亚洲棉中与棕色素合成相关基因GaTT12a的克隆及表达特征

棕色棉具有典型的自然棕色纤维,在纺织及加工过程中无需漂染,是真正的“生态”、“环保”棉.克隆并了解棉花纤维棕色素合成相关基因对于揭示棉花纤维色素发育的分子机理具有重要的意义.本研究选取亚洲棉(Gossypium arboreum)棕色纤维慈溪紫棉和白棉余姚中棉纤维发育不同阶段RNA,采用Gene Fishing技术,获得1条仅在亚洲棉棕色棉纤维中特异表达的约500bp的PCR扩增产物,根据测序结果和生物信息学分析发现,该基因在核苷酸序列上与拟南芥(Arab idopsis thaliana)种皮棕色素合成TT12基因存在76％的序列同源性.随后利用RT-PCR的方法克隆了该基因,命名为GaTT12a(GenBank登录号:JX013908),该基因编码490个氨基酸残基,分子量约52.7 kD,属于MATE超基因家族中的一个成员.利用荧光定量PCR分析了GaTT12a基因在发育不同阶段纤维、种皮的表达特征,结果表明,GaTT12a基因在棕色纤维、白色棉种皮和棕色棉种皮中均优势表达,在白色棉纤维中几乎不表达,说明该基因参与纤维棕色素的形成,结果暗示棉花种皮棕色素和纤维棕色素可能分享相似的合成代谢途径.研究结果为进一步了解GaTT12a基因参与棕色棉纤维色素形成、棕色棉纤维色素与种皮棕色素合成之间的关系提供了基础研究资料.     

棕色棉GhANS基因的克隆与表达分析

本研究以15DPA棕色棉及其白色近等基因系为材料,蛋白质双向凝胶电泳结合质谱分析,鉴定出其中一个差异表达的蛋白为花色素合成酶(ANS)。以15DPA棕色棉纤维细胞cDNA为模板,电子克隆获得了编码该蛋白基因的全长cDNA序列,序列分析发现,该基因的开放阅读框为1062 bp,编码354个氨基酸,属于花色素还原酶2-酮戊二酸加氧酶亚家族,将该基因命名为GhANS。构建GhANS基因GFP融合植物表达载体转化烟草,荧光共聚焦显微镜观察发现GhANS基因定位于烟草细胞质内。实时荧光定量PCR分析表明,GhANS基因在棉花中组成型表达,该基因在纤维细胞发育的各个时期在棕色棉中表达量均高于其白色近等基因系,推测GhANS基因在棕色棉纤维色素合成过程中起重要作用。     

海岛棉GbTCP10基因的克隆与表达分析

为阐明海岛棉GbTCP10基因在棉纤维发育过程中的功能,以海岛棉品种新海21号为试验材料,克隆获得海岛棉GbTCP10基因,并利用酵母单杂交体系进行转录激活活性分析以及利用实时荧光定量PCR分析GbTCP10在棉花纤维不同时期的表达模式。结果表明,GbTCP10编码的蛋白与其他植物中的TCP蛋白具有较高的一致性;GbTCP10基因在开花后5 d纤维中表达量最高;GbTCP10不具有转录激活活性,推测GbTCP10可能参与棉花纤维的发育,是1个转录抑制子,本研究为了解棉花纤维发育机制提供了依据。     

棉花GhMYB146基因克隆及亚细胞定位分析

MYB转录因子是发育、代谢、生物和非生物胁迫应答调控网络中的关键因子。为了分析棉花Gh MYB146转录因子的亚细胞定位,通过RT-PCR和RACE方法从棉花纤维中克隆了1个棉花MYB转录因子Gh MYB146的c DNA序列,采用生物信息学方法分析了Gh MYB146的氨基酸序列,构建了Gh MYB146基因的亚细胞定位载体并进行了亚细胞定位分析。结果表明,克隆的R2R3-MYB基因Gh MYB146的c DNA全长1 027 bp,开放阅读框长879 bp,编码292个氨基酸,蛋白质预测分子量约为33.151 k D,等电点为7.9;推测的氨基酸序列中含有2个高度保守的SANT结构域;Gh MYB146基因组包含3个外显子和2个内含子。进化树分析表明,Gh MYB146和Gh MYB5分为一个分支;亚细胞定位结果表明,Gh MYB146:GFP融合蛋白定位于细胞核中。本试验结果为进一步研究Gh MYB146基因的生物学功能奠定了基础。     

棉花纤维起始期基因表达的cDNA-AFLP分析

摘要：利用cDNA-AFLP差异显示技术比较了棉花(Gossypium hirsutum L.)品系徐州142及其无纤维突变体的胚珠在纤维起始期（开花后0和4 d）的基因表达，结果表明，在总共显示的561条带中两种胚珠各有特异带83条。将正常有纤维胚珠的差异片段47个进行反向 Northern blot检验，32个在有纤维胚珠中特异表达。选取18个在有纤维胚珠中特异表达的片段进行序列分析，结果表明，8个分别与polyphosphoinositide结合蛋白、细胞色素氧化酶亚基Ⅱ、β-葡萄糖苷酶、蔗糖合成酶、Ca2+通道蛋白、水稻高渗反应蛋白osr40、类TSO1蛋白序列有相似性；4个与拟南芥(Arabidopsis thiliana )的假拟蛋白相似；另有6个找不到相似序列。     

棉花早期光诱导蛋白基因GhELIP1序列及表达分析

植物早期光诱导蛋白(ELIP)参与到植物逆境胁迫响应和果实成熟过程中。对棉花Gh ELIP1基因进行了研究分析,发现该基因全长582 bp,编码193个氨基酸,属于叶绿素a/b结合蛋白超家族。系统发育关系分析表明,Gh ELIP1蛋白与棉花中的其他4个ELIP蛋白亲缘关系最近,其次是可可。表达分析表明,Gh ELIP1基因在衰老叶片中的表达量最高,表明Gh ELIP1基因参与棉花叶片的衰老调控。该研究结果可为在棉花中进一步阐明Gh ELIP1基因的功能奠定基础,为棉花生物技术和分子育种提供优异的基因资源。     

棉花甲基化酶基因COMT和CCoAOMT的组织特异性表达分析

本研究利用半定量RT-PCR分析方法探索了陆地棉(Gossypium hirsutum L.)木质素合成途径中甲基化酶基因家族COMT和CCoAOMT在不同组织和不同发育时期纤维中的表达情况。结果表明COMT1,COMT2,COMT3和CCoAOMT1,CCoAOMT2在棉花的7个组织器官(根、茎、叶、子叶、花瓣、雄蕊、胚珠)中都有表达,其中COMT1和CCoAOMT1在各组织中的表达趋势类似,COMT2,COMT3和CCoAOMT2表达趋势各异。在5～25d的棉纤维发育过程中,COMT1和COMT3表达稳定,COMT2表达量逐渐增加。而CCoAOMT基因家族的2个基因的表达量变化相对明显,CCoAOMT1在25d出现表达高峰,CCoAOMT2则在10d和15d呈现高表达量。本研究表明甲基化酶基因家族COMT和CCoAOMT在棉花的根,茎等维管组织中具有相对一致的高表达量,而在其他组织和发育纤维中则呈现出明显的组织特异性和纤维发育时期特异性。     

花粉管通道法导入标记DNA在棉花胚珠内的分布

通过花粉管通道法将[α3-2P]dATP标记的DNA导入科棉1号,测量标记DNA在胚珠内的放射性活度并进行放射性自显影观察,以求获得陆地棉导入外源DNA的最佳时期和外源DNA在胚珠内的分布情况。结果表明,导入的外源DNA能进入到胚珠中;棉花授粉33h时通过滴涂和注射法导入标记DNA在胚珠内的放射性活度测量值均较高;而滴涂法的放射性活度明显低于注射法;胚珠内银粒的分布较明显,标记外源DNA的胚珠内银粒远多于对照。     

Ghppo1基因在棉花防御中的表达及功能分析

诱导型抗性在植物防御植食性昆虫过程中起到重要作用,植物可通过基因和信号通路调控植物与害虫之间的互作。本研究以转Bt+Cp TI(苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)+豇豆胰蛋白酶抑制剂(cowpea trypsin inhibitor))基因的抗虫棉品种中棉所41为材料,使用定量PCR分别测定棉铃虫(Helicoverpa armigera)危害、喷施茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,Me-JA)和水杨酸甲酯(methyl salicylate,Me-SA)等处理0、6、12、18和24h后,棉花Ghppo1(Gossypium hirsutum polyphenol oxidases 1)基因、茉莉酸途径关键基因Gh AOS(Gossypium hirsutum allene oxide synthase)、Gh COI1(Gossypium hirsutum coronatine insensitive1)表达量变化。交互取食试验测定1龄棉铃虫诱导及茉莉酸甲酯诱导18 h后棉花饲喂3龄棉铃虫与甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)虫重变化。以了解棉花Ghppo1基因在棉花诱导型抗性及棉花-棉铃虫互作关系中的作用。结果表明,1龄棉铃虫取食以及喷施Me-JA能够诱导棉花Ghppo1基因表达量显著升高,而3龄棉铃虫取食及喷施Me-SA不能诱导棉花Ghppo1基因表达量升高。此外棉花多酚氧化酶(polyphenol oxidases,PPOs)同样受1龄棉铃虫取食和茉莉酸甲酯诱导,而不受3龄棉铃虫和水杨酸甲酯诱导。1龄棉铃虫取食能够诱导茉莉酸途径关键基因Gh AOS和Gh COI1表达量显著上升。交互取食试验结果表明1龄棉铃虫诱导后的棉花植株能够抑制3龄棉铃虫及甜菜夜蛾的生长发育。棉花Ghppo1基因受茉莉酸途径而不受水杨酸途径调控,棉花Ghppo1基因参与棉花对棉铃虫的诱导型抗性反应。本实验结果表明,1龄棉铃虫可明显提高棉花对棉铃虫及甜菜夜蛾的抗性,棉花Ghppo1基因在棉花对棉铃虫与甜菜夜蛾抗性中发挥重要作用。     

外源NO对铜胁迫下番茄植物螯合肽及精氨酸代谢的影响

一氧化氮(NO)作为生物活性分子,广泛参与各种生物、非生物胁迫。采用营养液培养,研究铜胁迫下外源NO对番茄体内植物螯合肽及精氨酸代谢的影响。结果表明,与CK相比,铜胁迫可以显著激活番茄体内γ-ECS、GS活性,根系GSH、PCs含量急剧升高,且随着处理时间的延长,γ-ECS、GS酶活性、GSH、PCs含量呈持续上升趋势;同时促进植物体内精氨酸代谢增加多胺合成。添加外源SNP,进一步提高铜胁迫下番茄根系γ-ECS、GS活性,促进GSH、PCs的合成,促进番茄多胺的合成。铜胁迫下,外源NO可能启动了某些信号机制,并通过激活或增强某些酶促和非酶促系统,降低过多Cu2+的生物毒性和氧化伤害。     

外源Bt基因导入对棉花叶片维管束汁液的生化物质含量及烟粉虱种群增殖的影响

以转Bt基因棉花"国抗22"和常规棉亲本"泗棉3号"为试材,研究外源Bt基因导入对棉花叶片维管束汁液中营养物质和次生物质含量以及烟粉虱种群增殖的影响.结果表明,和"泗棉3号"相比,"国抗22"叶片维管束汁液中可溶性糖含量较低;单宁浓度苗期较低,但花铃期两个品种无明显差异;花铃期游离氨基酸总量无明显差异,但谷氨酸、脯氨酸、丙氨酸含量均明显高于"泗棉3号";在苗期和花铃期两品种棉花叶片维管束汁液中均未检测到棉酚.取食苗期和花铃期"国抗22"棉花的B型烟粉虱内禀增长率rm分别比取食"泗棉3号"对应生育期的高13.7%和20.2%.研究表明,外源Bt基因的导入影响转基因棉花中可溶性糖、游离氨基酸和其他抗生物质的合成,从而影响烟粉虱的种群发展.     

棉花莽草酸/奎宁酸羟基肉桂酰转移酶基因(GhHCT)的克隆、生物信息学分析及表达特性

莽草酸/奎宁酸羟基肉桂酰转移酶(shikimate/quinate hydroxycinnamoyl transferase,HCT)是木质素生物合成途径中影响木质素G/S-单体生物合成的关键酶之一,棉纤维中木质素含量与纤维品质密切相关。本研究以开花后16 d(16 DPA)的棕色棉(Gossypium hirsutum L.)品种新彩棉6号纤维为材料,克隆了1个木质素代谢相关HCT类似基因,命名为GhHCT(GenBank登录号:KF749428)。并通过实时荧光定量PCR技术检测了该基因在棉花不同器官及组织中的相对表达量。序列分析结果表明,该基因的开放读框(open reading frame,ORF)为1 500 bp,编码499个氨基酸。生物信息学分析显示,推定的GhHCT蛋白质相对分子质量为55.2 kD,等电点为5.69。该蛋白氨基酸序列同其他物种HCT蛋白显示出很高同源性(82%～95%)。GhHCT氨基酸序列包含一个HHAAD酰基转移酶功能结构域以及一个BAHD酰基转移酶基因家族的DFGWG区。系统进化树分析显示,GhHCT与槿麻(Hibiscus cannabinus)HcHCT基因有最近的亲缘关系(94.9%)。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测结果显示,GhHCT在新彩棉6号不同组织中都有表达,但在16 DPA的胚珠中表达最高,其次在花和茎中也有较高表达,在叶片中的表达量最低。本研究为进一步研究GhHCT基因的生物学功能及棉纤维中木质素生物合成代谢的作用机制研究提供前期基础资料,同时也为利用基因工程技术对天然彩色棉纤维品质进行遗传改良提供一定的线索及理论依据。     

甘肃不同色彩陆地棉抗旱指标筛选及评价研究

在甘肃省敦煌棉区高密度覆膜栽培模式下,以不同基因型的白色纤维、棕色纤维和绿色纤维10个品种(系)为试验材料,在正常供水与持续干旱胁迫条件下,测定棉花对水肥最敏感的花铃期的生理生化指标和生长期间的农艺性状指标,应用多元统计分析方法,进行抗旱性综合评价,以确定棉花简单、易用的抗旱鉴定指标,为彩色棉花抗旱品种选育提供依据。研究结果表明:选择的抗旱综合评价相关的类胡萝卜素含量、离体叶片失水速率、花铃期叶片数、断裂比强度、可溶性蛋白含量、纤维长度、无效果枝数、丙二醛含量、生育期和叶片相对电导率等10个指标,可有效鉴定棉花资源的抗旱性。D值与抗旱性呈显著的正相关,根据D值的大小得出10个参试棉花材料的抗旱性由强到弱依次为BC05-07-18-2、BC06-10、白色棉陇1-1-3、BC06-45、GC06-45、G3-1、陇棉2号、G3-6、陇棕棉1号、陇绿棉3号。     

外源NO对盐胁迫下小麦幼苗生长及生理特性的影响

在盆栽试验条件下,以冬小麦(山农22)为供试材料,以硝普钠(SNP)为外源一氧化氮(NO)供体,研究了3种施用方式的外源NO对盐胁迫下小麦幼苗生长及生理特性的影响。试验共设5个处理:对照(CK)、氮磷钾(NPK)肥(T1)、NPK肥+SNP浸种(T2)、NPK肥+SNP粉末施入土壤(T3)和NPK肥+SNP缓释颗粒施入土壤(T4)。结果表明:盐胁迫条件下,小麦植株体内会积累大量的活性氧,抑制了小麦幼苗的生长;T1-T4处理的小麦幼苗长势均优于CK。与T1处理相比,添加外源NO的T2-T4处理均可显著提高小麦出苗率,其中以T4效果最为显著,可显著促进小麦幼苗的生长,提高叶片鲜重、叶片干重、叶绿素含量及抗氧化酶活性,降低叶片中超氧阴离子产生速率及过氧化氢含量,减少小麦幼苗对Na+的吸收,增加K+的吸收,维持小麦体内Na+、K+平衡,并促进根系对N、P元素的吸收,从而保证小麦植株养分吸收平衡。因此,添加外源NO既能通过促进幼苗生长、提高抗氧化酶活性、调节离子平衡等途径来提高小麦幼苗的抗盐性,缓解盐胁迫对小麦幼苗的伤害,又能通过调节根系对营养元素的吸收来促进小麦幼苗的生长。且在3种不同的SNP施用方式中,以SNP制成缓释颗粒施入土壤的施用方式对小麦盐胁迫的缓解效果最优。     

缓释外源一氧化氮(NO)与缓释水杨酸(SA)对盐胁迫下冬小麦生理特性的影响

为探讨缓释外源一氧化氮供体硝普钠(SNP,一种外源NO供体)和水杨酸(SA),添加到土壤中缓解植物盐胁迫的效应及其机理。研究以冬小麦(山农22)为试验材料,采用盆栽试验的研究方法,以常规固体SNP和SA粉末处理为对照,研究了缓释外源NO(SRSNP)与SA(SRSA)对滨海盐土上冬小麦生理特性的影响,结果表明:SNP和SA均能够缓解盐胁迫对冬小麦生长的抑制作用。缓释SNP和缓释SA可以显著提高盐胁迫下冬小麦的发芽率,提高叶片叶绿素含量,进而促进光合作用;提高了小麦各叶位超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物歧化酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性以及脯氨酸和可溶性蛋白含量;降低了超氧阴离子(O_2~--)产生速率、过氧化氢(H_2O_2)和丙二醛(MDA)含量,减轻了膜脂过氧化伤害。与直接添加进入土壤的SNP和SA相比,缓释外源NO与缓释SA可以在较长时间内保持SNP和SA对小麦盐胁迫的缓解效应,显著改善了冬小麦的生理特性,提高了小麦的耐盐性,促进了小麦的生长。     

温度对棉铃发育影响的研究进展

棉铃发育的优劣,决定了棉花产量和品质.温度是影响棉铃发育的重要因子之一.从现有的研究结果可以认为,温度不但影响棉花生长的前期阶段(苗期、蕾期),而且更直接地影响棉铃的膨大、胚珠的分化、纤维的伸长和纤维壁的加厚,从而影响了棉铃重量和纤维品质.     

不同量化RT-PCR的方法在棉花纤维GhCAD基因表达中的研究

以陆地棉（Gossypium hirsutum L.）高代品系CJ01在开花后5、10、15、20、25d（DPA）共5个不同发育时期的棉花纤维为材料,分别利用常规半定量RT-PCR法、QuantumRNA™18S内标相对定量法以及实时荧光定量 RT-PCR法,对棉花肉桂醇脱氢酶（GhCAD）基因在棉花纤维不同发育时期中的表达进行相对定量分析,并测定了内标表达的稳定性。结果表明3种方法获得相似的结果,GhCAD基因在5～15DPA时表达量较低,20、25 DPA时表达量升高。3种方法虽各有利弊,但均为研究基因量化表达的有力工具。     

光皮桦BlCCoAOMT基因的克隆、表达及单核苷酸变异分析

咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAOMT)是植物木质素合成过程中的一个关键酶,对木质素组成和结构有重要的作用。为探究BlCCoAOMT基因在木质素合成中的作用,本研究从光皮桦中克隆了该基因,并分析其基因结构和表达模式,以及在73个基因型中的单核苷酸多态性(SNP)。结果表明,BlCCoAOMT基因cDNA全长1 114 bp,含有一个744 bp的完整ORF,编码一个由247个氨基酸残基组成的蛋白;该编码蛋白包含高等植物CCoAOMT所有的8个典型保守基序。BlCCoAOMT在木质化茎段中优势表达,且随着木质化程度提高而逐渐增强,表明BlCCoAOMT可能参与光皮桦木质素的生物合成;在拉弯处理的6 h到7 d间,该基因在应拉区发育木质部中的表达显著下调,与应拉木木质素含量的下降相符。共检测到BlCCoAOMT基因有119个SNP位点,平均每14 bp就有1个SNP位点,其中在外显子区域存在26个SNP位点,表明不同基因型中存在丰富SNP变异;在不同群体间BlCCoAOMT基因的分化程度无显著差异,且非同义突变和同义突变的位点的比值均小于1,表明在演化进程中主要受到了纯化选择压力。本研究结果为深入解析光皮桦木质素合成分子机制及后续分子标记辅助育种提供了理论依据。     

外施吲哚乙酸对棉铃蔗糖代谢及产量性状的影响

为探究外施吲哚乙酸(IAA)对棉铃蔗糖代谢及棉铃产量性状的调控机制,以陆地棉(Gossypium hirsutum L.)品系A201为材料,用0.1 mg·L^-1 IAA溶液连续处理开花前1 d至开花后2 d的棉铃,以去离子水处理为对照,研究IAA处理对棉铃胚珠外表皮纤维细胞突起、蔗糖代谢及棉铃产量性状的影响。结果表明,IAA处理能够显著提高棉铃单铃重,促进棉铃开花当日纤维细胞启动的密度。与对照相比,IAA处理可增强开花后30 d种胚磷酸蔗糖合成酶(SPS)活性,导致蔗糖浓度升高,为种胚大分子物质合成提供更多的底物;并提高了开花后30~40 d种胚和开花后20~30 d种皮蔗糖合成酶(SS)的活性,增加了种胚和种皮的淀粉浓度,促进了棉花种子库物质合成。另外,IAA处理棉铃可以促进棉铃种胚和种皮蔗糖代谢关键酶的活性,提高其碳水化合物特别是淀粉的浓度,有利于棉铃种子的发育,这可能是导致单铃重提高的重要原因。本研究结果对于利用IAA提高棉花产量具有指导意义。     

兔角蛋白基因转化棉花及其纤维品质的改良

利用农杆菌介导转化法,将棉纤维特异表达启动子GAE6-3A驱动的兔角蛋白基因（MP）转入常规棉花“冀合713”中。PCR及Southern杂交分析表明,兔角蛋白基因已整合进棉花基因组。6个转基因株系中,4个为单拷贝插入,转基因后代的分离符合孟德尔3：1的1对基因的分离规律,外源基因在这些转基因后代中能稳定遗传。对这4个转基因株系T3代纤维检测结果表明,兔角蛋白基因对棉花纤维品质的影响主要是纤维强度的提高,其中3个株系纤维强度提高率达10％以上。