织中花青素生物合成。     

火把梨14-3-3基因的克隆与序列分析

依据火把梨(Pyrus pyrifolia Nakai)14-3-3蛋白的EST序列设计基因特异引物,采用快速扩增cDNA末端技术(Rapid amplification of cDNA ends,RACE),从云南火把梨中克隆一个新的14-3-3基因(Pp14-3-3)的全长cDNA序列。Pp14-3-3全长cDNA为1 107 bp,具有84 bp 5’非编码区(Untranslated Regions,UTR)、786 bp开放读码框(Openreading frame,ORF),以及237 bp 3’UTR,编码含261个氨基酸的蛋白质。Pp14-3-3与其他物种14-3-3蛋白在中间功能区域高度保守,包含典型的14-3-3结构域。与已知植物14-3-3s家族成员间的氨基酸序列进行聚类分析,将Pp14-3-3聚为非ε大类14-3-3。Pp14-3-3在火把梨接受光照和没有光照的果皮以及幼嫩叶片中大量表达,且表达量稳定。对Pp14-3-3的基因克隆以及表达特性进行了分析,为后期深入研究该新基因的功能奠定了基础。     

植物转录因子MYB基因家族的研究进展

植物转录因子MYB(v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)是近年来发现的一类与调控植物生长发育、生理代谢、细胞的形态和模式建成等生理过程有关的一类转录因子,在植物中普遍存在,同时也是植物中最大的转录家族之一,MYB转录因子在植物的代谢和调控中发挥重要作用。大多数MYB蛋白在N端含有一段氨基酸残基组成的Myb结构域,根据这个高度保守的结构域的结构特征可将MYB转录因子分为四类:1R-MYB/MYB-related;R2R3-MYB;3R-MYB;4R-MYB(4个R1/R2的重复)。MYB转录因子具有多种生物学功能,广泛参与植物根、茎、叶、花的生长发育,与此同时,MYB基因家族对干旱、盐渍、冷害等非生物胁迫过程也有响应,此外MYB转录因子还与某些经济作物的品质好坏密切相关。本综述主要对MYB转录因子的结构特点、生物学特性、调控机理等方面归纳总结前人的研究成果,详细阐述国内外相关研究进展,以期为后续研究做相关参考。     

大豆MYB转录因子基因GmMYBJ6和GmMYBJ7的克隆及表达分析

MYB转录因子以保守的DNA结合域为共同特征, 是植物最大的转录因子家族之一, 广泛参与植物代谢调控。本文根据植物中MYB转录因子的DNA保守结构域, 通过RT-PCR和RACE的方法从大豆品种吉林3号的叶片中分离得到了2个MYB基因GmMYBJ6和GmMYBJ7, 并对其结构特征和表达特性进行了分析鉴定。基因组DNA序列分析表明, 两个基因都含有两个内含子; 酵母系统检测表明, 两个基因均具有转录激活活性; β-半乳糖甘酶活性分析表明, 内含子的存在使两个基因的转录激活活性明显降低; 实时荧光定量PCR检测结果显示, GmMYBJ6在大豆中的表达受ABA、GA3和NAA的诱导, 而GmMYBJ7的表达则受ABA和NAA的诱导; 半定量RT-PCR分析表明, 两个基因在大豆的根、茎、叶、花和未成熟种子中均有表达。GmMYBJ6和GmMYBJ7为典型的R2R3-MYB转录因子新基因; 他们在大豆中的表达可能与ABA和NAA的信号转导途径有关。     

枸杞Lb14-3-3基因家族cDNA克隆及生物信息学分析

在开花植物中,14-3-3蛋白对植物生长发育具有重要的调控作用。本研究在前期枸杞花药发育差异蛋白质组研究基础上,利用RT-PCR技术,从宁夏枸杞‘宁杞1号’花药中克隆了5条长度分别为768 bp、747 bp、777 bp、753 bp和777 bp的cDNA序列,分别命名为Lb14-3-3a、Lb14-3-3b、Lb14-3-3c、Lb14-3-3d和Lb14-3-3e,对Lb14-3-3a、Lb14-3-3b、Lb14-3-3c、Lb14-3-3d和Lb14-3-3e,5个基因编码蛋白质的结构预测发现,其蛋白质的分子量大小在60.91~64.14 kD之间,编码蛋白质的长度在248~259个aa之间,理论等电点在4.95~4.99之间,均为酸性氨基酸,且都为不稳定的亲水性蛋白。α-螺旋(Alpha helix)是这5个蛋白质二级结构的主要成分,三级结构主要是由α-螺旋构成的对称结构,具有高度的相似性。该家族蛋白既没有信号肽也无明显的跨膜区,亚细胞定位显示Lb14-3-3a定位在线粒体上,Lb14-3-3b和Lb14-3-3e定位在叶绿体上,Lb14-3-3c和Lb14-3-3d定位在细胞质中,Lb14-3-3a蛋白发生磷酸化修饰的可能性最高,Lb14-3-3b磷酸化的可能性最低。多序列比对分析显示,该家族蛋白之间的相似性为77.51%,具有高度的保守性。进化分析显示Lb14-3-3a与其它Lb14-3-3蛋白家族的亲缘关系较远,Lb14-3-3c和Lb14-3-3e,Lb14-3-3d和Lb14-3-3b处于同一分支,亲缘关系较近,Lb14-3-3家族蛋白与马铃薯、番茄、烟草等亲缘关系较近。研究结果为阐明该蛋白家族基因在枸杞花药发育过程中潜在的调控机理提供科学依据。     

小麦胚乳14-3-3蛋白的表达及其淀粉体淀粉合成酶的互作

从小麦胚乳中克隆了14-3-3基因,并将其分别插入pET29c和pET41c质粒,用热激法转化大肠杆菌BL21-CodonPlus (DE3)-RP,得到高效表达的蛋白,但融合蛋白主要以包涵体的形式存在。可溶性的融合蛋白可直接通过S-蛋白琼脂糖树脂纯化。包涵体经8 mol L^-1尿素溶解变性,稀释复性后,结合到S-蛋白琼脂糖树脂上,也得到纯化的融合蛋白。复性后的融合蛋白对蔗糖合成酶活性表现抑制作用,说明包涵体14-3-3融合蛋白恢复活性。将结合14-3-3融合蛋白的S-蛋白琼脂糖树脂作为诱饵与小麦胚乳淀粉体提取液进行亲和杂交,与14-3-3蛋白特异互作的淀粉合成酶结合到S-蛋白琼脂糖树脂上,Western 检测结果表明, 淀粉体淀粉合酶I(SSI)、淀粉合酶II(SSII)、淀粉分支酶IIa(SBEIIa)、淀粉分支酶IIb(SBEIIb)和ADP焦磷酸化酶大亚基(SH2)与14-3-3蛋白存在互作,而淀粉分支酶I(SBEI)、淀粉磷酸化酶(SP)、D-酶(DE)和ADP焦磷酸化酶小亚基(BT2)不能与14-3-3蛋白结合,说明小麦胚乳14-3-3蛋白对淀粉体淀粉合成具有一定的调控作用。     

14-3-3蛋白结构与功能预测及其在木薯成熟期的表达分析

为了深入研究木薯14-3-3蛋白结构和功能,也为研究木薯块根淀粉积累的分子调控提供新思路。本研究采用生物信息学方法对木薯14-3-3蛋白家族的组成成分与理化性质、系统发育进化、导肽、亚细胞定位、二级结构、功能结构域、三级结构及亲水性、疏水性进行分析和预测,并对14-3-3基因在不同木薯品种中进行差异表达分析。结果表明：（1）木薯14-3-3蛋白家族16个异构体存在多个不同的保守结构域,二级结构相似的亲水性蛋白家族成员在进化关系上可划分为2大不同的类别;（2）14-3-3基因家族16个成员在花叶木薯、ZM-Seaside和华南9号(SC9)块根成熟期的表达水平存在显著性差异(P<0.05),与花叶木薯和SC9相比,产量较高的木薯品系ZM-Seaside块根中14-3-3基因表达水平显著下降(P<0.05),推测14-3-3蛋白在木薯块根成熟期的淀粉积累过程中可能起着负调控作用。     

葫芦科14-3-3(GRF)基因家族的鉴定及进化分析

14-3-3蛋白是植物中一类高度保守的蛋白家族,因其特异识别并结合靶蛋白的磷酸化位点而广泛参与植物生长发育和逆境胁迫响应过程。为系统地了解14-3-3(GRF)基因家族在葫芦科作物中的基本特征和进化关系,本研究利用生物信息学从葫芦科7个物种基因组内共鉴定出83个14-3-3(GRF)基因,其中西瓜中有10个、甜瓜中9个、黄瓜中10个、瓠瓜中9个,3个南瓜属物种基因组各15个。理化特性表明14-3-3(GRF)蛋白的分子量约为30 k D,且大都为酸性氨基酸(pI<7.0)。相对于西瓜、甜瓜、黄瓜和瓠瓜,基因组复制事件是3个南瓜属物种内14-3-3(GRF)基因数目增多的主要原因。进化分析显示,葫芦科14-3-3(GRF)基因家族可进一步被划分为ε类和非ε类亚组,且后者的基因结构(外显子数目,内含子相位)较为保守。本研究结果首次完成了14-3-3(GRF)基因家族在葫芦科作物的鉴定、基因结构、基因家族扩增、共线性及进化分析,为更深入研究该家族基因的生物学功能提供参考。     

棉花Gh14-3-3L2基因的分子克隆及其互作蛋白质的初步鉴定

根据本实验室蛋白质组学研究鉴定的EST序列,克隆了一个可能在棉花纤维起始和伸长发育阶段起调控作用的棉花14-3-3蛋白质的全长cDNA,定名为Gh14-3-3L2。Gh14-3-3L2蛋白毒性大,难以通过酵母双杂交途径鉴定其互作蛋白质组。因此,本研究首先经原核表达并纯化出添加六联组氨酸标签的Gh14-3-3L2蛋白,以此蛋白质为诱饵,以开花前3 d至开花后6 d正常野生型、徐州142无纤维突变体和Li-1无长绒纤维突变体胚珠或纤维混合蛋白质为猎物样品,采用Pull-down技术分离、富集Gh14-3-3L2相互作用蛋白质,再经2-DE和MALDI-MS/MS串联质谱分析,鉴定了7个可能与Gh14-3-3L2相互作用的蛋白,其功能有作为分子伴侣、参与微囊的运输、代谢、信号转导等。为进一步解析Gh14-3-3L2的功能以及棉花纤维发育的分子调控网络奠定了基础。     

烟草Nt14-3-3-like C基因的克隆与功能分析

烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV）寄主范围广泛、传染性极强,严重影响作物的产量和品质。实验室前期在不同耐受 TMV侵染的烟草品种中筛选出1个表达显著差异的蛋白14-3-3-like C,在此基础上,对Nt14-3-3-like C基因进行了克隆、生物信息学分析和亚细胞定位;通过农杆菌介导遗传转化,获取转基因植株;通过qPCR对转基因植株中TMV侵染响应相关基因的表达进行分析。结果显示,14-3-3-like C蛋白序列长度为780bp,编码260个氨基酸,具有14-3-3蛋白的典型沟槽结构,但没有跨膜结构和信号肽;定位于细胞核和细胞膜;转基因材料的qPCR分析发现,在Nt14-3-3-like C基因抑制的植株中,病原防卫和光合途径相关的基因表达显著下降,表明Nt14-3-3-like C可能通过抑制病原防卫和光合途径相关基因表达参与TMV对烟草的侵染。     

GmMYB042基因对类黄酮生物合成的调控作用

MYB类转录因子是植物中最大的转录因子基因家族之一,广泛参与植物生长发育全过程,对植物次生代谢等具有重要的调控作用。本研究对大豆GmMYB042基因的表达特性和功能进行了系统的研究,针对该基因C端的保守氨基酸基序(PDLNLELTIS)和锌指结构进行了一系列的序列删除突变,并将各缺失突变体在烟草中进行了过表达,以验证目的基因及其特殊基序的功能。表达特性分析结果表明GmMYB042基因在大豆的根瘤、根、茎、叶、花、荚果皮和种子中均有表达,且在茎、种子和花中的表达量相对较高;GmMYB042基因在大豆中的表达受PEG、高盐、低温和UV-B辐射的诱导。过表达分析结果表明,GmMYB042基因的过表达使转基因烟草类黄酮代谢途径部分关键酶基因(如PAL、CHS和FLS)的表达量明显上升,转基因烟草总黄酮的含量明显高于对照;各缺失突变体的转基因烟草类黄酮代谢途径相应酶基因的表达量发生相应的变化,进一步证明目的基因对类黄酮生物合成的调控作用;各缺失突变体的转基因烟草的叶缘有明显的皱褶,说明目的基因可能还参与调控叶的形态建成。     

多肽配体R18促进水稻弱势籽粒灌浆的初步研究

14-3-3蛋白在植物生长发育中具有重要的调控作用,其亚型GF14f在水稻弱势籽粒中高表达是其灌浆结实差的一个重要的原因。本研究首先通过分子对接的方式,发现多肽R18与GF14f蛋白具有潜在的结合位点,进而采用体外竞争性实验,发现R18能够竞争性的与GF14f蛋白结合,从而导致GF14f与SuS2、SS和AGPS三个互作靶蛋白间的结合力减弱,与此同时,体外酶活实验表明,外源添加R18能够显著提高淀粉合成酶(StSase)、蔗糖合成酶(SuSase)和ADPG焦磷酸化酶(AGPase)3个酶的活性。免疫共沉淀实验表明,R18在水稻籽粒中除了能和GF14f结合外,还能与GF14b、GF14c、GF14d及GF14e结合,BiFC结果也证实了上述结果。籽粒灌浆期,外源喷施60 mg L^-1浓度的R18于弱势籽粒上,StSase、SuSase及AGPase酶活性显著提高,弱势籽粒千粒重及结实率也显著提高。本研究结果表明,多肽配体R18能够与14-3-3互作靶蛋白竞争性结合,减弱14-3-3与靶蛋白间的结合力,进而释放籽粒灌浆过程中蔗糖转化及淀粉合成途径中关键酶的活性,从而有利于弱势籽粒灌浆充实。     

MADS-box基因GmAP3的克隆及生物信息学分析

植物MADS盒基因蛋白是一类在生物发育过程中起着重要作用的转录因子家族。本研究在前期大豆花芽转录组测序分析的基础上,利用RACE技术成功克隆了一个MADS-box基因的全长cDNA序列,利用生物信息学方法对它所编码的氨基酸基本性质和结构进行了系统分析。结果表明,该基因属于MIKC家族,为亲水性蛋白,稳定性较好;二级结构中同时含有α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲结构,其中α-螺旋和无规则卷曲所占比例均较高;亚细胞定位分析显示其定位在细胞核上;聚类分析表明该基因属于AP3亚家族,该基因编码的氨基酸与拟南芥AP3蛋白的同源性为41.18%,与大豆中GmNMH7的同源性最高为97%,命名该基因为GmAP3。本研究成功克隆出GmAP3基因,为该基因的进一步研究提供实验材料,并通过生物信息学分析预测,为下一步该基因的功能研究提供依据。