稻草秸秆纤维素分解菌的分离筛选

本研究基于获得高效木质纤维素分解菌的目的，以刚果红纤维素琼脂和滤纸条培养基为初筛培养基，从分离获得的124株真菌中筛选出透明圈与菌落直径比值较大、滤纸条分解能力较强的11个菌株。经液体发酵，测定其酶活力，复筛得到羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活均较高的4个菌株；并进行了不同碳源和不同pH对筛选菌株产酶能力的影响试验，发现不同菌株对不同纤维素物质的分解能力不一样，同一菌株对不同纤维素碳源的利用能力也不相同。     

堆肥中纤维素降解菌的筛选及复配菌降解性能研究

为加快堆肥过程中秸秆纤维素的降解速率,本研究从玉米秸秆堆肥中分离纤维素分解菌,并通过测定羧甲基纤维素酶(CMCase)活力、滤纸条崩解能力及兼容性,筛选出优良菌株,进而构建复合菌系,并对降解性能进行评价。结果共获得29株纤维素分解菌,对其中的高效菌株进行配伍,构建了6组复合菌系。除复合菌系F外,其他复合菌系的滤纸酶活力均显著高于单一菌株(P<0.05),尤以复合菌系B(xw1、xw3、xw8)、D(xw16、xw21、xw31)的酶活力最高,分别为22.8、20.4 U·mL^-1,比其中的最强单菌株xw3、xw21高出58.3%、68.6%,且所产酶具有耐高温(40～55℃)性。复合菌系B、D培养5 d可将滤纸条崩解为糊状,10 d内对秸秆的降解率达24.5%、21.9%,较单菌株xw8、xw31增加9.4和4.7个百分点。经16S rDNA分子鉴定,复合菌系B由微杆菌属(Microbacterium sp.)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp.)组成,复合菌系D由芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、类芽孢杆菌属(Paenibacillu ...     

降解玉米秸秆真菌复合菌系的构建及其降解效果评价

  【目的】  秸秆的木质纤维素含量丰富、结构复杂，在自然界中降解较慢，增加秸秆降解菌剂中菌株的多样性有利于提升还田秸秆的降解效果。探究菌株多样性水平和组成影响复合菌系秸秆降解的效果及原因，为复合菌系在秸秆降解中的应用提供理论支撑。  【方法】  通过富集驯化培养，从玉米秸秆还田土壤中筛选具有秸秆降解能力的真菌，从中挑选5株高效秸秆降解真菌进行基因间隔区序列 (ITS) 测定和物种鉴定，明确其分类地位。通过全组合构建菌株多样性为1～5的复合菌系，分别检测复合菌系的秸秆相对降解率及其滤纸酶、纤维素内切酶和木聚糖酶活性，利用方差分析和相关性分析等方法研究菌株多样性和组成对复合菌系玉米秸秆降解效果及其纤维素酶活性的影响。  【结果】  共筛选获得了15株具有秸秆降解能力的真菌，其中5株真菌的秸秆降解效果好、纤维素水解能力强。经ITS序列鉴定和系统发育分析，发现5株降解真菌的遗传差异较大，Z7-6、F7-5、F4-3、L1-1和J2-5分别与草酸青霉 (Z7-6: Penicillium oxalicum)、烟曲霉 (F7-5: Aspergillus fumigatus)、哈茨木霉 (F4-3: Trichoderma harzianum)、白囊耙齿菌 (L1-1: Irpex lacteus) 和木贼镰刀菌 (J2-5: Fusarium equiseti) 的ITS序列相似度均超过99.95%。全组合复配结果表明，复合菌系的秸秆降解能力和纤维素酶活力均高于各单一菌株，且随着菌株多样性水平的增加而提高。滤纸酶、纤维素内切酶和木聚糖酶的活力越强，复合菌系对玉米秸秆的降解效果越好，而其秸秆相对降解率主要取决于滤纸酶和纤维素内切酶的活性。抽样效应分析发现，不同菌株对复合菌系的秸秆降解效果、滤纸酶和纤维素内切酶活性的影响不同。不含菌株F7-5的复合菌系降解效果显著优于含有该菌株的组合，以Z7-6 (P. oxalicum)、F4-3 (T. harzianum)、L1-1 (I. lacteus) 和J2-5 (F. equiseti) 组合F1的玉米秸秆降解效果最佳、酶活性最高。  【结论】  秸秆降解复合菌系的构建过程需要同时考虑多样性效应和抽样效应，增加降解菌的多样性有助于增强秸秆的降解效果。本研究筛选获得的复合菌系F1在玉米秸秆降解中具有潜在的应用前景。     

秸秆纤维素降解真菌QSH3-3的筛选及其特性研究

为了获得高效降解秸秆纤维素的微生物菌株,采用滤纸降解法和刚果红染色法从含纤维素类物质的土壤中筛选到一株产纤维素酶菌株QSH3-3,通过形态观察和ITS序列分析,鉴定为草酸青霉Penicillium oxalicum QSH3-3。摇瓶产酶试验结果表明,该菌株的最佳产酶条件为:碳源为0.5%的碱处理过的玉米秸秆粉,氮源为0.2% 硫酸铵,起始pH为7,接种量为5%,产酶温度为30℃,培养时间为4 d。最佳产酶条件下,滤纸酶（FPase）、内切酶（CMCase）和木聚糖酶（Xylanase）分别为12 U、33 U、605 U（U为酶活性单位）;在15℃,其残余酶活力可达70%～80%;在pH 4～9 范围内,其残余酶活力可达70%以上。酶学稳定性研究表明,FPase、CMCase和Xylanase在pH 4～9范围残余酶活力达85%以上,具有较强的酸碱适应能力;FPase、CMCase和Xylanase在45℃以上酶活力迅速下降,耐热性较差。该菌株具有较高的木聚糖酶活力以及较强的低温、pH的耐受力,因而该菌株在田间温差大、土壤偏碱性等复杂条件下对秸秆纤维素类物质的降解具有较高的应用潜力。     

纤维素酶高产菌株桧状青霉9-3的诱变选育及产酶条件研究

本文以桧状青霉9-3为出发菌株,采用硫酸二乙酯（DES）诱变,通过筛选得到一株酶活力高且遗传稳定性良好的菌株H16,其滤纸酶活力、β-葡萄糖苷酶酶活力与蛋白产量均较出发菌株相比均提高了4倍左右。并通过对发酵培养基以及发酵条件的优化,确定了最佳的产酶条件为：微晶纤维素浓度为2%,玉米浆干粉浓度为1.5%,发酵温度为30℃,初始pH为5.5,装液量为30 mL/250 mL,发酵周期为5 d。在优化的条件下,该菌株的纤维素酶和蛋白产量均进一步提高25%左右。     

黑胸散白蚁体内产纤维素酶细菌的筛选及其纤维素酶基因的鉴定与原核表达

白蚁(Isoptera)常以富含纤维素的木材为食,体内存在纤维素酶产生菌。从源于陕西佛坪的白蚁(经鉴定为黑胸散白蚁(Reticulitermes chinensis))体内筛选出了4株产纤维素酶菌株,采用单因素实验设计对酶活最高的菌株进行了产酶条件优化,并对其所产纤维素酶进行了酶学性质研究;同时,依据NCBI数据库设计的引物扩增出了该菌株的内切-β-1,4-葡聚糖酶基因Cbs和β-葡萄糖苷酶基因Ba G,之后在大肠杆菌(Escherichia coli)中进行了表达实验。结果表明:从黑胸散白蚁体内筛选出4株菌分别是阿氏肠杆菌(Enterobacter asburiae)、炭疽芽胞杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),其中枯草芽胞杆菌所产纤维素酶的活力最高,该菌发酵产酶的最适温度和pH分别是42℃、6.5,酶促反应的最适温度和pH分别是70℃、4.5,在此条件下该菌株酶活力为2.36 U/mL。该菌株所产的纤维素酶在50℃、pH 6.5的条件下热稳定性和pH稳定性最佳,使用该菌株所产的粗酶液发酵粗饲料,结果发现其对玉米(Zea mays)秸秆、小麦(Triticum aestivum)秸秆、苜蓿(Medicago polymorpha)干草和青贮饲料的粗纤维降解率分别为12.21%、1.3%、3.24%和17.42%。基因克隆结果表明该菌株具有Ba G、Cbs 2个纤维素酶基因,且大肠杆菌表达结果显示Ba G基因的粗酶液pro Ba G无纤维素酶活性,而Cbs基因的粗酶液pro Cbs在60℃、pH 5.0时酶活可达4.14 U/mL,将Ba G和Cbs基因进行原核融合表达,产生的蛋白约35 k D,其在最适条件70℃、pH 4.5时的酶活为4.57 U/mL,说明无纤维素酶活性的Ba G基因与Cbs基因融合后可能表达出了一个活性更高的纤维素酶蛋白。本研究对后期构建可降解木质纤维素的人工重组菌具有重要的理论价值。     

高效纤维素降解菌的筛选及复合菌系的构建

本研究旨在筛选高效纤维素降解菌,组建复合菌系,用于堆肥接种剂的开发。通过纤维素刚果红选择性培养基,从腐殖土、堆肥样品中分离高效纤维素降解常温菌和耐高温菌。经过羧甲基纤维素酶活(carboxymethyl cellulase,CMCase)、滤纸条崩解能力、对稻杆及苦参(Sophora flavescens Ait.)残渣在液态和固态发酵条件下的降解能力测定逐级淘汰,筛选高效菌株组建复合菌系。研究结果表明,通过拮抗作用、单一菌株在复合菌系中作用测定,最终构建了由3株细菌(弗留明拜叶林克氏菌(Beijerinckia fluminensis)、微杆菌(Microbacterium sp.)和芽胞杆菌(Bacillus sp.)),1株链霉菌(Streptomyces sp.)和1株毛壳菌(Chaetomium sp.)组成的木质纤维素降解高效复合菌系。供试菌株在液态发酵条件下对稻杆和苦参残渣的降解效果明显强于固态发酵,稻杆比苦参残渣更容易被大多数微生物降解,供试真菌在稻杆和苦参残渣的降解中普遍表现出较高的降解效果。筛选得到弗留明拜叶林克氏菌XM-3可以在48 h内将滤纸条完全崩解,复合菌系在固态发酵20 d后对苦参残渣和稻秆的降解率分别达到31.4%和63.1%。本研究对堆肥接种剂的开发具有参考和借鉴意义。     

纤维素降解菌CMC-4的分离鉴定、诱变和酶学特性研究

从秸秆还田土壤中初筛获得一株高效纤维素降解菌CMC-4,根据菌株形态、理化性质及16S rDNA序列分析,初步鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。以此为出发菌株,经亚硝酸钠诱变获得一株稳定高产纤维素酶突变株CMC-4-3。对CMC-4和CMC-4-3的产酶条件和酶学性质进行比较分析,结果表明:CMC-4-3纤维素酶活力较CMC-4提高67.5%;其最适产酶条件是:37℃、pH 6.0、葡萄糖为碳源、蛋白胨为氮源、接种量2.0%、装液量60 ml/250 ml。该菌株所产纤维素酶的最适反应pH为6.0,且在4.0~7.0酶活力较稳定;最适反应温度为50℃,在20~80℃范围内均保持稳定;金属离子Fe~(2+)、Mg~(2+)、Co~(2+)、K~+对酶有激活作用,其余离子均有不同程度抑制作用,而Cu~(2+)和Ca~(2+)抑制作用最强,酶活力减弱近50%,是该酶的强效抑制因子。诱变前后菌株产酶条件和酶学性质等部分表型发生了变化,而突变菌株显示出了更宽泛的环境适应范围。据此,获得一株高效产纤维素酶、耐受范围广的具纤维素降解能力的地衣芽孢杆菌,而CMC-4-3和CMC-4的表型可作为深入探讨基因型变化的线索。     

玉米秸秆低温降解菌的分离筛选及鉴定

利用从渭源县山地采集的30份样品,采用刚果红染色法和液体摇瓶发酵法筛选出了1株能够在15℃条件下降解羧甲基纤维素、玉米秸秆纤维素和高产纤维素酶的真菌菌株D5,同时测定了该菌株纤维素酶活力和对玉米秸秆的降解能力,并通过ITS r DNA序列分析对该真菌进行了初步鉴定。结果表明,菌株D5液体培养7 d的木聚糖酶活为52.7 U·m L~(-1),CMCase酶活为31.5 U·m L~(-1),滤纸酶活为29.6 U·m L~(-1);菌株D5在玉米秸秆为唯一碳源的培养基里发酵10 d,玉米秸秆的失重率为29.8%。菌株D5经ITS r DNA序列分析初步鉴定为Penicillium sp.,在玉米秸秆降解方面具有较大的应用潜力。     

一株烟草秸秆降解菌的分离、鉴定及酶学性质研究

从皖南地区烟稻轮作田土壤中经CMC-Na初筛获得5株纤维素降解菌,经DNS法测定纤维素酶活性复筛得到一株降解活性较高的降解菌YC-2。根据该菌16S r DNA序列比对结果,结合形态和生理生化特征,确定YC-2为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。对YC-2酶学性质进行相关研究,并分析YC-2对烟碱的耐受情况及对烟草秸秆的降解情况,结果表明:在7天内,YC-2对烟草秸秆降解率为10.14%;酶学特性表现为最适反应温度为60℃且在15~60℃之间具有稳定性;最适反应pH为7.0,在pH 4.0~7.5范围内稳定性较好;YC-2在浓度为1~2 g/L烟碱中能快速生长,而在高浓度的烟碱中生长受到抑制。因此,菌株YC-2产纤维素酶活性较高、相对耐热耐碱且对烟杆有一定分解作用,通过进一步诱变选育和发酵条件优化有较好的田间应用潜力。     

用于生物质酶解过程的纤维素酶研究进展

纤维素酶解效率是木质纤维素经济、高效生化转化的限制瓶颈。该文讨论了影响纤维素酶酶解经济性与高效性的多个要素,如:高滤纸酶活菌株的选育、发酵、酶解机理、酶解影响因素及酶解混合体系的优化等。该文研究表明,纤维二糖水解酶可能是决定发酵体系中滤纸酶活高低的关键单酶组分,同时,该酶可能也是预处理后生物质酶解体系中决定滤纸酶活效率的关键单酶组分。酶解过程中关键限速反应的认识及关键限制因素形成机制的揭示将成为纤维素酶生化转化研究的重点,这些机理机制的建立可为构建高比活力纤维素酶提供理论依据。     

发酵法制备蛤蜊ACE抑制肽的菌种筛选

为筛选适用于发酵蛤蜊制备降血压活性多肽的纳豆芽孢杆菌,本试验从7种日本纳豆中初筛6株具有较高蛋白酶活性的纳豆芽孢杆菌株用于发酵蛤蜊,以体外血管紧张素转化酶(ACE)抑制率及多肽含量为评价指标筛选目的菌株。结果表明,共筛选出3株目的菌株(GL-5、GL~(-1)2和GL-25),其发酵产物对ACE抑制率分别为71.55%、78.31%、75.08%,多肽含量分别可达8.12、9.62、8.79mg·m L~(-1)。其中,GL~(-1)2发酵产物经消化酶水解后仍保持68.31%的ACE抑制率,表明其具有较强的抗消化能力。本研究结果为蛤蜊高值化利用开发具有降血压作用的功能食品提供了一定的理论依据。     

降解亚硝酸盐和生物胺乳杆菌筛选及其改善鱼肉香肠品质效果

为了筛选出优良亚硝酸盐和生物胺的降解植物乳杆菌,并研究在鱼肉发酵香肠中的应用。该文主要考察了19株植物乳杆菌亚硝酸盐和生物胺的降解活性及相关基因的携带情况,从中筛选出优良菌株,并研究其对鱼肉香肠发酵过程中各种亚硝胺、生物胺、腐败微生物的抑制作用和对其他理化指标的影响。试验结果表明,L.plantarum CP3对亚硝酸盐和生物胺的降解能力最强,分别达到95%和77%,PCR结果显示此菌株中含有亚硝酸盐降解(假定蛋白(hypothetical protein,HP)、谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase,GR)、一氧化还原酶(Oxidoreductase,ORD))和生物胺降解的相关基因(multicopper oxidases,suf I),且不含生物胺生成相关基因(hdc,tdc,odc)。GC-MS测定结果显示L.plantarum CP3对发酵香肠中4种亚硝胺-二乙基亚硝胺(N-nitrosodiethylamine,NDEA),二甲基亚硝胺(N-nitrosodimethylamine,NDMA),亚硝基吗啉(N-nitrosomorpholine,NMOR)和甲基乙基亚硝胺(N-nitrosomethylamine,NMEA)的生成都具有显著的抑制作用,联合接种L.saki M4可以协同提高亚硝胺的降解能力。并且,与对照组相比,接种L.plantarum CP3+L.saki M4的鱼肉香肠,发酵48 h后腐胺、尸胺和酪胺的含量分别降低了76.83%,93.33%和88%。另外,接种乳酸菌处理组香肠中的肠杆菌、假单胞菌等腐败菌及pH值、硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)和挥发性盐基氮(total volatile basic nitrogen,TVB-N)的含量显著低于对照组。该研究结果体现了L.plantarum CP3作为香肠等肉制品发酵剂的良好开发应用前景。     

猪毛角蛋白降解菌的分离筛选及其降解特性研究

为了筛选能高效降解猪毛角蛋白的微生物,该研究利用猪毛角蛋白为唯一碳氮源的培养基从土壤中分离角蛋白降解菌,并对其菌种分类及降解角蛋白的特性进行了研究。通过驯化共筛选到6株能够降解猪毛角蛋白的菌株,经过7 d发酵培养,菌株X-3对猪毛角蛋白的降解率达77.3%,降解效果最佳。结合菌株形态特征、生理生化特征及16S rDNA发育进化树分析,初步鉴定该菌株为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)。菌株X-3是一株广谱的角蛋白降解菌,对猪毛、羊毛、鸡毛、鹅毛、鸭毛的降解率均大于60%。该菌株在角蛋白底物作用下可产生角蛋白酶和二硫键还原酶,且酶活与猪毛角蛋白降解率变化存在显著的正相关性,表明菌株X-3产生的角蛋白酶和二硫键还原酶在角蛋白降解中起到非常关键的作用。在降解过程中,产生了大量的可溶性蛋白,二硫键中的硫也随之转化为硫酸盐、亚硫酸盐和巯基化合物,其中硫酸盐是主要的转化形式。该菌株的分离筛选丰富了猪毛角蛋白降解菌的微生物资源库,在氨基酸饲料生产中具有潜在的应用价值。     

发酵鸡粪的高温蛋白分解菌的筛选

采用含有酪素的细菌培养基进行稀释分离,从自然鸡粪堆肥中筛选出16株分解蛋白能力较强的菌株,透明圈直径(d)最大达到66.5mm;通过酶活性的测定,得到9个菌株其中性蛋白酶活力较高,并且在50℃能良好生长;将9个高温菌株分别回接灭菌鸡粪,筛选得到有5个菌株能在鸡粪中定殖,50℃恒温发酵10天,活菌数达到109个g-1以上;接种JS8菌株进行鸡粪发酵,从温度、含水量及pH值指标上,均明显好于鸡粪自然发酵,说明人工添加外源菌群有利于缩短发酵时间、减少发酵过程中养分损失,具有广阔的应用前景。     

腌制叶用芥菜发酵菌分离鉴定及应用研究

为获得发酵性能优良的菌株,生产优质的发酵叶用芥菜,本研究从自然发酵的芥菜中分离发酵用菌株,通过测定乳酸菌的生长、产酸和亚硝酸盐降解能力以及酵母菌的产气、产酯能力和蛋白酶活性等发酵特性进行筛选,并对筛选获得的优良发酵菌加以应用。结果表明,筛选获得的2株乳酸菌L8短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、L9植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和1株酵母菌Y9酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)在腌制叶用芥菜中的发酵性能优良。与自然发酵的叶用芥菜相比,接菌发酵叶用芥菜的pH值和亚硝酸盐含量分别减少了2.22%和88.13%;总酸含量、氨基酸态氮含量分别增加了9.02%和28.09%。接菌发酵提高了腌制芥菜的营养品质和安全性。本研究丰富了叶用芥菜的发酵菌种,为蔬菜发酵加工产业奠定了技术基础。     

纤维素降解真菌A25-2的分离、鉴定及其产纤维素酶的酶学特性

本研究以Avicel-刚果红选择培养基为初筛培养基,从云南哀牢山国家级自然保护区和广西猫儿山国家级自然保护区的土壤样品中分离筛选得到4200株真菌,从中筛选出透明圈与菌落直径比较大、透明程度较为清晰的12个菌株。通过液体培养发酵,测定其上清液中的羧甲基纤维素酶活力、滤纸酶活力和Avicel酶活力,最终筛选出一株产该三种酶且其活力均最高的真菌菌株A25-2。通过对菌株A25-2形态学观察和其内转录间隔区（internal transcribed spacer,ITS）序列同源性比对分析,将菌株A25-2鉴定为哈茨木霉（Hypocrea lixii）。酶活测定结果表明菌株A25-2产纤维素酶的酶活力较高,在最适作用pH4.5和最适作用温度55℃下,其羧甲基纤维素酶活力为2.26IU/mL,滤纸酶活力为0.58IU/mL,Avicel酶活力为0.39IU/mL。薄层层析实验表明A25-2具有完整的纤维素酶系统。因此,真菌A25-2可作为饲料加工等生产和纤维素酶相关研究的备选菌株。     

一株从金钱树上分离的产纤维素降解酶的菌株的分离及特性鉴定

本研究从金钱树（Zamioculcas zamiifolia）白绢病（Southern blight）病株上分离到一株产纤维素酶菌株SM，经形态观察和rDNA—ITS序列分析鉴定为齐整小核菌（Sclerotium rolfsii Sacc），经以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基培养和刚果红染色测定，证明SM菌株可产生高活性纤维素降解酶。本文对SM菌株产纤维素降解酶的液态发酵条件进行了研究，结果表明：在起始pH6．0，无机氮：有机氮：纤维素碳源之比为0．07g：1．4g：1．6g，温度为30℃，摇床转速为160r／min，发酵培养时间为5d的条件下，该菌株发酵液的CMC酶活性达到11．7U／mL，滤纸酶活性达到2．156U／mL，β-葡萄糖苷酶活性达到3．911U／mL。