款冬花DNA提取及ISSR体系优化

摘 要：为了从分子水平对款冬种质资源进行鉴定和遗传多样性分析,分别采用SDS法、CTAB法、改良SDS法和改良CTAB法提取款冬叶片基因组DNA,比较不同方法的提取效果,并用改良CTAB法提取的DNA进行ISSR-PCR扩增体系摸索,建立优化的ISSR-PCR反应体系。结果显示：改良SDS法和改良CTAB法都可以提取出高质量的DNA,最优的ISSR-PCR反应条件为: 20μl反应体系中含DNA模板约20ng,Taq 酶1.0 U,Mg2+ 2.00 mmol/L,dNTPs 0.20 mmol/L,引物0.6 μmol/L,1×PCR缓冲液。     

小桐子基因组DNA的提取及ISSR-PCR反应体系的优化

为从小桐子嫩叶中提取高质量的基因组DNA.采用改良CTAB法提取的基因组DNA通过OD260/OD280比值测定,琼脂糖凝胶电泳和ISSR-PCR扩增检测,结果表明改良CTAB法提取的DNA纯度高.可作为ISSR分子标记的模板.同时,采用正交设计的方法,对影响小桐子ISSR-PCR反应体系中的4个因素(引物、Taq DNA Polymerase、10xBuffer(含Mg2 )、dNTPs)在3个水平上进行优化试验.建立了适合小桐子的既稳定又能扩出最多数量谱带的ISSR最优反应体系,即20μl的反应体系中含有30ng模板DNA、0.2mmol/L dNTP、0.3 U Taq酶Polymerase、0.8μmol/L Primer、3.0hanoi/L10×Buffer(含Mg2 ).     

淮山RAPD-PCR反应体系的建立

摘要：采用改良CTAB法提取淮山的叶片总DNA。通过单因子实验法分析DNA浓度、引物浓度、dNTP浓度、Taq聚合酶以及Mg2+浓度对RAPD-PCR扩增结果的影响,建立了适合于淮山RAPD-PCR反应体系,即20μL体系中包括：模板DNA为50 ng、Taq酶为0.2U、Mg2+浓度为3.0mmol/L、引物浓度为0.2μmol/L、dNTPs浓度为0.2mmol/L。     

10种绣线菊DNA的提取及RAPD反应体系的优化

旨在筛选出绣线菊属 RAPD 反应的最佳体系,为绣线菊属植物种质资源遗传多样性和亲缘关系的研究奠定基础.试验以 10 种绣线菊属植物为材料,采用改良 CTAB 法进行冬芽和嫩叶的总 DNA 提取并对影响 RAPD 扩增效果的因素进行优化.通过单因素优化筛选出最佳的 20μl 反应体系10×Taq buffer 2μl,Taq 酶 1.0U,0.15mmol/L dNTP,DNA 2ng/μl,引物 0.21μ mol/L,Mg2 2.0mmol/L;反应程序94℃预变性 4min,然后进行 40 个循环94℃变性 45s,37℃退火 1min,72℃延伸 1min.最后72℃延伸5min,4℃终止反应.结果发现,采用改良 CTAB 法所提取绣线菊冬芽的 DNA 达到 RAPD 反应的要求.筛选体系扩增出清晰稳定的多态性条带,可用于对绣线菊属遗传育种方面的研究.     

黄瓜DNA提取及优化SSR反应体系的建立

本文简化了黄瓜DNA提取程序并探讨了黄瓜SSR反应程序及体系.反应体系25 μL:10×buffer 2.5 μL,2.5 mmol/L MgCl2 2.0 μL,2 mmol/L dNTP 2.5 μL,gDNA模板(10 ng/μL)2 μL,forward primer(10 pmol/μL)0.5 μL,reverse primer(10 pmol/μL)0.5 μL,ddH2O 14 μL,Taq DNA聚合酶(1 U/μL)1 μL.反应程序:95℃预变性5 min,94℃变性30 sec,49℃退火1 min,72℃延伸90 sec,循环次数35,72℃延伸5 min.     

正交设计优化狗牙根SSR-PCR反应体系

以SDS法提取的狗牙根(Cynodon spp.)叶片DNA为模板,应用正交试验设计,从Mg2 、dNTP、引物和DNA聚合酶4种因素三个水平,对SSR扩增效果进行研究,并通过比较不同浓度模板DNA的浓度对PCR扩增的影响,确立适合狗牙根SSR-PCR反应的最佳体系.结果表明:各因素不同水平浓度对PCR反应结果均有显著影响,狗牙根SSR-PCR优化反应体系为:10×buffer、60 ng模板DNA、Mg2 2.5 mmol/L、dNTP 200 μmol/L、primer 0.8 μmol/L和Taq DNA聚合酶0.5U,总体积10 μL.运用该体系对包括三种10份优良坪用型狗牙根进行了检验,证明该体系稳定可靠.这一优化体系的建立为今后利用SSR标记技术进行狗牙根遗传多样性研究、种质资源鉴定以及亲缘关系分析等提供依据.     

新疆贝母DNA提取及ISSR-PCR体系的建立与优化

目的:从新疆贝母干叶片中提取高质量的DNA,建立ISSR-PCR体系并进行优化。方法:通过改进的CTAB法提取基因组DNA;综合利用单因素实验和L9(34)正交实验2种方法,对镁离子、dNTP、模板DNA含量、TaqDNA聚合酶量、引物浓度等因素进行优化,并采用温度梯度筛选引物的退火温度。结果:新疆贝母20μL ISSR-PCR最适反应体系dNTP为0.3 mmol/L,Mg2+为2.0 mmol/L,模板浓度为40～100 ng/(20μL),引物为1.2 mmol/L,Taq DNA聚合酶为1.0 U/20μL,引物UBC 859的最适退火温度为50.7℃。结论:此提取方法得到的DNA纯度高,ISSR-PCR扩增效果显著,为新疆贝母种质资源鉴定、遗传多样性分析奠定研究基础。     

甜瓜ISSR-PCR反应体系的正交优化研究

为在最短时间内找到甜瓜ISSR-PCR反应四个主要因素的最优水平,确定甜瓜ISSR-PCR最优反应体系进行本研究。采用CTAB法提取甜瓜基因组DNA,获得完整性好且纯度较高的DNA样品。利用统计软件MINTAB创建4因素3水平的正交试验设计,PCR结果用MINITAB进行方差分析。结果显示引物浓度对PCR反应结果影响最大,Taq DNA聚合酶对PCR结果影响最小,并对各因素水平间进行因素内多重比较分析,最终建立最优化的反应体系（20 μL）：1×buffer,100 ng DNA模板,Taq DNA聚合酶1 U,引物0.4 mmol/L,dNTP为0.1 mmol/L。     

苦瓜基因组DNA的提取及ISSR扩增体系的优化

为了快速获取高质量的苦瓜基因组DNA,以便进行苦瓜白粉病抗性基因分子标记研究,比较了不同的DNA提取方法、不同部位的苦瓜叶片提取基因组DNA的产量和质量,探究了苦瓜基因组DNA提取的最佳方法和叶片的最适部位;研究了ISSR-PCR的退火温度,并采用正交设计法对影响ISSR-PCR的Mg²⁺、dNTPs、Taq酶、模板DNA以及引物浓度等5个因素进行了优化。结果表明,采用改良CTAB法从苦瓜顶端嫩叶中提取的基因组DNA OD260/OD280值在1.8~1.9之间,OD260/OD230值为2.0左右,对DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测,主带清晰,降解较少,产量和纯度均较高,效果较好。优化后的ISSR-PCR反应体系为：2.5μL 10×PCR buffer,2.5 mmol/L MgCl₂,250μmol/L dNTPs,10 ng模板DNA,0.75 U Taq酶,引物浓度0.7μmol/L,反应总体积为25μL,引物UBC826最佳退火温度为53℃。该体系在多次重复中均能获得良好的扩增结果。苦瓜基因组DNA提取的最佳方法为改良CTAB法,最适合的部位为顶端嫩叶。     

柑桔SRAP和ISSR分子标记技术体系的建立与优化

通过对PCR反应程序、反应体系(DNA模板量、PCR反应体积、Mg2 浓度、dNTP浓度、Taq酶用量、引物量)、电泳检测方法的系统优化,建立了柑桔SRAP-PCR和ISSR-PCR体系;以此进行大规模引物筛选,从而建立了柑桔SRAP和ISSR分子标记技术体系.SRAP-PCR:25μL体系,模板DNA25ng,Tris-HCl10 mmol/L,KCl50 mmol/L,Mg2 1.2 mmol/L,dNTP 120 μmol/L,Taq酶1.5U,引物0.4μmol/L,反应程序为94℃预变性5min,35个循环(94℃ 30s,47℃ 1min,72℃ 1min),72℃延伸10min;ISSR-PCR:25μL体系,模板DNA25ng,Tris-HCl10mmol/L,KCl50mmol/L,Mg2 1.6 mmol/L,dNTP200μmol/L,Taq酶1 U,引物0.8μmol/L.筛选出稳定性好、多态性高的24对SRAP引物和13条ISSR引物.     

正交设计优化扁蓿豆ISSR反应体系的研究(英文)

以扁蓿豆(Medicago ruthenica)为试材,采用改良的CTAB法提取DNA,利用正交设计L16(45)探讨10×PCRBuffer(含Mg2+)、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶及模板DNA用量对扁蓿豆ISSR-PCR反应的影响,正交试验的结果采用直观分析和方差分析相结合。建立了扁蓿豆的ISSR-PCR优化反应体系,在25μL反应体系中,TaqDNA聚合酶1.5U,10×PCR Buffer(含Mg2+)2.0 mmol/L,模板DNA0.5 ng/μL,dNTPs 0.6 mmol/L,引物0.9μmol/L。同时探讨引物HZD09211的最适退火温度为52.3℃。2个不同引物对20份扁蓿豆材料DNA进行ISSR-PCR扩增,结果显示该体系具有较高的稳定性。     

砂仁及其混伪品益智仁的ISSR分子鉴别

为创建砂仁及其主要混伪品益智仁的ISSR分子鉴别方法,以UBC818为引物,对影响ISSR-PCR反应体系的引物、dNTPs、DNA模板、Taq DNA聚合酶和Mg2+浓度进行5因素4水平正交优化试验,并在此基础上筛选阳春砂ISSR引物及砂仁正伪品的鉴别引物。结果表明,20μL阳春砂ISSR-PCR最佳反应体系包括引物0.5μmol/L、dNTPs 0.25 mmol/L、DNA模板40 ng、Taq DNA聚合酶1.2 U、Mg^2+2.0 mmol/L;从52条ISSR引物中筛选出10条阳春砂ISSR引物,从6条阳春砂和益智的共同引物中,筛选出扩增条带清晰、多态性强的砂仁正伪品的鉴别引物UBC808,利用UBC808对15份样品进行验证试验,结果表明鉴别体系稳定性好,可用于砂仁与益智仁的快速、准确鉴别。     

萝卜ISSR-PCR反应体系的正交设计优化

本研究利用正交设计L16(45)对萝卜ISSR-PCR反应体系的5因素(Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTP、引物)在4个水平上进行优化试验。研究结果表明,获得了最佳的反应体系,在10μL反应体系中,含TaqDNA聚合酶0.6U﹑Mg2+2.0mmo/L﹑模板DNA 40ng﹑dNTP 250μmol/L﹑引物0.25μmol/L﹑10×PCRBuffer,不足部分以ddH2O补足。确立了以UBC876为引物的最优反应条件,退火温度为48℃,总循环数为40次。新优化的萝卜ISSR-PCR的反应体系和程序有很好的重复性和稳定性好。此研究为今后利用ISSR技术对萝卜进行种质资源分类﹑遗传图谱构建和基因定位奠定了基础。     

茭草ISSR-PCR体系的优化

为了建立适用于茭草的ISSR-PCR反应体系,以湿地植物茭草基因组DNA为研究对象,筛选引物为UBC818,采用正交试验设计方法,建立了茭草ISSR-PCR反应体系和扩增程序。结果表明,在 25 μL反应体系中含有1×PCR缓冲液、250 μmol/L dNTP、2.0 mmol/L MgCl₂、0.5 μmol/L引物、1.0 U Taq DNA聚合酶和100 ng模板DNA最适用于茭草ISSR-PCR扩增。适宜的扩增程序为94℃ 5 min;94℃ 1 min;56℃ 45 s;72℃ 90 s;35个循环;72℃ 10 min;4℃保存。     

葡萄柚基因组DNA提取方法的比较及ISSR-PCR体系的优化

对4种基因组DNA提取方法进行比较,得到一种效率较高的、且适用于葡萄柚ISSR-PCR的DNA提取方法。同时,采用正交设计对影响葡萄柚ISSR-PCR的因子进行优化。实验结果表明,改良的SDS法提取的基因组DNA最适宜进行葡萄柚的ISSR-PCR扩增。ISSR-PCR产物在2%琼脂糖凝胶上检测,发现PCR扩增的平均条带数为2.7条。葡萄柚的最优ISSR-PCR反应体系为：20 μL总体积中含有2×buffer(Mg2+),0.2 mmol/L dNTPs,0.2 μmol/L引物,0.3 U Taq DNA聚合酶,5 ng DNA模板。     

亚洲百合DNA的提取及RAPD-PCR反应体系的优化

为了促进亚洲百合分子水平的研究,以亚洲百合幼嫩叶片为材料,采用改良CTAB法提取亚洲百合基因组DNA,得到的DNA质量较高,适合于RAPD -PCR分析。通过单因素优化得到在25μl反应体系中,亚洲百合RAPD 分析的最佳反应体系：160μmol/ L dNTPs,0.3μmol/L随机引物,Taq DNA聚合酶1.5U,Mg2＋浓度2.0mmol/L。     

牡丹杂交品系SRAP-PCR反应体系优化及引物筛选

通过研究牡丹杂交新品系的遗传多样性,解决其在牡丹品种分类体系中位置的问题。利用正交设计,从Mg2+、dNTPs、引物浓度、DNA聚合酶和不同模板DNA浓度5种因素4个水平来优化牡丹杂交品系SRAP-PCR反应体系,对引物进行筛选。建立牡丹杂交品系SRAP-PCR反应最佳体系(25 μL)为： 2.0 mmol/L Mg2+、1.5 U Taq酶、0.25 mmol/L dNTPs、2 ng/μL模板DNA、0.25 μmol/L引物;运用试验结果从100对引物中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的SRAP引物30对。优化体系的建立及引物的筛选,可为利用SRAP标记技术研究牡丹杂交品系的遗传多样性及亲缘关系提供技术基础和理论依据。