欧文氏杆菌变异菌株木聚糖酶纯化及其酶学性质

从现有309份菌种资源中筛选出木聚糖酶高产菌株(Erwinia),发酵液酶活达到408 U.采用超滤和凝胶层析法从发酵液中分离纯化出电泳纯木聚糖酶,回收率高达69.17%,比活达到28453.6U/mg.酶学性质研究结果显示,采用SDS-PAGE和凝胶层析测得分子量分别为22.54和21.89 kD;IEF-PAGE测得等电点为9.63;以燕麦木聚精为底物时,K_m和V_(max)分别为0.5mg/mL和533 U;最适作用pH 5.8,稳定pH 3.4～6.4;最适作用温度60℃,在pH 5.8条件下稳定温度0～65℃;Fe~(2+)和Co~(2+)有激活作用,Cu~(2+)有强烈抑制作用.用ESI-MS/MS法分析,该菌株分泌的木聚糖酶氨基酸序列与GenBank上登录的木聚糖酶基因表达的氨基酸序列一致.     

源于厌氧真菌Orpinomyces sp.PC-2的xynA在毕赤酵母中的高效表达及其酶学性质分析

β-D-1,4-内切木聚糖酶(endo-1,4-β-D-xylanase,xynA,EC.3.2.1.8)简称β-木聚糖酶(β-xylanase),是木聚糖降解酶系中最重要的成员,广泛用于饲料、食品、造纸和生物能源等领域.厌氧真菌Orpinomyces sp.PC-2 xynA具有潜在的开发价值,但是其异源表达的活性较低.本研究根据毕赤酵母(Pichia pastoris)对基因密码子偏好性,对厌氧真菌Orpinomyces sp.PC-2的xynA进行密码子优化.通过全基因合成技术合成优化后的xynAm,并克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K的多克隆位点,构建重组质粒pPIC9K-xynAm,电击转化至毕赤酵母GS115菌株中,以29℃、0.5％甲醇诱导表达,获得重组xynA,并对该酶的酶学特性进行了研究.结果表明,在摇瓶水平条件下,诱导表达108 h时重组β-木聚糖酶活性达到最大值,为612 IU/mL.在10L发酵罐中诱导表达96 h后,xynA的活性为3 515 IU/mL,比活性为2 411 IU/mg;菌体培养湿重、干重和培养上清总蛋白质的浓度分别为324、156和2.25 g/L.非变性十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(sodiumdodecyl sulfate-polyacrylamide gel electropheresis,SDS-PAGE)凝胶电泳显示,重组木聚糖酶的分子量约为42.7 kD.酶学性质分析表明,重组β-木聚糖酶的最适反应温度为55℃,最适反应pH 6.0,在温度为30～50℃、pH 4.0～10.6之间该酶具有较好的稳定性,其Km=27.86 mg/mL,Vmax=277.78 mg/(mL· min).底物特异性分析表明,重组xynA可水解低粘度阿拉伯木聚糖、高粘度阿拉伯木聚糖、燕麦木聚糖、桦木木聚糖和4-O-甲基-D-葡萄糖醛酸-D-木聚糖,但不降解大麦(Hordeum vulgare)β-葡聚糖和地衣多糖.10 mmol/L的Co2+和K+对该酶的活性略有激活作用,Mn2+、Fe2+和SDS对该酶活性有一定的抑制作用.本研究为进一步工业化应用来源于厌氧真菌Orpinomyces sp.PC-2的β-内切木聚糖酶奠定了基础.     

橄榄绿链霉菌A1所产43kD木聚糖酶XYNA的纯化及其酶学性质

橄榄绿链霉菌A1(Streptomyces olivaceoviridisA1)所产木聚糖酶XYNA经阴离子交换层析和分子筛层析分离,得到纯化的XYNA.XYNA的分子量约为43 kD.其最适温度为60℃,最适pH5.6.XYNA在55℃下以4-O-Me-D-glucurono-D-xylan的Km值和Vmax分别是332 g/kg和15.72μmol/(mL@min).SDS、EDTA对XYNA有轻微的抑制作用.XYNA无纤维素酶活性.胃蛋白酶、胰蛋白酶处理30 min,对酶活性无影响.XYNA成熟蛋白N端10个氨基酸序列为Ala-G1u-Ser-Thr-Leu-Gly-Ala-A1a-Ala-Ala.     

一株曲霉的一种中温糖化酶的纯化及其部分酶学特性

本研究从广西花坪自然保护区采集的土壤中筛选获得了一株产糖化酶丝状真菌菌株57-45,通过形态学观察和真菌内转录间隔区（internal transcribed spacer,ITS）序列比对分析,将其初步鉴定为曲霉属（Aspergillus sp.）的一个种。纯化真菌57-45所产的一种胞外糖化酶经过硫酸铵分级沉淀、疏水层析和阴离子交换层析三步蛋白质纯化步骤,得到在SDS-PAGE上约60kD的单一蛋白质条带,薄层层析分析表明该纯化的蛋白质水解可溶性淀粉的产物只有葡萄糖,证明该纯化的蛋白质为糖化酶。纯化的糖化酶Km值为1.9mg/mL,Vmax为4148μmol/（min·mg）,最适作用pH5.5,最适作用温度50℃,在同步糖化发酵中有应用的潜力。金属离子Fe3＋、Zn2＋、Cu2＋对酶活有较强的抑制作用,EDTA对酶活有较强的促进作用。本文结果将为进一步研究曲霉糖化酶的酶学特性提供新的材料。     

黑曲霉固体发酵产木聚糖酶的响应面优化设计及其酶学性质的研究

本研究采用响应面法的中心组合对影响黑曲霉(aspergillus niger JL 15)固体发酵产木聚糖酶的条件进行了优化.以橘皮粉为基质,补充碳源、氮源,以及含水量和发酵时间对木聚糖酶产量具有显著影响(P<0.05).模拟二次多项式回归预测模型,并建立自变量与响应值的回归方程,获得各因素的最佳水平,即:甘油、硫酸铵的添加量分别为4.2%和3.1%,含水量为61%,发酵时间为73.4 h,木聚糖酶活性最大预测值达922.9 U/g干发酵产物,验证值为917.7 U/g干发酵产物,高出基础培养基酶活3.2倍.酶学性质分析研究表明,黑曲霉木聚糖酶(XylA)的最适温度和最适pH分别为55oC和pH 5.0.XylA的K_m和V_(max)值分别为9.24 mg/mL和54.05 μmol/min/mL.Mn~(2+)、Zn~(2+)和斗和Mg~(2+)对XylA活性具有促进作用,而Fe~(3+)和cu~(2+)对XylA活性具有明显抑制作用.HPLC分析结果表明,XylA的水解桦木木聚糖和麸皮不溶性木聚糖的产物均为木糖至木六糖,主要产物为木三糖.     

木霉β—1，3—1，4—葡聚糖酶性质及其cDNA片段克隆

本研究探讨了里氏木霉GXC的-1,3-1,4-葡聚糖酶特性，克隆和分析了酶基因片段。结果表明，粗酶液经硫酸铵沉淀、SephadexG-25、SephadexG-100和DEAE-SephadexA-50柱层析得到纯-1,3-1,4-葡聚糖酶；经12.5%SDS-PAGE凝胶电泳表明，该酶的分子量为35.21kD；酶最适反应pH5.0，最适反应温度为60℃；Michaelis-Menten动力学分析表明，-1,3-1,4-葡聚糖酶的Km和Vmax分别为10.86mg/mL和14286mol/(minmg)。通过RT-PCR方法扩增并克隆了-1,3-1,4-葡聚糖酶cDNA片段，测序表明,该片段长度为280bp；同源性分析显示，该cDNA片段与水解淀粉芽孢杆菌、厌氧真菌OrpinomycesstrainPC-2、枯草芽孢杆菌中的-1,3-1,4-葡聚糖酶的基因片段有较高的同源性，分别为90%，79%，91%。     

绿色木霉葡聚糖内切酶Ⅰ基因的定点突变及酶学性质的研究

将绿色木霉葡聚糖内切酶EGⅠ基因eg1亚克隆到表达载体pSE380,构建出重组质粒pSE380-eg1,转化到大肠杆菌JM109中表达,利用金属亲和层析对EGI进行纯化,纯化后的酶比活力达到3.8U/mg,其最适反应温度为48℃,最适pH为5.2。同时对EGⅠ的氨基酸残基G291位进行随机定点突变,筛选到一株突变酶G291S,其比活力为野生酶的2.2倍,Km值为野生酶的0.66倍,最适反应温度和最适反应pH值未发生改变。     

重组甘蔗1-氨基环丙烷-1-羧基(ACC)氧化酶的纯化及其特性

在IPTG诱导下,重组甘蔗(Sacharum sinensis)1-氨基环丙烷-1-羧基(ACC)氧化酶在体外以包涵体蛋白形式表达。包涵体蛋白经Ni2+-NTA金属螯合层析柱纯化和复性后,获得酶活力高达132.58 nmolC2H4/ mg/h 蛋白。该蛋白在pH 5.5 ~ 8.0 和20 ~ 45 ℃温度范围内比较稳定,最适pH 6.7,最适温度33 ℃;米氏常数(Km )61.77 μmol/L,酶动力学参数（Vm）值0.9647 μmol/min,被一定浓度的CO2和底物ACC所激活,受Mg2+、Cu2+、Zn2+和EDTA抑制。     

普鲁兰酶氮端氨基酸的截短对其酶学性质的影响

淀粉是丰富的生物质资源,已被广泛地应用到食品、酿酒、医药等各个相关的领域.普鲁兰酶(pullulanase,pulA,EC 3.2.1.41)作为淀粉脱支酶,可以水解淀粉中的α-1,6糖苷键,最大限度地降解淀粉原料,提高淀粉利用率.因此,寻找一条国产化的道路开发我国自己的普鲁兰酶,具有长远的意义.课题组前期从淀粉厂附近的土壤中筛到一株普鲁兰酶的高产菌株变栖克雷伯氏菌(Klebiella variicola)strain 7,克隆获得pulA基因(GenBank登录号:KJ146839.1)后在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)中异源表达.为提高该蛋白的表达量和分泌效率,同时改善普鲁兰酶的性质,本研究利用基因工程的手段构建了普鲁兰酶去信号肽突变体M1和氮端31个氨基酸的截短突变体M2,结果显示M1和M2最适温度均为45 ℃,二者的最适pH分别是6.0和5.6;M2的半衰期是37 min,是M1的6.17倍;M2的比酶活是582.204U/mg,是M1的1.6倍.动力学分析显示,以普鲁兰糖为底物时,M2的Vmax、Kcat、Km和Kcat/Km分别为0.001 3μmoL/(mL·s)-1、191.80-1 s.-1、0.30 mg/mL、693.30,与M1相比,M2的底物亲和能力增加,同时催化效率是M1的2倍.本研究通过普鲁兰酶氮端氨基酸的截短,为提高酶的比酶活和半衰期提供了新的方法和思路.     

环状芽孢杆菌乳糖酶基因在大肠杆菌中的表达及酶学性质分析

摘要: 将环状芽孢杆菌(Bacillus circulans )中的乳糖酶基因在大肠杆菌(Escherichia coli )中进行了高效表达, 并测定了表达的乳糖酶的基本酶学性质。结果表明, 表达的乳糖酶有生物学活性, 但与来源于环状芽孢杆菌的原始酶相比, 其酶促反应的最适pH、最适温度、Km值, 以及酶的pH稳定性和温度稳定性等酶学性质均有较大变化。表达的乳糖酶最适pH为5.0, 低于原始酶的pH 6.5; 最适温度为37 ℃, 而原始酶为55 ℃; 其耐酸性、耐热性及对金属离子的抗性等方面比原酶有所提高; 而且表达的乳糖酶Km比原始酶小285倍、Vmax比原始酶大5.4倍，表明经大肠杆菌表达的乳糖酶有较高的底物亲和力，酶促反应效率更高。从乳糖酶的单位表达量来看, 原始酶在环状芽孢杆菌的表达量为20.98 U/mL，而在大肠杆菌中的表达量提高到33.102 U/mL。     

重组多功能木聚糖酶酶解条件的优化

重组多功能木聚糖酶(recombinant multi-functional xylanase,RMFXase)是以草菇为表达载体,具有多种酶活力的新型酶。为揭示该酶与底物的作用规律,同时为转基因酶的应用提供基础数据,该文利用重组多功能木聚糖酶水解南方特色的甘蔗加工废弃物生产低聚木糖,通过响应面法建立以重组多功能木聚糖酶质量浓度、底物质量浓度和酶解时间为控制因素的反应动力学方程组,从而推导得到酶解最佳工艺参数。试验并通过高效液相色谱法法,监测反应过程中产物的动态变化,分析产物的生成规律。结果表明,通过响应面法推导出符合连续式酶解反应器的最佳酶解工艺参数为:加酶量900 U/mL、底物质量浓度110 mg/mL、反应时间80 min。该条件下酶解木聚糖含量为54.7%的蔗渣半纤维素,得到的低聚木糖DP值达到3,酶解率达到23.94%。酶解过程中重组多功能木聚糖酶表现出高内切-β-1,4-木聚糖活力,优先降解大分子木聚糖,后期产物主要以木二糖和木三糖为主,且底物纯度越高,底物利用率越高。     

灰葡萄孢霉角质酶粗提液酶学特性研究

为探究灰葡萄孢霉角质酶的酶学性质以及角质酶对植物角质层的降解作用,以灰葡萄孢霉为材料,采用角质诱导的方法得到角质酶发酵液,上清液经过分离得到角质酶粗提液,采用分光光度法探究温度、pH值、金属离子及有机溶剂对角质酶活力的影响,并通过扫描电镜探究角质酶粗提液对葡萄角质层的作用。结果表明,灰葡萄孢霉角质酶的最适反应温度为35℃,最适反应pH值为7.5,此条件下能够保持较高的热稳定性;Na⁺、Mg²⁺、Ca²⁺对酶活有促进作用,而Zn²⁺、Cu²⁺、Fe³⁺对酶活有抑制作用;甲醇、丙酮、异丙醇对酶活具有促进作用,乙醇、乙腈和三氯甲烷对酶活具有抑制作用;角质酶粗酶液对葡萄角质层具有明显的降解作用。本研究结果为果蔬采后病害的控制提供了理论依据。     

疏绵状嗜热丝孢菌糖化酶基因（gla）的克隆及在毕赤酵母中的表达

本研究以疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces laltltginosus)cDNA为模板,克隆了糖化酶基因(gla),序列分析表明gla的开放阅读框由1854个核苷酸组成,编码617个氨基酸.根据氨基酸序列推算该酶的分子量为64 kD,属于糖苷水解酶第15家族,具有该家族催化保守区的典型特征.PCR扩增gla的成熟蛋白编码基因,构建表达载体,经线性化后电击转化导入巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris GS115),并成功进行了表达.重组酶经摇瓶发酵后酶活可达11.6 U/mL,经硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换等步骤纯化了该重组蛋白,SDS-PAGE显示该重组蛋白大小约为67kD,比推测的蛋白分子量稍大,可能与该蛋白的糖基化有关.该重组酶的最适反应温度和最适pH值分别为60℃和5.0,该酶具有较高的热稳定性,70℃保温20 min后剩余酶活为54%.     

黑曲霉木聚糖酶基因xynB在大肠杆菌中的表达及重组木聚糖酶的特性

从黑曲霉(Aspergillus niger) mafic-005中克隆得到木聚糖酶基因xynB。序列分析表明，该基因全长745 bp，含有一个67 bp内含子，编码225个氨基酸，理论分子量为24 kD(GenBank登录号:DQ174549)，与已知黑曲霉xynB基因的同源性均较高。将该基因定向插入大肠杆菌(Escherichia coli )表达载体pET-28a (+)上，并转化E. coli BL21 获得重组菌株。经过IPTG诱导，xynB基因获得特异性表达。经SDS-PAGE分析，重组蛋白分子量约为30 kD。该重组蛋白经镍NTA琼脂糖凝胶FF纯化后达到电泳纯。酶学性质分析表明，重组木聚糖酶最适温度为40 ℃，最适pH值为5.0，在酸性和常温条件下具有良好的稳定性。     

宇佐美曲霉木聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达

在已知宇佐美曲霉E001菌株木聚糖酶Xyn II cDNA序列（Genbank登录号为DQ114485）的基础上，合成1对引物（含 EcoR I和Sal I酶切位点），以重组质粒pUCm-T-xyn II为模板，扩增得到编码Xyn II成熟肽的cDNA片段（555 bp）。将其与表达质粒pET-28a连接，构建了重组表达质粒pET-28a-xyn II，转化E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL，获得重组工程菌B21/xyn II。经IPTG诱导表达，木聚糖酶的比酶活力最高可达35.6 U/mg。最后采用金属Ni2+螯和层析柱对所表达的木聚糖酶进行纯化，达到了电泳纯。重组表达的木聚糖酶最适温度为45℃，最适pH值为4.6。     

醋酸棉酚对土壤脲酶动力学特性的影响

通过不同浓度醋酸棉酚存在下的土壤脲酶催化尿素水解试验,研究醋酸棉酚对土壤脲酶的抑制作用,得到酶促反应的降解动力学参数和有关的热力学参数.结果表明,醋酸棉酚对土壤脲酶活性的抑制能力随醋酸棉酚浓度的增大而增强.由尿素浓度的倒数和水解速率的倒数为横纵标的双倒数曲线得到米氏常数(Km)和最大速率(Vmax),随着醋酸棉酚浓度的增大,酶促反应的Km和Vmax降低.在温度30℃时,Km由3.918 mol/L降到1.164 mol/L,Vmax由1.185×10-4 mol/(g·h)降到5.6×10-6 mol/(g·h).在醋酸棉酚的影响下,酶促反应的热力学参数包括活化能(Ea)、活化焓变(△H)和温度系数(Q10)有所下降.     

内生解淀粉芽胞杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bglS)的克隆与表达及酶学特性分析

β-1,3-1,4-内切葡聚糖酶普遍存在于植物内生芽胞杆菌中,为了探讨其功能,以内生解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)TB2菌株基因组为模板,克隆了β-1,3-1,4-内切葡聚糖酶基因(bglS).测序结果表明,该基因的ORF全长732 bp,编码一条243个氨基酸的蛋白,理论分子量约为27.33 kD,等电点约为6.89,其ORF序列已登录GenBank(Accession No.EU368224).Blast同源性分析结果表明,该基因的ORF序列与植物互作生防解淀粉芽胞杆菌(B.amyloliquefaciens FZB42,GenBank Accession No.CP000560)的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因核苷酸序列的一致性达97.3%,氨基酸序列的一致性达97.1%.将β-1,3-1,4-内切葡聚糖酶基因全长克隆至pUC18载体上,利用基因自身的启动子构建重组表达载体pUC-bglS,并导入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21菌株中表达.SDS-PAGE分析表明,BL21::pUC-bglS菌株表达了27 kD左右的蛋白;该酶的最适反应温度为55℃,在50℃以下保温60 min后残余80%以上酶活;最适反应pH为6.2,在pH4.4～6.8 4℃保温30 min残余85%以上的酶活;Ca2+和Fe肛可提高β-1,3-1,4-葡聚糖酶的活性,而Cu2+、Zn2+、Mg2+和Mn2+对其活性具有显著的抑制作用.实验结果为进一步研究植物内生解淀粉芽胞杆菌TB2 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的功能和应用打下了基础.     

苦荞苯丙氨酸解氨酶基因(FtPAL)的原核表达及其逆向催化酶学性质分析

苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)是植物中广泛存在的苯丙烷代谢途径的第一个关键酶,在生物化工领域可利用其逆向催化性质生产L-苯丙氨酸(L-Phe),而筛选活力高和稳定性好的PAL酶源是提高L-Phe产量的重要途径。本研究以苦荞(Fagopyrum tataricum)苯丙氨酸解氨酶基因(FtPAL)为材料,构建其原核表达融合载体pET-30b(+)-FtPAL,并转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中诱导表达,表达产物纯化后分析其逆向催化的酶学性质。结果FtPAL基因获得了有活性的表达,正向催化比活力在第5小时最高达24.17 U/mg,纯化后正向和逆向催化比活力分别为158.74 U/mg和194.11U/mg,薄层层析也证明,FtPAL可逆向催化肉桂酸氨化为L-Phe。酶学性质分析表明,FtPAL逆向催化的最适温度为30℃,热不稳定,最适反应pH为10,此时有较好的稳定性,除Mg2+对其具有激活作用外(P0.01),其它金属离子(Na+、Mn2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+和Ca2+)均具有抑制作用(P0.05或P0.01),Hg2+则可使该酶完全失活。本研究明确了该酶具有合成L-Phe的性质,也为对进一步采用基因工程手段提高其催化能力和稳定性提供了基础资料。     

小麦种子过氧化物酶的纯化及其部分酶学性质研究

小麦全面粉水抽提液经醋酸酸沉淀,上清再经硫酸铵35%-75%分组沉淀,沉淀溶于pH5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液,经FPLC-SOURCE 30S 阳离子交换层析,FPLC-Superdex G-75凝胶过滤层析,纯化了小麦种子过氧化物酶（Wheat Seed Peroxidase）,纯化酶的比活力为3912U／mg。在SDS-PAGE上显示出一条蛋白带,其分子量约为37 KD。光谱分析显示,在399nm处有一典型的Soret带,在495nm和636nm处有特征吸收,酶反应的最适pH在5.0左右,最适双氧水浓度为13mM/L,最适温度在40℃左右,有较好的耐热能力。     

三七根际链霉菌Streptomyces sp. YNUCC0233木聚糖酶性质研究

从三七根际分离到一株产木聚糖酶链霉菌Streptomycessp.YNUCC0233。该菌所产生的木聚糖酶的最适反应温度为67℃,最适pH为6.0,在pH5.0~9.0和60℃以下时相对稳定。Ba2+和K+对该木聚糖酶有较强的促进作用,Hg2+、Cu2+、Mn2+、Co2+、Ni2+和EDTA对该酶有较强的抑制作用。对Streptomycessp.YNUCC023316SrDNA的1105bp片段的序列分析结果表明,Streptomycessp.YNUCC0233的16SrDNA片段与GenBank中所有已注册的链霉菌分类单位均不同。