油菜Nsa CMS候选恢复基因的来源及表达

根据同源序列法克隆的Nsa CMS候选恢复基因PPR618的序列,采用PCR方法在Nsa CMS不育系、恢复系、原始体细胞杂交亲本以及其他甘蓝型油菜品种中共克隆出22个同源序列。序列分析表明,野芥亲本野油18、甘蓝型油菜亲本中双4号各含有2个同源序列,而Nsa CMS 4个恢复系则分别含有3、1、1、1个同源序列。恢复系中候选恢复基因的序列与野芥亲本野油18的同源序列的一致性在93%以上,其中恢1、恢3和恢4中至少有一个同源序列与野油18的第一个同源序列完全相同,恢2中的同源序列与野油18的第2个同源序列完全相同;但与甘蓝型油菜的同源序列一致性均低于80%,说明候选恢复基因来源于新疆野芥,而不是甘蓝型油菜。除了原来的PPR618外,获得了3个来源于恢复系的新候选恢复基因。候选恢复基因在序列上与萝卜和矮牵牛的恢复基因一致性较高。半定量RT-PCR分析表明,候选恢复基因在恢复系中多个组织都有表达,但在根、茎中表达量特别少。随着营养器官到生殖器官的发育逐渐升高,候选恢复基因在恢复系中表达量最高的是雄性败育关键时期, 即1.5~2.5 mm的花蕾中,但不育系中的同源基因在茎中的表达量则相对高于其他组织。     

辣椒CMS恢复基因的遗传分析及基因定位

本研究以辣椒胞质雄性不育系131BC5A与恢复系139D-21-3为亲本,构建了包含210个单株的F2群体,采用CAPS、SSR及SCAR等分子标记技术,对辣椒胞质雄性不育恢复基因进行遗传分析和基因定位研究。田间调查和遗传分析结果表明,F2群体的表现型中可育与不育的分离比为3:1。采用分离群体分组分析法(BSA),从F2可育群体和不育群体中各随机选取10株,构建可育和不育基因池。研究选用295对引物在亲本间进行多态性筛选,其中43对引物在亲本间表现出多态。通过进一步分析43对引物在基因池间的多态性,筛选出Rf基因连锁标记14个。然后对F2群体的210个单株进行连锁分析,最后将恢复基因定位在SSR标记pep43和pep20之间,约3.9 c M(或498.6 kb)的区间内,与两个标记的遗传距离分别为1.3 c M与2.6 c M。本研究为Rf基因的精细定位和克隆奠定了良好基础,也为辣椒雄性不育恢复系的分子标记辅助选择育种提供了理论参考。     

甘蓝型油菜细胞质雄性不育恢复基因的SSR标记及初步定位

以甘蓝型油菜恢复系Q 16C和不育系2116A为亲本构建F2群体,根据BSA法的构建原则,使用F2群体分别构建了可育基因池与不育基因池。运用98对SSR引物对油菜亲本及基因池进行了多态性分析,结果表明,有1对引物(OS 31)能在亲本和基因池间表现出多态性,使用该引物继续对F2群体的230个单株进行分析,表明标记(OS 31)与恢复基因Rfp的遗传距离为0.08cM,可作为恢复系辅助育种的候选标记。     

采用基于高分辨率熔解曲线技术的SNP标记定位徐州142无絮的短绒控制基因

【目的】定位徐州142无絮(XZ142w)突变体的短绒控制基因n2。【方法】以陆地棉(Gossypium hirsutum L.)徐州142(XZ142)×XZ142w的F2群体为研究对象,利用108个简单重复序列(Simple sequence repeat,SSR)标记对n2进行初步定位,再根据2个亲本材料中有单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphic,SNP)的差异基因设计50对SNP引物,用高分辨率熔解曲线(High resolution melting,HRM)技术从中筛选在亲本间有多态性的SNP引物,并用于后代的基因分型。【结果】利用108个SSR标记将n2初步定位在26号染色体的20.2c M的遗传区间内;用HRM技术筛选到9对亲本间有多态性的SNP引物,成功实现基因分型;并结合以SSR构建的连锁图谱,将n2的遗传区间缩小为19.5 c M,n2与最近的SNP标记Cricaas20158遗传距离为5.5 c M,且遗传图谱上的标记与四倍体陆地棉测序物理图谱基本一致。【结论】HRM技术可用于棉花中的SNP检测和n2基因的定位。     

滇型水稻细胞质雄性不育恢复基因Rf-D1（t）的克隆与遗传特性分析

CMS/Rf测交F1结实率与花粉可育率检测表明,Ansanbyeo和南34对三种不同细胞质来源的粳稻不育系(CMS-DT1,CMS-BT和CMS-HL)都有较强的恢复力。根据已公布的水稻基因组序列,在水稻恢复基因定位区段内设计引物,确定出一对与两个滇型CMS的恢复系Ansanbyeo和南34恢复基因紧密连锁的分子标记引物M43804和M43558,首次克隆了滇型恢复基因Rf-D1(t),编码16个PPR蛋白。序列比对表明,该基因与BT型恢复基因Rf-1相似度达99%,两个恢复基因之间在ORF区仅存在一个碱基差异,即Rf-D1(t)第1149bp位的A变成Rf-1的C,并产生一个氨基酸的改编即K(赖氨酸)变成N(天冬酰胺)。该差异处于一个PPR结构域中,暗示该氨基酸是恢复基因的关键位点之一,它的改变可能影响对水稻CMS育性恢复力的变化。     

滇型水稻细胞质雄性不育恢复基因Rf-D1(t)克隆与遗传特性分析

CMS/Rf测交F1结实率与花粉可育率检测表明,Ansanbyeo和南34对三种不同细胞质来源的粳稻不育系(CMS-DT1,CMS-BT和CMS-HL)都有较强的恢复力.根据已公布的水稻基因组序列,在水稻恢复基因定位区段内设计引物,确定出一对与两个滇型CMS的恢复系Ansanbyeo和南34恢复基因紧密连锁的分子标记引物M43804和M43558,首次克隆了滇型恢复基因Rf-D1(t),编码16个PPR蛋白.序列比对表明,该基因与BT型恢复基因Rf-1相似度达99%,两个恢复基因之间在ORF区仅存在一个碱基差异,即Rf-D1(t)第1 149 bp位的A变成Rf-1的C,并产生一个氨基酸的改编即K(赖氨酸)变成N(天冬酰胺).该差异处于一个PPR结构域中,暗示该氨基酸是恢复基因的关键位点之一,它的改变可能影响对水稻CMS育性恢复力的变化.     

棉花育性相关基因GhPG2的克隆与表达分析

多聚半乳糖醛酸酶家族是一个细胞壁水解酶,在许多高等植物的花粉中都具有高水平外切多聚半乳糖醛酸酶(PG)活性,可能在花粉成熟和花粉管伸长中发挥重要作用。利用已报道与恢复基因连锁的分子标记STS679筛选陆地棉Y18恢复系核基因组BAC文库,获得一个阳性克隆Z55E7,对该克隆测序获得6个基因,其中一个为编码多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase)基因,暂被命名为GhPG2。在棉花细胞质雄性不育系、保持系和恢复系中对该基因进行序列和表达分析,以便进一步了解该基因与棉花细胞质雄性不育的关系。从BAC克隆中分离到GhPG2基因,对其进行序列分析,以半定量RT-PCR和实时定量PCR分析该GhPG2基因在棉花恢复系、保持系和不育系各个组织中的表达模式。分离到GhPG2基因的基因组序列为1 518 bp,其开放阅读框序列为1 239 bp,共编码412个氨基酸,包含PG基因家族的4个保守结构域。系统进化树分析表明,GhPG2基因与其他物种花粉表达的PG基因同属C分支。表达分析表明, 该基因在恢复系和保持系的花药、花瓣和VI级花蕾中高表达,而不育系的相应组织该基因表达量明显降低。GhPG2基因归类于花粉表达的一类PG基因。实验结果暗示GhPG2基因可能与棉花正常的花器官发育相关。     

甜椒胞质雄性不育恢复系SRAP及SCAR标记

以甜椒胞质雄性不育恢复系5-2R1和相应的保持系5-2为试材,利用SRAP分子标记技术筛选与甜椒恢复基因相关的分子标记。128对SRAP引物共扩增获得了3796条从100bp至800bp大小不同的条带,平均每对引物组合可扩增出30条清晰的条带,检测到4个多态性位点,其中恢复系材料仅有1个。对该特异片段进行回收、克隆和测序,结果表明该片段全长为259bp。经数据库比对分析表明,该片段与线粒体中的NADH脱氢酶第5亚基(GenBank:EF151914.1)具有81%的同源性;同时,该片段与辣椒BAC克隆PEPBAC 158K24(GenBank:FJ597540.1)的部分序列高度同源。根据序列特点设计特异SCAR引物,对恢复系和保持系进行扩增验证,仅在恢复系中扩增出目的条带,表明已成功地将此SRAP标记转化为简单、稳定的SCAR标记。我们推测本研究获得的SCAR标记可能与胞质雄性不育恢复性状连锁。     

亚麻花蕾发育相关基因的表达研究

为进一步揭示显性核不育亚麻不育分子机理,以显性核不育亚麻不育株分离的可育花蕾和不育花蕾为研究材料,采用实时定量PCR技术和原位杂交技术,开展了G-E07-830、G-E07-330和G-E07-100这3个花蕾发育相关基因在亚麻花蕾中的时空表达模式。结果表明:原位杂交中G-E07-830、G-E07-330和G-E07-100基因在亚麻可育和不育花蕾绒毡层中表达特异性信号;实时定量PCR得出在早期不育亚麻花蕾中表达量显著大于其他发育时期的花蕾。     

甜菜细胞质雄性不育相关基因的克隆表达及CMS的相关性研究

已有的研究表明,线粒体atpA基因和orf187片段与作物雄性不育关系密切。为了研究atpA基因和orf187片段与甜菜细胞质雄性不育之间的关系,采用同源序列法分离克隆了甜菜体内atpA和orf187序列;序列分析揭示这2个片段序列在不育系和相应保持系间存在差异,进一步利用半定量RT-PCR和Real-time PCR技术分析了两系的atpA基因和orf187片段的表达情况。结果表明,与保持系相比,atpA在不育系中发生了碱基的置换及插入;orf187在不育系中缺失6个碱基,而在保持系中多了6 bp的重复序列;基因表达分析也显示,不育系atpA在花蕾发育的前2个时期表达量明显低于相应的保持系,而在大花蕾期其表达量又高于相应的保持系;orf187在不育系小花蕾时期表达量明显高于相应的保持系,随着花蕾的发育,该序列在不育系中的表达逐渐减弱并明显低于对应保持系中的表达量。推测atpA和orf187的结构变异及异常表达与甜菜细胞质雄性不育有着密切关系。     

甘蓝型油菜NCa细胞质雄性不育系统花药败育前期的基因差异表达

采用cDNA-AFLP技术研究了甘蓝型油菜NCa不育系、保持系和可育F1花药败育前期的基因差异表达谱。用224对引物对不育系、保持系及育性恢复F₁等3个材料的cDNA进行AFLP分析。回收、克隆可能与花药育性有关的差异条带,筛除假阳性,获得41条阳性差异条带（TDFs）;经测序、同源比对、功能预测,归并为35个非重复的TDFs。大多数TDFs在甘蓝型油菜中属首次报道。将已知功能的28个TDFs按其推测功能分为2大类10小类,82%的TDFs与细胞形态建成和降解、蛋白质合成、加工和转运、能量代谢、信号传导有关;基本涵盖花药发育相关的关键代谢过程。对其中7个TDFs基因进行了RT-PCR分析。结果表明,果胶甲酯酶基因和氨基酸通透酶基因都在不育系花蕾中大量表达,果胶甲酯酶基因在不育系叶片、保持系的花蕾、叶片中都没有检测到;而氨基酸通透酶基因有微量表达。驱动蛋白和乙醛脱氢酶主要在保持系花蕾中大量表达,而在不育系花蕾、叶片以及保持系叶片中都只有微量表达。玉米黄素环氧化酶（ZEP）和单脱氧抗坏血酸还原酶则在保持系花蕾、叶片和不育系叶片中大量表达,而在不育系花蕾中微量表达。花粉油体蛋白在不育系和保持系的花蕾中都有表达,不过保持系花蕾中的表达量约2倍于不育系花蕾;但是在两者的叶片组织中都没有检测到。本试验获得的差异表达基因对于了解油菜花药育性形成的调控机制提供了重要的分子信息。     

利用SSCP技术分析甘蓝型油菜10个功能基因序列差异

以甘蓝型油菜SI-1300和Eagle为材料,利用DNA单链构象多态性(single-strand conformation polymorphism, SSCP)技术,对10对功能基因特异性引物进行多态性分析,每对引物均检测到1个多态性位点。随后随机挑选10个多态性片段进行测序,并利用bl2seq软件比较测序序列与基因原始序列。结果显示测序序列与所对应的基因原始序列之间相似程度平均高达98%,差异碱基数平均仅为2.3个。进一步选取5对引物比较分析两个材料间的差异扩增片段序列,发现差异扩增片段在2个材料中高度保守,平均相似度达97%;在所测序的5对引物扩增序列中,共存在39个单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphisms, SNPs)和5个插入/缺失突变(insertion-deletions, INDELs),SNP和INDEL的发生频率分别为1 SNP/30 bp和1 INDEL /233 bp。结果表明,SSCP标记能够真实代表原始功能基因,甘蓝型油菜功能基因序列在不同材料间高度保守,其遗传变异类型主要来源于SNP。     

与大白菜抗霜霉病基因连锁的分子标记研究

【研究目的】 研究与大白菜抗霜霉病基因紧密连锁的DNA分子标记。【方法】利用高抗自交系‘660’和高感自交系‘654B’及其杂交F2群体162个单株为材料,采用构建抗、感病池,利用BSA法筛选了87对SSR引物,35对拟南芥抗霜霉病相关基因的特异引物,其中特异引物RPP13P2和RPP131-2R在抗感病亲本和抗感病池中扩增出一条多态性片段RPP13MK,利用这对引物对F2代单株构建的分享群体进行扩增,验证标记RPP13MK与目的基因的连锁关系,Mapmaker 3.0软件计算遗传距离。【结果】通过F2单株验证后证明RPP13MK与抗霜霉病基因紧密连锁,其遗传距离为5.6 cM。【结论】获得了一个与大白菜抗霜霉病基因紧密连锁的分子标记RPP13MK。     

HL-CMS同质异核近等基因恢复系‘L-Rf6’的构建

为了研究红莲型水稻中2个恢复基因与2个不育基因的互作关系,用红莲型水稻不育系‘粤泰A’(‘YTA’)与恢复系‘9311’杂交,所得F1代再与保持系‘粤泰B’(‘YTB’)多次回交,最终构建了与不育系‘YTA’同质异核的近等基因恢复系‘L-Rf6’。根据Rf5和Rf6的基因序列设计了特异性分子标记,并对‘L-Rf6’进行检测。结果显示成功构建了近等基因恢复系‘L-Rf6’。对近等基因恢复系的不育基因orfh79的表达量进行分析,结果显示‘L-Rf6’中orfh79的表达量与‘YTA’比较明显下降。该近等基因恢复系的构建为阐述红莲型水稻多个恢复基因与多个不育基因的互作关系打下基础。     

玉米S组CMS育性恢复基因的分子标记定位

以[Mo17(rf_3rf_3)CMS-唐徐×HZ_1(Rf_3Rf_3)N]×Mo17(rf_3rf_3)N回交群体作为基因定位群体。采用RFLP和RAPD分子标记技术,定位了Rf_3/rf_3基因。RFLP分析表明,Rf_3/rf_3基因位于第二染色体长臂上的UMC36A和UMC49分子标记之间,其遗传距离分别为12.7cM和4.8cM。采用BSA法,筛选了340个10mer随机引物,找到与Rf_3基因紧密连锁的分子标记RAPD Eo8-1.2,将Rf_3/rf_3基因的标记距离缩小到2.7cM,为Rf_3/rf_3基因辅助选择提供了有价值的分子标记。     

陆地棉光敏雄性不育基因ys-1的遗传分析与初步定位

【目的】精细定位和克隆陆地棉光敏雄性不育基因。【方法】从陆地棉中040029的航天诱变后代中选育出新型光敏雄性不育系中9106,以中9106与11个陆地棉材料配制杂交组合,初步分析了中9106的杂种优势。以中9106为母本与陆地棉乐土603构建遗传分离群体F1、F2,分析不育性状的遗传特征。利用集团分离分析法筛选简单序列重复(Simple sequence repeat,SSR),并在包含186个单株的中9106×乐土603 F2群体中用上述SSR初步定位不育基因。【结果】中9106为母本×陆地棉乐土603的F1单株育性均表现正常,而F2群体中的可育单株数∶不育单株数符合3∶1的分离比,推测中9106的不育性状受1对隐性核基因控制。利用集团分离分析法从16 544对SSR中筛选到18对与该不育基因连锁的标记。利用中9106×乐土603的F2群体和18对SSR标记,将不育基因定位于D12染色体,位于标记NAU3442与CGR6339之间,遗传距离均为0.2c M,将该不育基因命名为ys-1。【结论】本研究有助于ys-1的精细定位及其克隆。     

甘蓝型油菜BnPPR636及其启动子的克隆与表达分析

PPR蛋白对植物的生长发育、逆境抗性以及育性具有重要的调节作用。本研究根据氨基酸序列的保守性,利用CODEHOP方法,通过简并引物扩增甘蓝型油菜基因组DNA,得到PPR基因片段。结合RACE技术,在甘蓝型油菜品系120中扩增得到了PPR基因cDNA的全长序列。分析发现该PPR基因编码一个含636个氨基酸的蛋白质,具有11个PPR基序,不含有内含子,具有典型的PPR基因特征,命名为BnPPR636。Blast比对发现,BnPPR636与白菜P2克隆的一个未知蛋白的氨基酸序列一致性最高,达到75%。RT-PCR分析表明,BnPPR636在花中的表达量最高,在根与角果中的表达量次之,叶和茎中较低。进化树分析表明,BnPPR636蛋白与其他植物中和CMS育性恢复有关的PPR蛋白序列的一致性较高。以基因组DNA为模板,利用染色体步移技术,得到了BnPPR636基因起始密码子上游1145bp的DNA片段。经生物信息学软件分析表明,该序列具有典型的启动子序列特征,并含有许多相关的顺式作用元件,可能参与调节花和根的发育。     

甘蓝型油菜双低萝卜质不育恢复系快速改良技术研究

通过采取不同的常规育种策略和小孢子培养、分子标记辅助选择等现代生物技术,研究了提高甘蓝型油菜萝卜质不育恢复系改良效率的方法。结果表明,在甘蓝型油菜萝卜质不育恢复系杂交转育过程中,采用杂交后代与萝卜质不育系杂交,可使杂交后代分离群体中不具备恢复基因的单株在花期表现出来,无须测交即可进行选择;杂交后代通过小孢子培养,可将稳定纯合时间由传统自交8个世代缩短到3个世代;通过萝卜特异分子标记辅助选择可大大提高选择的精度,减少筛选所需的人力、土地和时间,选择效率提高90%。试验筛选出19个在萝卜质不育恢复系中能够扩增出单一、易于辨别的谱带的SCAR标记引物,其中10个引物在现有的甘蓝型油菜萝卜质不育恢复系中均能检测出特异标记。筛选出的甘蓝型油菜萝卜质不育恢复系的特异分子标记与前人研究存在差异,标记相似系数为48.28%~93.10%。通过分子标记无法区分高硫甙和低硫甙恢复系,选育低硫甙萝卜质不育恢复系还需要借助品质分析仪。成功筛选得到6个甘蓝型油菜低芥酸、低硫甙、抗寒、结角正常、农艺性状优良的萝卜质不育恢复系,为将甘蓝型油菜萝卜质不育杂种优势应用于我国油菜生产奠定了基础。     

中棉所70分离群体农艺性状相关QTL定位

【目的】定位棉花产量相关性状的数量性状基因座(Quantitative trait locus,QTL)。【方法】以中棉所70的F_2分离群体为遗传作图群体,利用从14 820对简单序列重复(Simple sequence repeat,SSR)引物中筛选出的267对两亲本间的多态性引物检测F_2群体250个单株的标记基因型,利用Joinmap 4.0进行连锁分析,并通过WinQTLCart 2.5复合区间作图法对F_(2:3)群体的株高、单株结铃数和单株果枝数性状进行QTL定位。【结果】在F_2群体中共获得342个SSR标记位点,并构建了包括312个标记、35个连锁群,总长1 929.9 cM的遗传连锁图谱(标记间平均距离为9.2 cM,覆盖棉花基因组的43.4%)。经QTL定位,共检测到19个QTL,其中涉及株高的7个、单株果枝数4个、单株结铃数8个,这些QTL分布在8条染色体上,解释0.25%~11.28%的表型变异。【结论】这些与农艺性状相关的QTL有助于棉花产量分子标记辅助选择。     

陆地棉多标记基因系SSR分析

对陆地棉品种T582和T586两个多标记基因系及其杂交后代F1进行了SSR分析。结果表明,从50对SSR引物中筛选出6对引物具有多态性,占总引物数的12%。SSR序列位点多数呈共显性标记,少数为显性标记。SSR序列的扩增与两端设计引物有很大关系。