Lactobacillus reuteri PYR8亚油酸异构酶基因在大肠杆菌中的表达与活性检测

以Lactobacillus reuteri PYR8菌株基因组为模板,利用PCR方法扩增出亚油酸异构酶(linoleate isomerase,LI)基因,亚克隆到pET30a中构建原核表达载体pET30a-LI,并转化入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中。其重组菌株在37℃条件下,经1.0mmol/L IPTG诱导表达重组LI蛋白,该蛋白以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的39.2%。采用Ni2 -NTA柱上复性法获得有活性的纯化重组亚油酸异构酶,其比活力5.12U/mg,是天然亚油酸异构酶比活力的2.5倍。     

人肥胖基因在大肠杆菌中的表达及生物学活性检测

肥胖基因(ob)编码的瘦蛋白可以反映机体脂肪含量信息,在发育、繁殖、造血及体重调节等方面具有重要功能。利用PCR方法扩增去除信号肽的人肥胖基因cDNA序列,并将位于基因5!端的CCC转变为大肠杆菌(Escherichiacoli)常用密码子CCG,扩增片段经测序证实后,克隆到原核表达载体pET5a,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经0.1mmol/LIPTG诱导,获得分子量约为16kD的特异蛋白表达带,表达量最高占菌体蛋白总含量的55%。重组蛋白纯化后,注射昆明白小白鼠,小白鼠体重明显下降,说明纯化的重组蛋白具有生物学活性。     

抗真菌鲎素基因在大肠杆菌中的表达

人工设计并合成了抗真菌多肽鲎素基因,将合成的鲎素基因首先克隆到了ｐＵＣ１８载体上,利用通用引物测序,获得了与预期碱基序列完全一致的目的基因。再将鲎素基因克隆到原核表达载体ｐＧＥＸ－５Ｘ－１上,诱导表达融合蛋白。经ＩＰＴＧ诱导,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ进行检测,在２９ｋＤ处出现了ＧＳＴ－鲎素融合蛋白条带,与预期分子量大小相     

宇佐美曲霉木聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达

在已知宇佐美曲霉E001菌株木聚糖酶Xyn II cDNA序列（Genbank登录号为DQ114485）的基础上，合成1对引物（含 EcoR I和Sal I酶切位点），以重组质粒pUCm-T-xyn II为模板，扩增得到编码Xyn II成熟肽的cDNA片段（555 bp）。将其与表达质粒pET-28a连接，构建了重组表达质粒pET-28a-xyn II，转化E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL，获得重组工程菌B21/xyn II。经IPTG诱导表达，木聚糖酶的比酶活力最高可达35.6 U/mg。最后采用金属Ni2+螯和层析柱对所表达的木聚糖酶进行纯化，达到了电泳纯。重组表达的木聚糖酶最适温度为45℃，最适pH值为4.6。     

法氏囊素在大肠杆菌中的表达及其免疫增强活性

选用大肠杆菌(Escherichiacoli)编码赖氨酸(Lys)、组氨酸(His)和甘氨酸(Gly)的常用密码子按顺序排列成BS基因:5'-AAACACGGT-3'。连续合成10个BS(BS10)串连基因单链及其反向互补链,通过退火使其复性成双链。BS10基因经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后,克隆进表达载体pGEX-6P-1中。获得的重组质粒pGEX-Bur转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,串连的BS10基因获得了高效表达。表达产物经GST亲和层析和胰酶消化处理后,按适当的浓度和新城疫病毒(NDV)混合,免疫90只30日龄的小白鼠。分别在免疫后第7,14和21天,用血凝抑制试验(HI)测定小鼠血清中NDV的抗体水平,结果加入囊素的实验组比不加囊素的对照组HI平均高出22.5个滴度。同样的实验样品免疫100只8日龄SPF(speclficpathogenfree)鸡,15d后实验组的抗体水平比对照组平均高出20.7个滴度。研究结果证实了用大肠杆菌表达的法氏囊素对小鼠和鸡具有免疫增强的作用。     

鸡MxA全基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

MxA是由Ⅰ型干扰素诱导宿主细胞所产生的抗病毒蛋白家族的成员之一。本文以Poly:IC和干扰素联合诱导鸡成纤维细胞，使MxA基因活化并转录mRNA，然后从细胞中提取总RNA，并进行RT-PCR，扩增MxA基因，序列分析后克隆到pGEX原核表达载体中，在大肠杆菌中进行诱导表达。表达产物经复性、纯化回收后，得到浓度为10mg/ml较纯的MxA重组蛋白。经体内、体外活性检测实验表明，此表达产物具有阻断新城疫病毒感染的功能,具有很好的研发前景。     

Prd29A启动子在小麦中的诱导表达活性及大肠杆菌海藻糖合成酶基因的转化

以gus基因为报告基因，通过瞬时表达测定了Prd29A诱导型启动子在小麦愈伤组织中的诱导表达活性。结果表明，Prd29A-gus基因的表达水平可在不同浓度NaCl盐的胁迫条件下得到显著提高。由此证实，Prd29A启动子在小麦中具有较强的诱导表达活性。在此基础上，将Prd29A诱导型启动子驱动下的大肠杆菌海藻糖合成酶基因（otsA）采用花粉管途径导入目的小麦品系，经PCR筛选、Southern鉴定及转化后代海藻糖含量的测定，获得了一批otsA转基因植株及株系，为进一步选育耐盐抗旱的转基因小麦新品系奠定了基础．     

pfl-act基因在大肠杆菌中的高效表达及其纯化

丙酮酸甲酸裂解酶是肠道细菌在厌氧代谢中十分关键的酶,丙酮酸甲酸裂解酶激活因子(pyruvateform ate lyase activator,PFL-A)在功能上具有重要的作用。为进一步研究PFL-A的激活机理,以大肠杆菌K-12的基因组为模板,通过G enB ank上公布的序列设计引物,扩增出目的基因,克隆到pM D 18-T载体,经测序,所扩增出的基因与p f l-act基因具有99%的同源性。将p f l-act连接到高效表达载体pET-22b( )中,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导,结果发现,p f l-act以包涵体形式表达。改变诱导剂、诱导剂量或培养温度,对包涵体的形成均没有明显的影响。     

睾丸酮丛毛单胞菌teiR基因载体构建及在大肠杆菌中的表达

提取睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)基因组DNA,利用PCR扩增teiR基因,将扩增产物克隆到pKtac2(含强启动子tac)和pK18中,构建重组质粒pKtac2-teiR和pKteiR100。将重组质粒分别转化大肠杆菌(Escherichia coli)HB101, 提取细菌总蛋白,ELISA测定细菌总蛋白中teiR基因的表达量,结果表明: 含tac强启动子的pKtac2-teiR重组质粒具有更高的转录活性;将p6(含3a-HSD/CR基因)分别和重组质粒(pKtac2-teiR和pKteiR100)共转化大肠杆菌(Escherichia coli)HB101, 测定细菌总蛋白中3a-HSD/CR 和teiR基因的表达量,结果表明: 在大肠杆菌中teiR可以明显促进3a-HSD/CR 的表达, pKtac2-teiR与p6共转化后teiR基因的表达量比pKteiR100与p6共转化后teiR基因的表达量高,但是pKtac2-teiR与p6共转化后的3a-HSD/CR的表达量低于pKteiR100与p6共转化后的3a-HSD/CR的表达量。     

粘虫痘病毒增效蛋白的重组表达及其生物活性

昆虫病毒增效蛋白(enhancin)在体外能促进核型多角体病毒(NPV)对昆虫离体细胞系的感染;在体内能显著提高NPV对昆虫幼虫的感染效果,并可增强苏云金芽孢杆菌(Bt)对幼虫的毒力(Hashimoto et al.,1991;Roelvink et al.,1995)。粘虫痘病毒(Pseudaletia separata entomopoxvirus,PsEP     

Overexpression of the soluble form of chicken cystatin in Escherichia coli and its purification

A cDNA encoding chicken cystatin was cloned into the pET-23a(+) expression vector and then transformed into Escherichia coli AD494(DE3)pLysS expression host. An active soluble form of cystatin was expressed in the cytoplasm of E. coli induced by isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside. The recombinant chicken cystatin was purified to electrophoretic homogeneity by a simple and rapid method involving heat treatment and Sephacryl S-100 gel filtration chromatography. The recombinant cystatin behaved as a thermal-stable protein and exhibited papain-like protease inhibition activity comparable to the natural chicken cystatin.     

短小芽孢杆菌β-1,4-木聚糖酶基因在大肠杆菌中的高效表达

从短小芽孢杆菌(Bacillus purnilus)BP51中克隆得到木聚糖酶基因xynA。将其构建在大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pET21a上，转化Ecoli BL21，获得重组工程菌BLX5。经IPTG诱导，xynA基因的表达产物以胞内可溶性蛋白和包涵体形式存在。重组表达木聚糖酶的活力可达165．511U／mL培养物。重组表达的木聚糖酶最适温度为55℃，最适pH值为6．5，在碱性条件下具有良好的稳定性，降解产物以三糖、四糖和五糖为主。     

牛干扰素-tau基因的原核表达及生物功能鉴定

本试验采用PCR方法直接从牛早期胚胎细胞液中扩增牛干扰素-tau （bIFN-τ）基因（含信号肽基因序列）,并克隆到pGEM-T载体中,筛选阳性克隆,将含信号肽和不含信号肽的bIFN-τ 片断分别克隆到原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒,进行IPTG诱导表达,表达产物进行变性、复性和纯化,最后通过抗病毒活性检测和对体外培养的牛子宫内膜上皮细胞形态变化的影响,鉴定其生物学功能。结果表明,不提取胚胎基因组DNA,以胚胎的裂解液为模板,可以从少量（5枚）牛囊胚中直接扩增得到bIFN-τ基因,与Genbank报道的序列相比,核苷酸和氨基酸的同源性分别达99％和97％;SDS-PAGE电泳检测,不含信号肽的bIFN-τ基因与表达载体形成的重组质粒,在约20kD处出现特异性条带,与目标蛋白分子量一致;病毒抑制法测定rbIFN-τ的抗病毒活性单位为1×104IU/mg,在牛子宫内膜上皮细胞培养液中添加rbIFN-τ作用24 h后,细胞体积增大,细胞内出现明显的囊泡状结构,表明本研究获得的rbIFN-τ具有一定的生物活性。     

H5亚型禽流感病毒HA基因的克隆、表达及其生物学活性的初步分析

参考GenBank上发表的H5亚型禽流感病毒（Avianinfluenza virus,AIV）血凝素（HA）基因序列设计引物,经RT-PCR扩增HA基因的HA1片段,再将其克隆到原核表达载体PET-28a中,用大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）原核表达,SDS-PAGE和Western blot对表达蛋白进行鉴定.Western blot结果表明,表达蛋白能与H5亚型AIV单特异性血清特异性反应.交叉反应试验表明,此蛋白具有良好的抗原性,可被H5亚型AIV抗体特异性识别且无交叉反应.用变性纯化后的蛋白建立了对AIV抗体检测的间接ELISA,并对236份鸡血清样本进行了实验室检测.检测结果与血凝抑制试验检测结果符合率达到100%.综合研究表明,表达蛋白具有良好抗原性.     

Overexpression, purification, and in vitro refolding of the 11S globulin from amaranth seed in Escherichia coli

An amarantin 11S globulin cDNA encoding one of the most important storage proteins of amaranth seeds, with a high content of essential amino acids, was expressed in Escherichia coli. A good level of expression of recombinant amarantin with a molecular weight of 59 kDa was obtained. The recombinant protein was extracted by ammonium sulfate precipitation and purified to homogeneity using ion-exchange chromatography and reversed phase high-performance liquid chromatography. The expressed protein exhibited electrophoretic, immunochemical, and surface hydrophobicity properties similar to those of native amarantin from amaranth seed. Also, the recombinant protein was refolded in vitro using two different methods.     

Identification of Escherichia coli from shellfish and related environments by automicrobic system

A total of 463 fecal coliform positive isolates obtained from shellfish and related samples gave typical Escherichia coli IMViC reactions. E. coli identifications for 458 (99%) of these isolates were confirmed using a combination of the Automicrobic System (AMS) and the API 20E system (reference system). The AMS (test system) identified 433 isolates as E. coli; the remaining 25 (5%) isolates were identified as E. hermanii by the test system and as E. coli by the reference system. Additional tests performed on the isolates identified as E. hermanii confirmed those AMS identifications to be incorrect.     

小反刍兽疫病毒N基因在大肠杆菌中的表达及鉴定

参照GenBank中小反刍兽疫病毒((Peste des petits ruminants virus,PPRV)N基因序列（Nigeria/75/1）(1 578 bp)设计了1对添加EcoRⅠ和Not Ⅰ酶切位点的引物,对从奥地利引进的pCI-neo-PPRN质粒进行PCR扩增,克隆至pGM-T载体,并转化大肠杆菌Escherichia. coli TOP10感受态细胞,获得重组质粒pGM-T-PPRN。将重组质粒经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切的产物插入原核表达载体pET-32a（+）,构建原核表达质粒pET-PPRN,将其转化进BL21(DE3)感受态细胞中后用IPTG诱导表达, 收集菌液进行SDS-PAGE电泳和Western blot分析,结果表明小反刍兽疫病毒N基因在BL21(DE3) 成功表达。所表达融合蛋白的相对分子质量约为80 kD,并能被组氨酸单抗、PPRV标准阳性羊血清及PPRV疫苗免疫羊血清所识别。