GFP标记的植物促生菌B96-Ⅱ-gfp的定殖能力研究

采用绿色荧光蛋白基因标记技术研究了植物促生菌B96-Ⅱ的标记菌B96-Ⅱ-gfp在盆栽黄瓜土壤中的时间、空间定殖动态以及在黄瓜植株上的分布。研究表明: B96-Ⅱ-gfp在土壤中具有持久的定殖能力, 接种180 d时在自然土和黄瓜枯萎菌病土中的定殖数量分别为2.7×10⁴ cfu·g^-1和6.6×10⁴ cfu·g^-1, 360 d时在土壤中仍可检测到B96-Ⅱ-gfp的存在。B96-Ⅱ-gfp可在盆栽植株生长土壤的表层(0~4 cm)、中层(4~8 cm)和底层(8~12 cm)定殖, 定殖数量随土壤深度的增加而增加。此外, B96-Ⅱ-gfp还可在黄瓜的根、茎和叶上定殖, 根部定殖的数量(7.2×10⁴ cfu·g^-1)显著高于茎部和叶部定殖的数量; 黄瓜植株体内定殖的数量多于体表定殖的数量。对土壤中可培养的3大微生物类群影响的研究表明: B96-Ⅱ-gfp对土壤中真菌数量具有显著抑制作用, 而对细菌和放线菌数量则没有明显影响。防病促生试验表明: B96-Ⅱ-gfp可增加黄瓜株高、鲜重和干重, 对黄瓜枯萎病有一定的防治效果, 且与未标记菌株B96-Ⅱ的防病促生作用无显著差异。     

甘蔗内生菌B9的鉴定及其促生长机制和定殖能力的研究

B9是一株分离于甘蔗品种\"云蔗99-91\"根部的内生菌,笔者对其种属鉴定与促生长机制开展研究,以期应用于甘蔗生产。试验通过传统方法与16S rRNA等看家基因片段测序对菌株进行分类鉴定;采用固体透明圈、酸性钼蓝比色法、火焰分光光度法、GFP荧光标记等方法测定与研究B9菌株固氮、溶磷、解钾、产IAA、嗜铁素等生物学活性及在甘蔗苗内的定殖情况;最后通过回接法研究菌液处理对玉米种子萌发与甘蔗幼苗生长发育的影响。结果表明B9菌属于芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),具有固氮、溶磷、解钾、产生IAA和嗜铁素的能力。用B9菌液处理后能提高玉米种子的发芽势与促进根芽组织生长,同时处理组甘蔗苗株在农艺性状与生理生化水平上明显优于无菌清水对照,并且发现B9菌能在甘蔗根茎叶内稳定定殖。本文鉴定了B9菌的种类和功能,阐明了B9菌的促生长机制和定殖能力,为开发生物菌肥并应用于生产提供理论依据。     

内生枯草芽孢杆菌B-001菌株内生定殖研究及生物学特性

用浸种、浸根、淋根、伤茎、伤叶和喷雾等接种方法测试枯草芽孢杆菌B-001菌株入侵烟草植株的途径,发现该菌可通过自然孔口和伤口入侵寄主植物;取接种植株的茎部组织切片在电镜下观察,发现该菌株在烟草的微管束和细胞内定殖。生长特性研究结果表明该菌株最适生长pH为7.5,最适生长温度为30℃,48～96h内处于稳定生长期。     

短小芽孢杆菌BX-4抗生素标记及定殖效果研究

为研究短小芽孢杆菌BX-4在作物根际的定殖及防病效果,通过浓度梯度法用氨苄青霉素对其进行了抗性标记,并通过番茄盆栽试验研究了其在根际土壤中的定殖规律。结果表明,筛选出的突变体菌株BX-4＇能够耐受浓度为200 μg·mL^-1的氨苄青霉素,并且具有耐药和遗传双重稳定性;应用试验显示该突变体菌株能成功在番茄根际定殖,接种20 d后根际土壤中存活数量达到最高值1.34×10^8 cfu·g^-1干土,以后逐渐下降,到50 d时趋于稳定;筛选的突变体菌株对番茄青枯病具有明显的防治效果,防效达37.9%-50.9%。短小芽孢杆菌BX-4在作物根部的定殖规律为揭示其生防机理及应用该菌提供了科学根据。     

巨大芽孢杆菌在油菜根部定殖和促生作用的研究

采用基因标记技术和常规方法跟踪巨大芽孢杆菌A6 (gusA)在缩影系统油菜根际的定殖情况。A6 (gusA)菌在油菜不同根段部位的定殖密度表现从上到下逐渐递减的现象。随着接种后时间的延长而逐渐下降。在根段 8cm以外的根区几乎检测不到接种菌。在油菜播种后 3d ,定殖密度可达最高水平 (8 7×10 5cfug-1根 ) ,然后急速下降 ,30d后保持相对稳定的较低水平 (2 2× 10 2 cfug-1根 )。在促生试验中 ,表现在不同程度上增加植株干重、全氮、全磷和全钾的含量     

巨大芽胞杆菌WY4的GFP标记及其在小白菜上的定殖

解磷菌(phosphate solubilizing bacteria,PSB)可以通过提高土壤有效磷含量而增加作物产量,目前已有许多解磷菌被分离并应用于农业生产中,但关于解磷菌在植物根际中的定殖情况仍缺乏系统性的研究.WY4为本实验室前期从小白菜(Brassica chinensis)根际分离得到的一株高效解磷菌,本研究利用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)标记技术研究了WY4在小白菜根际及土壤中的定殖规律.与原菌株相比,GFP标记对菌株WY4-GFP生长及解磷活性具有较小影响,同时在促进小白菜生长上WY4-GFP与WY4无显著性差异;WY4-GFP具有持久的定殖能力(接种21d的自然土及30 d的小白菜根际土中,WY4-GFP的定殖数量分别为105和104 CFU/g左右),同时随时间的增加WY4-GFP在土壤中定殖数量逐渐减少;WY4-GFP在小白菜根冠及分生区大量定殖,在伸长区及侧根根毛处数量较少,同时表皮细胞间隙上也有较多的标记菌株.研究结果表明,WY4-GFP在小白菜根际及土壤中具有良好的定殖能力,这为后期深入研究解磷菌与植物间的关系提供了重要参考.     

荧光假单胞杆菌RB-42 RB-89的趋化性与烟草根部定殖研究

烟草PGPR(PlantGrowth PromotingRhizobacteria)菌株RB 89、RB 42对烟草根部收集液有较强的趋化性。在稀释浓度为10-5时,RB 89、RB 42的趋化值依次为1 79、1 83。RB 42和RB 89对氨基酸趋化性差异显著,对酪氨酸、脯氨酸、甘氨酸、笨丙氨酸表现出较强的趋化性,对组氨酸、苏氨酸没有表现出趋化性;RB 42和RB 89菌株对有机酸的趋化性没有明显区别,只是RB 42对乳酸的趋化性表现得比对其它有机酸的强些;菌株对糖类物质的趋化性最弱。菌株RB 89、RB 42在烟株根表的定殖受灭菌、趋化剂影响较大,土壤灭菌、趋化剂处理可增加菌株在根表的定殖量。     

荧光假单胞杆菌RB-42 RB-89的趋化性与烟草根部定殖研究

烟草PGPR(Plant Growth-Promoting Rhizobacteria)菌株RB-89、RB-42对烟草根部收集液有较强的趋化性。在稀释浓度为10^-5时,RB-89、RB-42的趋化值依次为1．79、1．83。RB-42和RB-89对氨基酸趋化性差异显著,对酪氨酸、脯氨酸、甘氨酸、笨丙氨酸表现出较强的趋化性,对组氨酸、苏氨酸没有表现出趋化性;RB-42和RB-89菌株对有机酸的趋化性没有明显区别,只是RB-42对乳酸的趋化性表现得比对其它有机酸的强些;菌株对糖类物质的趋化性最弱。菌株RB-89、RB一42在烟株根表的定殖受灭菌、趋化剂影响较大,土壤灭菌、趋化剂处理可增加菌株在根表的定殖量。     

钩状木霉 ACCC31649的GFP标记及其对辣椒定殖和促生作用

【目的】旨在建立农杆菌介导的绿色荧光蛋白 (GFP) 基因转化钩状木霉 (Trichoderma hamatum) ACCC31649的技术方法,筛选遗传稳定的GFP标记转化子,并研究该菌株在辣椒植株中定殖和对辣椒的促生作用,为进一步阐明木霉在辣椒根际定殖及其与辣椒病原菌在辣椒根际和植株中的定殖、互作和生防作用奠定基础。【方法】通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法筛选遗传稳定的GFP标记转化子,通过灌根接种方法和组织切片的水玻片荧光观察研究了钩状木霉在辣椒植株中定殖过程和对辣椒的促生作用。【结果】获得了遗传稳定GFP标记的钩状木霉转化子。荧光显微观察表明,辣椒根、茎、叶组织中都检测到GFP标记菌株的定殖。标记菌株首先在根部定殖,然后通过根部维管束逐步定殖到茎和叶片组织中。野生型菌株和GFP标记菌株灌根接种4叶期辣椒幼苗,30天后,GFP标记菌株与水处理对照相比,辣椒的株高增长13.5%,根长增长16.2%,鲜重和干重分别增加了43.8%和45.3%,而且野生型菌株与GFP标记菌株对辣椒的促生作用没有显著差异。【结论】钩状木霉能够在辣椒植株根、茎和叶组织中定殖,并且对辣椒具有显著的促生作用。同时,GFP标记的钩状木霉将在进一步阐明该菌株在辣椒根际定殖及其对病原菌拮抗和互作研究中发挥重要作用。     

梨树内生细菌LP-5的鉴定及其促生作用研究

从梨树木质部分离到1株具有强烈抑菌活性的内生细菌LP-5,通过形态观察、生理生化测定、16SrDNA序列分析及特异基因片段扩增,将其鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。盆栽试验结果表明,该菌株可明显促进黄瓜幼苗的生长,其20倍稀释发酵液处理黄瓜种子,可使其胚根长度增长36.32%。用同稀释倍数的发酵液处理黄瓜幼苗,可使幼苗株高、茎粗、干重分别提高9.06%、14.67%和24.14%。高效液相色谱分析表明:该菌株具有促生作用可能是因为产生植物激素IAA。     

不同类型的转基因细胞为核供体生产猪的转绿色荧光蛋白基因克隆胚胎

2005年我国获得了体细胞克隆猪的成功,但是在体细胞转基因克隆猪方面还处于起步阶段。猪的转基因克隆在农业和医学方面有着巨大的应用前景,在农业上可以提高猪肉品质和培育抗病猪种等;医学上可以为人类异种器官移植、疾病模型和新药筛选提供理想材料。体细胞核移植结合基因组修饰技术,是目前生产转基因家畜的一种有效方式。供体细胞的类型是影响转基因克隆效率的一个关键因素,因为供体细胞的类型决定着体细胞转基因效率和重组胚的发育潜力。目前所知,较成功用于生产转基因克隆猪的供体细胞仅限于胎儿成纤维细胞,因为它易培养、增殖期限长、重构胚的发育能力高。此外骨髓间充质细胞,一种成体干细胞,作为转基因克隆猪的供体细胞有着巨大的潜力,国内外仅有个别报道。前脂肪细胞,一种易于获得的体细胞,有报道称利用成年猪前脂肪细胞为核供体构建的克隆胚发育能力和胎儿成纤维细胞相当,并且获得了克隆猪的后代。而利用猪前脂肪细胞生产转基因克隆胚胎,将为后续组织工程研究奠定基础。因此本研究选择猪胎儿成纤维细胞、骨髓间充质细胞和前脂肪细胞为转基因克隆的供体细胞,目的是比较不同类型转基因供体细胞对生产克隆胚胎效率的影响。本研究首先建立了近交系五指山小型猪(WZSP)胎儿成纤维细胞系(FF)、新生猪骨髓间充质细胞(MSCs)系和成年猪前脂肪细胞系(PreA)。采用组织块法建立胎儿(27日龄)成纤维细胞系;髓间充质细胞从新生猪后腿骨冲取骨髓,加入到Percoll分离液中离心,吸取中间界层面细胞,贴壁法培养骨髓间充质原代细胞,培养基为低糖DMEM。对间充质细胞向脂肪细胞进行诱导分化,油红O染色鉴定;前脂肪细胞从猪的皮下脂肪取样,用0.1%胶原酶消化法建立前脂肪细胞原代细胞,并对前脂肪细胞进行诱导分化为成熟的脂肪细胞,油红O染色鉴定。为了获得转基因细胞系,利用脂质体lipofectamineTM2000(Invitrogene)介导的方法将质粒pEGFP-N1转染了胎儿成纤维细胞、骨髓间充质细胞和前脂肪细胞,经过800μg/mL G418筛选后均获得了阳性细胞株。分别以3种类型转基因和未转基因细胞为核供体进行猪的体细胞核移植,比较克隆胚胎的发育能力。结果如下:(1)比较了3种类型非转基因细胞的重组胚的囊胚发育率,发现胎儿成纤维细胞(8.2%)、骨髓间充质细胞(7.1%)和前脂肪细胞(8.8%)囊胚发育率差异不显著(P>0.05);(2)比较了3种类型转基因细胞的重组胚的囊胚发育率,发现胎儿成纤维细胞(9.6%)和骨髓间充质细胞(9.9%)最高,前脂肪细胞(3.7%)最低,前两者与后者差异显著(P<0.05);(3)分别比较了每一类型供体细胞转基因和非转基因对重组胚的囊胚发育率的影响,转基因对胎儿成纤维细胞(9.6%vs 8.2%)和骨髓间充质细胞(9.9%vs 7.1%)的重构胚囊胚发育率影响不大(P>0.05);前脂肪细胞转基因重组胚的囊胚发育率显著降低(3.7%vs 8.8%,P<0.05)。以上结果表明,某些供体细胞类型转基因与否对猪克隆胚胎的早期体外发育影响不明显,有些细胞类型转基因对克隆胚的发育能力影响较大。通过体细胞核移植技术,猪胎儿成纤维细胞和骨髓间充质细胞可以有效地生产猪转基因囊胚,但前脂肪细胞转基因克隆胚胎的囊胚发育率能否进一步提高,还需要进一步的实验观察。     

绿色荧光蛋白(GFP)基因在Pseudozyma antarctica中的表达

Pseudozyma antarctica隶属于担子菌纲。P．antarctica的双质粒共转化系统包括：pSceI-hyg和pVectour libre，其中pSce I-hyg含有hsp70启动子和终止子以及潮霉素抗性基因；pVectour libre仅含有hsp70启动子和终止子，以便插入要表达的目的基因。设计引物扩增得到绿色荧光蛋白基因后，插入pVectour libre，构建质粒GFP．hsp，将该质粒与pSce I-hyg共转化P．antarctica；实现了该系统在P．antarctica中的绿色荧光表达。     

用绿色荧光蛋白基因（gfp）标记产酸克雷伯氏菌SG—11研究其在水稻苗期根部的定殖

本研究以自水稻根面分离的产酸克雷伯氏菌SG－11为出发菌株,分别用携带gfp和nifH-gfp的质粒转化SG－11进行基因标记,得到了转化子SG－11A和SG－11B。对两转化子的生长曲线和质粒稳定性进行了测定,在LB培养基中,SG－11的倍增时间为0.815h,对数期是3.20－5.28h,样品各点与其曲线的相关系数R^2=0.9975;SG-11A的倍增时间为1.02h,对数期是3.27－5.37h,R^2=0.9987,在无选择压力的条件下,连续传80代时质粒的保存率为0％。在K中这培养基中,SG－11的倍增时间为1.159h,对数期是2.50-4.92h,相关系数R^2=0.9922;SG-11B的倍增时间为1.163h,对数期是2.50－4.92h,相关系数R^2＝0.9698,连续转100代时质粒的保存率为65.6%。激光共聚焦显微镜观察结果表明：在试管限菌培养条件下,SG－11A主要定殖在水稻根部的伸长区和根毛区,并且在次生根形成处有菌团存在,在水稻根通气组织的细胞间隙和维管束导管内发现了SG－11A,在根的伸长区只是偶尔观察到了表达nifH-gfp的SG－11B。砂培条件下,在水稻根伸长区观察到了少量SG－11A的定殖,未检测到SG－11B。稻田土盆栽实验中,在水稻的根部既未检测到SG－11A也未检测到SG－11B。     

含有增强型绿色荧光蛋白报告子的载体系统的构建

将增强型绿色荧光蛋白基因编码序列克隆到不含启动子的载体pLAFR6上,构建报告质粒pLZY。将野油菜黄单胞菌的已知效应物基因xopXccN启动子和分泌转运信号区序列克隆到pLZY,重组质粒导入野油菜黄单胞菌,阳性克隆细胞在荧光显微镜下呈现绿色荧光。阳性克隆接种萝卜叶片,在共聚焦激光扫描显微镜下检测观察到在植物细胞内发荧光,而含有pLZY的野油菜黄单胞菌对照菌株菌体和植物细胞内都检测不到绿色荧光,证明报告质粒pLZY工作正常。该报告质粒为研究目的基因在不同宿主中的表达和研究植物病原细菌Ⅲ型效应物蛋白的植物亚细胞定位提供了材料。     

解淀粉芽孢杆菌YN-1抑菌蛋白TasA基因的克隆及原核表达

本文以解淀粉芽孢杆菌YN-1菌株为研究对象,利用PCR方法从基因组DNA中扩增出编码TasA抑菌基因的全长DNA,并构建pGEX-4T2/TasA原核表达载体,获得TasA-GST融合表达的抑菌蛋白。测序结果表明,解淀粉芽孢杆菌YN-1TasA基因核苷酸序列全长为786bp(GenBank登录号:EU131674),编码261个氨基酸残基;同源性分析表明,它与解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens FZB42(YP_001421886)序列的同源性最高,达98%,预测蛋白分子量为31kD。SDS-PAGE分析表明,TasA基因能在大肠杆菌BL21中表达,Western印迹分析pGEX-4T2/TasA原核表达载体,检测到约57kD的TasA-GST融合外源蛋白,与预测的融合蛋白分子量大小相符。表达产物细胞裂解液上清经Ni柱层析,表明浓度为500mmol/L咪唑洗脱缓冲液时获得较高浓度和纯度的纯化蛋白。进一步抑菌活性分析表明表达产物对黄瓜灰霉病病原菌检测平板上显示出较好的抑菌活性。本研究结果将为今后深入研究TasA抑菌蛋白基因以及抗病转基因工程提供了参考。     

真核双顺反子表达载体pcDNA3.1AB的构建与表达

为了构建由双CMV启动子调控的真核双顺反子表达载体pcDNA3.1AB,首先在pcDNA3.1(+)的基础上,构建出pcDNA3.1A和pcDNA3.1B,通过PCR扩增pcDNA3.1A上含-PCMV-MCS-BGHpolyA-表达单元的片段,定向克隆入pcDNA3.1B,即得载体pcDNA3.1AB。将DsRed与EGFP基因插入pcDNA3.1AB,分别构建pcDNA-DsRed、pcDNA-EGFP和pcDNA-DsRed-EGFP。质粒转染COS-7细胞瞬时表达,用荧光显微镜进行检测。结果双价质粒pcDNA-DsRed-EGFP能同时表达红色和绿色荧光蛋白基因,两基因表达强度无显著差异,且双价与单价质粒相比荧光蛋白表达强度相当。双顺反子表达载体pcDNA3.1AB的成功构建和表达,为进行基因表达及双价核酸疫苗的研究奠定了基础。     

解淀粉芽孢杆菌NS2降解玉米赤霉烯酮的研究

为了丰富玉米赤霉烯酮(ZEN)解毒菌种库,通过采集湖南省邵阳市等7个省市粮食样品,筛选获得1株能够高效降解ZEN的解淀粉芽孢杆菌NS2。采用高效液相色谱法检测降解前后ZEN的含量发现,液态发酵72 h,该菌对5 mg·L^-1 ZEN标准品的降解率高达96.0%,固态发酵72 h,菌株对玉米粉中2.5 mg·L^-1 ZEN标准品的降解率高达88.2%。采用高效液相色谱与四级杆飞行时间质谱联用技术检测该菌处理后的ZEN降解产物,未检测出具有毒性作用的α-玉米赤霉烯醇(α-ZOL)、β-玉米赤霉烯醇(β-ZOL)等ZEN的类似物。此外,抗菌活性试验与木聚糖酶、纤维素酶和蛋白酶活性试验显示降解菌NS2还能通过产生具有抗菌作用的次生代谢产物,抑制病原微生物大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的生长。上述结果表明,解淀粉芽孢杆菌NS2可以高效降解ZEN,具有潜在应用前景,为ZEN解毒产品的开发与应用奠定了材料基础。     

两株芽孢杆菌对茶用菊红心菊生长和品质的影响

为探讨从不同品种菊花根际土壤中分离的两株芽孢杆菌对茶用菊生长和品质的影响,以茶用菊红心菊为试验材料,研究对照(CK)、接种解淀粉芽孢杆菌处理(Ba)、接种枯草芽孢杆菌处理(Bs)、接种解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌混合处理(Ba+Bs)对茶用菊红心菊各生育期生理指标的影响。结果表明,苗期菌剂对各生理指标的促生效果显著高于生长期和花期;花期时,菌剂接种处理均不同程度地促进了茶用菊红心菊收获时品质和产量的提高,其中绿原酸、木犀草苷、3,5-二咖啡酰基奎宁酸含量与CK相比平均提高20%左右,且三组接种菌剂处理之间无显著差异,而Ba+Bs处理后红心菊的黄酮含量最高,比CK提高15.64%,同时该处理红心菊的估产量也最高,比CK、Ba和Bs分别提高了152.00%、64.12%和33.61%。综上所述,在茶用菊苗期栽培土壤中混合接种解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌(Ba+Bs)可以显著提高红心菊外观品质、花期产量以及茶用品质。本研究结果为今后茶用菊功能微生物有机肥研发奠定了良好的基础。