棉花甲基化酶基因COMT和CCoAOMT的组织特异性表达分析

本研究利用半定量RT-PCR分析方法探索了陆地棉(Gossypium hirsutum L.)木质素合成途径中甲基化酶基因家族COMT和CCoAOMT在不同组织和不同发育时期纤维中的表达情况。结果表明COMT1,COMT2,COMT3和CCoAOMT1,CCoAOMT2在棉花的7个组织器官(根、茎、叶、子叶、花瓣、雄蕊、胚珠)中都有表达,其中COMT1和CCoAOMT1在各组织中的表达趋势类似,COMT2,COMT3和CCoAOMT2表达趋势各异。在5～25d的棉纤维发育过程中,COMT1和COMT3表达稳定,COMT2表达量逐渐增加。而CCoAOMT基因家族的2个基因的表达量变化相对明显,CCoAOMT1在25d出现表达高峰,CCoAOMT2则在10d和15d呈现高表达量。本研究表明甲基化酶基因家族COMT和CCoAOMT在棉花的根,茎等维管组织中具有相对一致的高表达量,而在其他组织和发育纤维中则呈现出明显的组织特异性和纤维发育时期特异性。     

海岛棉GbTCP10基因的克隆与表达分析

为阐明海岛棉GbTCP10基因在棉纤维发育过程中的功能,以海岛棉品种新海21号为试验材料,克隆获得海岛棉GbTCP10基因,并利用酵母单杂交体系进行转录激活活性分析以及利用实时荧光定量PCR分析GbTCP10在棉花纤维不同时期的表达模式。结果表明,GbTCP10编码的蛋白与其他植物中的TCP蛋白具有较高的一致性;GbTCP10基因在开花后5 d纤维中表达量最高;GbTCP10不具有转录激活活性,推测GbTCP10可能参与棉花纤维的发育,是1个转录抑制子,本研究为了解棉花纤维发育机制提供了依据。     

棕色棉GhANS基因的克隆与表达分析

本研究以15DPA棕色棉及其白色近等基因系为材料,蛋白质双向凝胶电泳结合质谱分析,鉴定出其中一个差异表达的蛋白为花色素合成酶(ANS)。以15DPA棕色棉纤维细胞cDNA为模板,电子克隆获得了编码该蛋白基因的全长cDNA序列,序列分析发现,该基因的开放阅读框为1062 bp,编码354个氨基酸,属于花色素还原酶2-酮戊二酸加氧酶亚家族,将该基因命名为GhANS。构建GhANS基因GFP融合植物表达载体转化烟草,荧光共聚焦显微镜观察发现GhANS基因定位于烟草细胞质内。实时荧光定量PCR分析表明,GhANS基因在棉花中组成型表达,该基因在纤维细胞发育的各个时期在棕色棉中表达量均高于其白色近等基因系,推测GhANS基因在棕色棉纤维色素合成过程中起重要作用。     

水稻蜡质合成相关基因OsGL1-5的表达模式及逆境响应特征分析

通过生物信息学方法对水稻蜡质合成相关基因OsGLl-5启动子序列特点进行分析;并以水稻中花11不同组织和发育时期的穗子为材料,通过半定量RT-PCR及mRNA原位杂交技术分析OsGLl-5的时空表达特征;同时,分别以200mmol·L-1 NaCl、100μmol· L-1 ABA和1.0％ H2O2处理水稻幼苗,通过半定量RT-PCR分析逆境胁迫下OsGL1-5的表达模式.生物信息学分析表明,OsGL1-5启动子中包括大量与干旱、冷、盐等多种逆境胁迫相关的调控序列.时空表达特征分析表明,OsGL1-5主要在不同发育时期的穗子中表达,且表达部位集中在稃片的毛状体和花药绒毡层中,叶中表达量相对较低,而茎和根中没有检测到表达.NaCl、ABA以及H2O2等逆境胁迫下,OsGL1-5表达量在不同处理时间有所增加.     

小麦核糖体蛋白S15a基因(TaRPS15a)的克隆及其在多子房株系中的时空表达分析

为研究40S核糖体蛋白S15a(ribosomal protein S15a,RPS15a)在小麦多子房性状形成过程中的功能作用,以小麦(Triticum aestivum)多子房近等基因系构建的多子房性状SSH-cDNA文库中与RPS15a基因同源的EST序列为信息探针,采用RT-PCR技术从小麦多子房株系幼穗中克隆获得了RPS15a基因的cDNA与DNA序列,分析了该基因在近等基因系间的表达差异及其在多子房株系中不同时期幼穗和同一发育时期不同组织中的表达模式.结果表明,小麦RPS15a基因的cDNA序列(GenBank登录号:HM055513)长为413 bp,编码131个氨基酸;DNA序列(GenBank登录号:HM063421)长为642 bp,含有3个外显子和2个内含子.半定量RT-PCR分析显示,该基因在多子房株系2～4mm幼穗中的表达量高于单子房株系幼穗;在多子房株系不同时期幼穗中的表达量随着幼穗的发育呈现上升趋势,8～9 mm时表达量达到最高;该基因广泛存在于幼根、茎顶端、幼叶和幼穗组织中,在茎顶端表达量高于其他组织.研究推测RPS15a基因的表达上调,可能与小麦多子房性状的发生有关.     

比利时杜鹃花花青素合成酶基因（RhANS）克隆及其功能分析

花青素合成酶（ANS）是植物花青素合成途径中的关键酶。为探究比利时杜鹃花（Rhododendron hybridum Hort.）ANS基因的功能及表达特性,本研究以比利时杜鹃花不同发育时期花瓣及盛花期的根、茎、叶为试验材料,利用反转录（RT-PCR）和RACE技术克隆RhANS基因cDNA序列;利用超高效液相色谱质谱（Waters UPLC-Qtof）技术分析比利时杜鹃花不同发育阶段花瓣中花青素含量;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析比利时杜鹃花不同发育阶段花瓣和不同器官中ANS基因相对表达量;将RhANS基因重组到原核表达载体（pET-28a）上,并在大肠杆菌（BL21）中进行表达纯化出目的蛋白,并利用高效液相色谱（HPLC）检测目的蛋白RhANS的酶活性。结果表明,从比利时杜鹃花克隆得到RhANS基因cDNA全长序列1 350 bp,开放阅读框（ORF）序列1 074 bp,编码357个氨基酸,含有2-酮戊二酸双加氧酶家族基因结构域2OG-FeⅡ-Oxy;比利时杜鹃花花青素含量随着花的开放呈逐渐上升的变化趋势;RhANS基因表达量在比利时杜鹃花4个花期的花瓣和不同器官（...     

草鱼MYH mRNA表达量分析中采用的内参基因稳定性比较

本研究分别以β-actin、18SrRNA和GAPDH为内参基因,采用实时荧光定量PCR对草鱼早期发育时期肌球蛋白重链（myosin heavy light,MYH）基因的mRNA表达量进行分析,并比较不同内参基因对MYH基因mRNA表达水平检测结果的准确性。研究结果表明,以β-actin和GAPDH作为内参,MYH基因mRNA表达水平完全一致,其表达量从原肠到仔鱼阶段逐次递增,仔鱼与原肠期阶段相比表达量差异显著;当采用18S rRNA作为内参时,MYH基因mRNA在发育阶段的表达量呈不稳定状态。因此,β-actin和GAPDH均可作为内参基因,用于草鱼早期发育中MYH基因mRNA的相对定量研究;而18S rRNA作为内参时,可能会对检测结果造成偏差。本研究不仅准确的揭示了草鱼MYH基因mRNA的表达特征,并且为荧光定量PCR技术在鱼类基因表达研究方面提供了有价值的参考。     

猪SOCS3基因克隆及其在不同生长阶段表达差异研究

从杜长大母猪的肠系膜脂肪中提取基因组RNA，用RT-PCR扩增SOCS3基因，获得1条约332 bp的片段，以pGEM-T Easy vector 为载体，将该基因片段克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α中。从筛选的阳性克隆中分离出SOCS3基因，测定其序列，分析表明，该片段为 SOCS3 cDNA的部分序列，与GenBank中登录的猪SOCS3 cDNA部分核苷酸序列同源性达到100%。以SOCS3基因片段的克隆为基础，构建了优化的半定量RT-PCR法，以18s rRNA为内标，研究不同生长阶段猪肠系膜脂肪中SOCS3基因表达的差异。结果发现，从初生到90 kg，SOCS3基因在肠系膜脂肪中表达量呈逐渐增加的趋势，其中90 kg较初生时增加了141％（p<0.05）。     

棉花肉桂醇脱氢酶基因GhCAD3的克隆及原核表达

肉桂醇脱氢酶(CAD)是木质素生物合成过程中的一个关键酶类。本研究从棉花中克隆了一个CAD基因,命名为GhCAD3(GenBank登录号为FJ376601)。GhCAD3全长1573 bp,具有1个1080 bp的开放阅读框,5′非编码区为35 bp,3′非编码区为458 bp,编码359个氨基酸,预测分子量约为39.116kD,等电点为7.48。氨基酸同源性分析发现,GhCAD3与其他CAD一致性为64.13%。为了进一步研究GhCAD3基因的功能,构建了该基因的原核表达载体pET-28a-CAD3,经酶切鉴定后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。SDS-PAGE电泳分析表明,最佳诱导表达条件为0.5 mmol/L IPTG在37℃下诱导7 h。     

叶面喷施尿素对葡萄氮代谢相关基因表达的影响

本研究利用VitisEST数据库中EST序列片段结合RT-PCR方法克隆了与氮代谢相关的硝酸盐还原酶（NR）,亚硝酸还原酶（NiR）,谷氨酰胺合成酶（GS）,谷氨酸脱氢酶（GDH）和天冬酰胺合成酶（AS）的基因,并对它们进行亚细胞定位分析。同时,采用半定量RT-PCR和荧光定量PCR法研究葡萄叶面喷施不同浓度尿素后5个基因的表达变化。结果表明,5个基因在葡萄幼叶中的表达水平显著高于老叶,说明叶面喷施尿素以喷布到幼叶对5个基因的表达水平影响显著;5个基因在不同时间段的表达水平差异不一致,但表达水平均高于对照,以0.3%和0.5%浓度的尿素对其影响明显;适当提高尿素水平既能提高氮代谢基因的表达水平,又能提高果实大小等果实指标,使其达到同步增加。喷施尿素6 h后,GS的表达量上升幅度明显高于其它基因,而NR在喷施尿素后48 h内一直保持着比较高的表达水平;NiR、AS表达量的变化趋势分别与NR、GS相一致,并且NR﹥NiR,GS﹥AS。     

Nonstructural carbohydrates in leaves subtending cotton bolls,fibers and embryos in response to nitrogen stress

A field study was conducted in 2013 and 2014 where cotton was exposed to three N regimes: (1) the control without N application (low N); (2) 260 kg N ha^?1 (medium N); (3) 520 kg N ha^?1 (high N). Boll size, lint mass per boll, seed mass per boll, fiber length and strength were significantly decreased under N deprivation in the two years. The increased carbohydrate levels of LSCB (leaf subtending the cotton boll) led to decreased carbohydrate levels of fibers in the low N relative to the other N treatments. The low N embryos exhibited lower starch concentrations at 17 and 31 DPA (days post anthesis), and TNC (total nonstructural carbohydrate) concentrations at 17, 31, 45 and 52 DPA compared to medium N embryos. Starch levels in LSCB had negative associations with those in fibers at 17, 31 and 45 DPA, but positive associations with those in embryos at 24 and 45 DPA. Fibers expressed negative associations with embryos in glucose level at 24 and 38 DPA, and in TNC levels at 17 and 45 DPA. The study suggests that carbon assimilate levels in fibers and embryos could explain the difference in boll yield components and fiber quality.     

外施吲哚乙酸对棉铃蔗糖代谢及产量性状的影响

为探究外施吲哚乙酸(IAA)对棉铃蔗糖代谢及棉铃产量性状的调控机制,以陆地棉(Gossypium hirsutum L.)品系A201为材料,用0.1 mg·L^-1 IAA溶液连续处理开花前1 d至开花后2 d的棉铃,以去离子水处理为对照,研究IAA处理对棉铃胚珠外表皮纤维细胞突起、蔗糖代谢及棉铃产量性状的影响。结果表明,IAA处理能够显著提高棉铃单铃重,促进棉铃开花当日纤维细胞启动的密度。与对照相比,IAA处理可增强开花后30 d种胚磷酸蔗糖合成酶(SPS)活性,导致蔗糖浓度升高,为种胚大分子物质合成提供更多的底物;并提高了开花后30~40 d种胚和开花后20~30 d种皮蔗糖合成酶(SS)的活性,增加了种胚和种皮的淀粉浓度,促进了棉花种子库物质合成。另外,IAA处理棉铃可以促进棉铃种胚和种皮蔗糖代谢关键酶的活性,提高其碳水化合物特别是淀粉的浓度,有利于棉铃种子的发育,这可能是导致单铃重提高的重要原因。本研究结果对于利用IAA提高棉花产量具有指导意义。     

Effects of late planting on fiber quality and within-boll yield components as mediated by sucrose metabolism in cotton bolls

ABSTRACT

The objective of this study was to examine the effect of late planting on sucrose metabolism in cotton bolls and the relationship to fiber properties and within-boll yield components. Two cotton lines A201 and A705 were employed in a sowing date experiment where two temperature regimes during boll maturation period were created at mean daily temperature of 26.8°C, 28.3°C for early planting and 25.2°C, 23.1°C for late planting in 2016 and 2017, respectively. Boll size, seed mass per boll, seed index and fiber length were increased, and lint percentage was decreased by late planting. Greater cell wall invertase activity and the resultant hexose concentration in fibers were observed in late planting, and thus led to decreased osmotic potential accounting for the enhanced fiber length. Similarly, late planting increased the maximum of vacuolar invertase activity in ovules occurring at 5 days post anthesis (DPA) and hexose concentrations in embryos from 10 DPA afterwards which may favor embryo cell division, and thus increase final seed size. Our data indicate that acid invertase and hexose are implicated in the formation of within-boll yield components and fiber properties as affected by the lower temperature regime due to late planting.     

棕色棉类黄酮3'-羟化酶基因(F3'H)的克隆及色素合成途径中相关基因表达特性研究

为探讨花色苷途径在彩棉色素形成中的作用及彩棉色素形成规律,本研究根据葡萄(Vitis vinifera)的类黄酮3'-羟化酶(flavonoid3'-hydroxylase,F3'H)基因全长cDNA序列blast所得棉花(Gossypium hirsutum)的EST序列(GenBank登录号:DT545210,CO071403和BG447485)设计引物,以开花后16d的新彩棉5号(XC-5)纤维为材料,采用RACE(rapid amplification of cDNA ends)和RT-PCR方法分离得到了2个类黄酮3'-羟化酶基因的全长cDNA序列,长度为1761和1892bp,均含有一个97~1629bp、长度为1533bp的开放阅读框,编码510个氨基酸,将这两个序列命名为GhF3'H-1和GhF3'H-2,分别提交GenBank,登录号为HM598123和HM598124,此2个序列编码区完全相同,仅在3'非翻译区(UTR)存在片段长短的差异。半定量RT-PCR检测花色苷合成途径中查尔酮合成酶(chalcone synathase,CHS)基因、F3'H、类黄酮3',5'-羟化酶(flavon...     

Identification and quantification of three genetically modified insect resistant cotton lines using conventional and TaqMan real-time polymerase chain reaction methods

As the genetically modified organisms (GMOs) labeling policies are issued in many countries, qualitative and quantitative polymerase chain reaction (PCR) techniques are increasingly used for the detection of genetically modified (GM) crops in foods. Qualitative PCR and TaqMan real-time quantitative PCR methods to detect and identify three varieties of insect resistant cotton, i.e., Mon531 cotton (Monsanto Co.) and GK19 and SGK321 cottons (Chinese Academy of Agricultural Sciences), which were approved for commercialization in China, were developed in this paper. Primer pairs specific to inserted DNAs, such as Cowpea trypsin inhibitor (CpTI) gene of SGK321 cotton and the specific junction DNA sequences containing partial Cry1A(c) gene and NOS terminator of Mon531, GK19, and SGK321 cotton varieties were designed to conduct the identified PCR assays. In conventional specific identified PCR assays, the limit of detection (LOD) was 0.05% for Mon531, GK19, or SGK321 in 100 ng of cotton genomic DNA for one reaction. Also, the multiplex PCR method for screening the three GM cottons was also established, which could save time and cost in practical detection. Furthermore, a real-time quantitative PCR assay based on TaqMan chemistry for detection of insect resistant gene, Cry1A(c), was developed. This assay also featured the use of a standard plasmid as a reference molecule, which contained both a specific region of the transgene Cry1A(c) and an endogenous stearoyl-acyl carrier protein desaturase (Sad1) gene of the cotton. In quantitative PCR assay, the quantification range was from 0.01 to 100% in 100 ng of the genome DNA template, and in the detection of 1.0, 3.0, and 5.0% levels of three insect resistant cotton lines, respectively, all of the relative standard deviations (RSDs) were less than 8.2% except for the GM cotton samples with 1.0% Mon531 or GK19, which meant that our real-time PCR assays involving the use of reference molecule were reliable and practical for GM insect resistant cottons quantification. All of these results indicated that our established conventional and TaqMan real-time PCR assays were applicable to detect the three insect resistant cottons qualitatively and quantitatively.     

Olanzapine对美国王鸽PRLR基因表达的影响

摘要：选720日龄美国王鸽120对，随机分成4组（每组设3个重复，每个重复10对）。对照组饲喂基础日粮，试验1组添加0.25mg/kg的Olanzapine，试验2组添加0.75mg/kg的Olanzapine，试验3组添加1.25mg/kg的Olanzapine。本试验构建优化了RT-PCR反应体系，研究结果显示Olanzapine能降低PRLR mRNA的表达量，与对照组相比，添加Ola 1.25mg/kg组PRLR mRNA表达量降低了14.3%（P<0.05）。可见，日粮添加Olanzapine能显著抑制PRLR 基因的表达。本研究揭示：Olanzapine作为DA和5-HT受体阻断剂能抑制PRLR基因表达，有效减少就巢行为的发生，缩短就巢时间，提高产蛋量 。     

胡枝子高质量RNA的提取及ALMT基因片段的克隆和表达分析

针对木本植物胡枝子组织中多糖、多酚等次生物质含量高的特点,采用改良的CTAB法,成功地从胡枝子组织中提取了总RNA。所提取的胡枝子总RNA OD260/OD280值介于1.9~2.1之间,产率介于100~250μg/g之间。采用该方法提取的胡枝子总RNA,经过RT-PCR成功地克隆到了胡枝子ALMT基因片段,克隆得到的胡枝子ALMT基因片段序列与已知ALMT基因序列之间具有较高同源性,经半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR表达分析,证明该基因在根中表达且受铝诱导。试验结果表明利用改良的CTAB法提取的胡枝子总RNA样品质量较高,能够用于基因的半定量和定量表达分析。     

施氮量对不同开花期棉（Gossypium hirsutum L.）铃纤维细度和成熟度形成的影响

为兼顾试验的重复性和生态区域性,选用高品质棉（科棉1号）和常规棉（美棉33B）品种为材料,于2005年分别在江苏南京（118o50E, 32o02N,长江流域下游棉区）和江苏徐州（11711E, 3415N,黄河流域黄淮棉区）设置施氮量（低氮:N 0 kg/hm2;适氮:N 240 kg/hm2;高氮:N 480 kg/hm2）试验,研究施氮量对不同开花期棉铃纤维细度、成熟度和马克隆值形成的影响。结果表明:（1）施氮量显著影响棉纤维细度、成熟度和马克隆值的形成过程,但三者在不同开花期对氮素水平的响应不同,施氮量与开花期对棉纤维细度、成熟度和马克隆值的形成存在互作效应。8月10日前开花的棉铃,铃期［花后0～50 d （DPA）］日均温在23.3 oC以上,纤维细度、马克隆值以N 0 kg/hm2施氮量下最大,棉纤维马克隆值与纤维细度的相关性较大;8月25日开花的棉铃（铃期日均温在20.8～23.3 oC之间）,纤维成熟度、马克隆值以N 240 kg/hm2施氮量下最大;9月10日开花棉铃（铃期日均温低于20.8 oC）,纤维细度、成熟度和马克隆值均以N 480 kg/hm2最大,棉纤维马克隆值与纤维成熟度的相关性增强。（2）影响不同开花期间纤维细度、成熟度和马克隆值的主要因素是铃期日均温,最终纤维细度、成熟度和马克隆值在不同施氮量之间的变异与不同开花期（铃期日均温不同）间的变异比较,前者显著小于后者。综上,因开花期不同而形成的铃期日均温是决定细度、成熟度和马克隆值的最重要因素,施氮量可通过对位叶叶氮浓度NA影响棉纤维细度、成熟度和马克隆值的形成过程,增加施氮量可减小上述指标在不同开花期间的差异。