高羊茅FaGI基因在拟南芥中异源表达及蛋白互作分析

为探究高羊茅FaGI基因的生物学功能,本研究利用酵母双杂交、双分子荧光互补和免疫共沉淀探究与FaGI互作的蛋白;通过农杆菌介导法将过表达载体p1300-FaGI遗传转化拟南芥,获得转FaGI基因拟南芥株系,以拟南芥野生型Col-0、过表达FaGI基因株系和gi突变体为材料进行转录组学测序并观察其开花表型。结果表明,利用酵母双杂交方法筛选出与FaGI互作的FaCO蛋白,并通过双分子荧光互补和免疫共沉淀证明了FaGI和FaCO在体内和体外存在互作关系;过表达FaGI基因拟南芥植株的开花时间比野生型Col-0提前约1.24 d;将FaGI-OE、gi与野生型比对,分别筛选出1 963和92个差异表达基因（DEGs）,与野生型植株相比,过表达FaGI基因株系的差异基因富集在与生长发育、光周期途径、激素合成和信号传导、碳代谢等相关生物过程和代谢通路。综上,FaGI影响光周期途径相关基因的表达,在长日照条件下过表达FaGI基因促进了拟南芥开花,同时该基因的功能具有多样性与复杂性,可作为高羊茅调控分子育种的目标基因。本研究结果为揭示FaGI基因的功能及其调控网络奠定了基础。     

PTLF-PTAG-IR对转基因烟草开花的抑制效应

PTLF（LEAFY同源基因）和PTAG（AGAMOUS同源基因）是杨树中控制花发育的重要基因,为了解RNA干涉同时抑制PTLF和PTAG对花发育的影响,本研究采用根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导法将35S：：PTLF-PTAG-IR导入烟草（Nicotiana tabacum）。经PCR检测获得了15株阳性转化株系,进一步的Southern分析证实PTLF-PTAG-IR基因已整合到烟草基因组中。荧光定量分析结果显示,转基因烟草内源NFL（LEAFY同源基因）和NAG1（AGAMOUS同源基因）的表达量均低于野生型。对开花时间调查的结果表明：与野生型烟草相比,53.3%的转基因株系开花受到完全的抑制,26.7%的转基因株系开花时间平均推迟34.3d,仅20%的转基因株系与野生型在同一时期开花。另外,对转基因烟草花器官的观察发现花瓣形态,雄蕊着生方式、数目等方面发生变异,这些研究结果表明过量表达35S：：PTLF-PTAG-IR对烟草花发育起到抑制作用,本研究将为利用转基因手段获得不育材料提供参考。     

雷竹VRN1同源基因克隆及功能分析

拟南芥VERNALIZATION 1(VRN1)基因是一个介导春化途径,调控开花时间的基因。为了研究竹类植物中VRN1同源基因的功能,采用同源克隆技术从雷竹中分离到一个VRN1同源基因,将其命名为PvVRN1。序列分析表明,该基因编码245个氨基酸,与小麦、水稻中VRN1同源基因相似性分别为86.56%和88.98%。实时荧光定量PCR结果表明,PvVRN1在开花雷竹中的表达量高于未开花雷竹;在开花雷竹中,PvVRN1在秆、花、叶芽中表达量相对较高。亚细胞定位分析表明,PvVRN1蛋白质主要存在细胞核中。PvVRN1在拟南芥中的过表达使转基因植株矮小,花瓣和萼片比野生型短,但是在开花时间上与野生型无差异,表明PvVRN1基因可能参与雷竹花形态建成以及其它发育过程。本研究结果可为阐明竹子开花机制提供科学依据。     

MADS-box基因控制植物成花的分子机理

植物花器官的发育和开花是植物生殖发育中最重要的过程,植物在长期的进化过程中产生了春化（低温）途径、自主途径、光周期途径以及不依赖于光温环境条件的赤霉素信号途径来适应多变的环境和调控植物开花过程。本文综述了模式植物拟南芥中由LEAFY（LFY）、CONSTANS（CO）、FLOWERING LOCUSC（FLC）、FLOW ERING LOCUS T（FT）和SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO1（SOC1）等基因构成的双子叶植物响应光温条件变化的开花调控网络;以及大麦、小麦中由VERNALIZATION1（VRN1）、VRN2、ODD-SOC2（OS2）和拟南芥CO、FT同源基因构成的禾本科植物开花调控网络。其中最重要的是转录调控因子MADS-box基因FLC、SOC1、VRN1和OS2,并发现组蛋白的乙酰化/脱乙酰化,赖氨酸的甲基化/脱甲基化在调控FLC、VRN1染色质活性状态及基因表达,从而产生开花控制的机理。这些研究发现将有助于对具有重要经济价值的单双子叶植物,通过生物技术手段改良其品种特性以应对非生物逆境,特别是低温胁迫的指导。     

拟南芥AtEXP1基因启动子的克隆及转录调控元件分析

为了研究拟南芥扩张蛋白AtEXPA1基因启动子上与转录调控有关的元件,我们通过PCR技术克隆了AtEXPA1基因上游897bp具有启动子活性的序列,再将启动子作不同程度截短,所有片段与GUS基因融合,构建植物表达载体,采用基因枪轰击拟南芥叶片和PEG介导转化烟草原生质体,通过定性和定量检测GUS的活性,发现在靠近翻译起始密码子的上游144bp之间存在增强转录活性的元件。将PEG介导转化的烟草原生质体,分别进行光诱导,冷诱导, 脱落酸（ABA）,盐处理,根据GUS定量检测的结果,推测（1）在AtEXPA1基因启动子上广泛存在与光调控有关的元件,（2） -897～-626 bp之间存在冷负调控元件, （3）-626～-444 bp之间存在与ABA负调控有关的元件,（4）-626～-282 bp之间存在与盐负调控有关的元件。     

棉花MADS-box蛋白基因（GhMADS-13）的克隆和表达分析

一组具有MADS-box结构域的转录因子在控制花器官的诱导与发育中起着重要作，以中棉所36（CCRI）均一化全长cDNA文库为基础，结合EST测序分析，分离获得一个棉花的MADS-box基因全长cDNA。该基因cDNA全长1079bp，包含一个732bp的完整的开放阅读框，编码234个氨基酸，具有典型的MADS-box结构域和完整的K区，命名为GhMADS-13（GenBank：FJ409870）。与拟南芥、葡萄等植物的AGL6类基因具有高度的同源性。实时定量RT-PCR分析表明，GhMADS-13在CCRI36的花器官发育中早期表达量逐步增加，后期有下降趋势。推测GhMADS-13可能在开花诱导和花器官发育过程中起着重要作用。     

烟草NtMTPC4启动子的克隆与缺失分析

组织特异性启动子是基因工程研究及实际应用中的重要工具。为了研究烟草NtMTPC4启动子的表达特性,采用实时荧光定量PCR方法分析烟草金属耐受蛋白C4(MTPC4)基因NtMTPC4在烟草不同组织中的表达模式,并利用PCR技术克隆得到NtMTPC4的上游启动子NtMTPC4-P。根据调控元件的分布对NtMTPC4-P进行不同程度的缺失,获得了NtMTPC4-P1、NtMTPC4-P2和NtMTPC4-P3缺失体;构建全长NtMTPC4-P和不同缺失体的植物表达载体,并通过花序浸染法转化拟南芥,对获得的转基因拟南芥进行GUS组织化学染色分析。结果表明,NtMTPC4基因的表达具有组织特异性,其在花中的表达量最高。NtMTPC4-P全长2 287 bp,含有CAAT-box、TATA-box、GTGANTG10和POLLEN1LELAT52等顺式作用元件和调控元件。GUS组织化学染色结果表明,全长启动子NtMTPC4-P和不同缺失体都能特异性地驱动GUS基因在转基因拟南芥花粉中的表达。本研究结果为通过基因工程技术在花粉中特异表达目的基因提供了新的调控元件。     

拟南芥Nodulin MtN21家族At1g0938基因功能的初步研究

拟南芥Nodulin MtN21 蛋白家族含有1～2个DUF6结构域,具有内在膜蛋白的特性。推测该家族基因在小分子跨膜运输、信号转导和抗逆性等方面发挥作用。At1g09380是拟南芥Nodulin MtN21 基因家族成员。本研究通过PCR筛选获得At1g09380对应的T-DNA 插入纯合子,并通过RT-PCR鉴定该突变体为无效突变体。对突变体萌发和萌发后阶段进行盐胁迫和干旱胁迫分析,结果表明,At1 g09380 突变体萌发后对NaCl和干旱胁迫敏感,证明该基因参与拟南芥的盐和干旱胁迫响应过程。同时还发现在长日照条件下突变体植株比野生型植株早开花7d左右。以上研究结果为进一步分析该基因的生物学功能打下基础。     

烟草病毒病及其检测鉴定技术

简介了病毒及烟草病毒的分类,烟草病毒病的检测鉴定技术。重点叙述酶联免疫吸附反应（ELISA）在烟草病毒检测中的应用。     

转玉米ZmMPK7基因烟草响应高盐胁迫的光合特性和抗氧化酶系统分析

以烟草NC89品种野生株系(WT)和转玉米ZmMPK7基因株系为材料,在NaCl胁迫条件下,对其光合特性和抗氧化酶活性进行分析,以探讨转ZmMPK7基因烟草的耐盐性。结果表明,随盐胁迫加重,转基因烟草植株比野生型具有更高的净光合速率(Pn)、PSⅡ最大光化学效率（Fv/Fm）和叶绿素含量（Chl）,并且转ZmMPK7基因株系能提高烟草叶片抗氧化酶活性,诱导抗氧化酶 (SOD、APX、CAT和POD)活性之间协调变化。与野生型相比,转基因烟草植株MDA含量及电解质外渗量较低,膜脂过氧化较轻,其耐盐性得到改善。     

小金海棠Fe3+-螯合还原酶MxFRO2基因启动子的克隆与表达分析

通过染色体步移法从小金海棠（Malus xiaojinensis）基因组中克隆了三价铁螯合还原酶（ferric chelate reductase, MxFRO2）基因翻译起始位点上游1 738 bp的启动子序列。生物信息学分析表明,该启动子片段中存在光响应元件G-box、生长素应答元件、铜元素响应元件、TATA-box、CAAT-box等顺式作用元件。从TAIR网站获得了拟南芥（Arabidopsis thaliana）中8个FRO基因上游的启动子序列,通过PlantCARE分析了其与MxFRO2启动子的异同。根据在线预测结果,克隆了翻译起始位点上游1 644 bp（MxFul）和259 bp（MxD1）两段序列,构建了其与GFP融合的瞬时表达载体,并将重组质粒通过PEG介导法分别转化拟南芥叶片原生质体,结果表明,小金海棠MxFul和MxD1两段启动子序列都能驱动GFP蛋白在拟南芥原生质体中的瞬时表达。     

龙眼成花逆转相关基因表达的cDNA-AFLP分析

摘要：以龙眼正常成花花芽和成花逆转花芽为试材,应用cDNA-AFLP技术,研究龙眼正常成花与成花逆转花芽cDNA的差异表达,并利用RT-PCR技术验证,探讨了龙眼成花逆转的分子机制。通过64对引物组合的cDNA-AFLP分析获得了2 560条扩增片段。选择其中有明显差异的片段进行回收、测序,获得了14条核苷酸序列。其中有13个片段在GenBank数据库中发现同源序列,1个功能未知。通过核酸和氨基酸比对分析,与龙眼成花逆转相关的112基因片段同源于银灰杨（Populus tremula x Populus alba）中编码Nek激酶家族(NIMA related protein kinases)基因（83 ％）, 331的核苷酸序列（80％）同源于与拟南芥（Arabidopsis thaliana）中编码内切-1,4-β-葡聚糖酶(EGases)的基因,313的核苷酸序列（78%）同源于与柑橘（Citrus sinensis）中的几丁质酶（chitinase CHI1）基因。     

光周期途径植物开花决定关键基因FT

随着分子生物学的快速发展,大量与光周期途径开花相关的基因已经被发现和克隆,FT（FLOWERING LOCUST）是光周期途径植物开花时间决定关键基因,并认为刀基因表达产物可能就是人们长期追寻的开花刺激物质,这种开花刺激物质经过叶片到茎尖的长距离运输,最终引起茎顶端开花起始。目前已在多种植物中分离出刀同源基因,并通过转基因证明刀基因的表达可促进植物提早开花。本文对国内外关于刀基因家族的研究进展进行综述,旨在为进一步深入研究刀基因功能提供参考。     

粤油7号花生AhNCED1基因启动子克隆及其活性分析

AhNCED1是干旱胁迫下花生中调控脱落酸（abscisic acid,ABA）生物合成的关键基因。本文采用基于PCR的基因组DNA步移法,从抗旱性强的粤油7号花生中克隆AhNCED1基因起始密码子ATG上游2392bp启动子序列,构建该启动子驱动报告基因GUS的植物双元表达载体pAhNCED1p∷GUS,转化野生型拟...     

Preparation and Structure Characterization of Carboxymethyl Corn Starch Under Ultrasonic Irradiation

To discover new synthesis technology and increase the degree of substitution (DS) of carboxymethyl starch (CMS), ultrasound‐modified CMS (U‐CMS) was successfully prepared under ultrasonic irradiation in the alkali condition with corn starch (CS) as the raw material, ethyl alcohol as the solvent, and monochloroacetic acid as the carboxymethylated reagent. The effects of ultrasound conditions (ultrasonic action sequence, ultrasonic radiation time, and ultrasonic power) and etherification time after ultrasonic irradiation on DS of U‐CMS were studied separately through single‐factor experiments. Meanwhile, the granule morphology, crystal type, and molecular structure of U‐CMS were studied by scanning electron microscopy (SEM), X‐ray diffraction (XRD), and Fourier transform infrared spectroscopy (FT‐IR). The results showed that DS of U‐CMS prepared under certain conditions (ultrasonic radiation time before alkalization, 40 min; ultrasonic radiation temperature, 35°C; ultrasonic power, 170 W; and etherification time, 180 min) improved 38.7% compared with that without ultrasonic radiation. The SEM, XRD, and FT‐IR results illustrated that crystal‐type change of the starch granule after ultrasonic irradiation was not obvious. However, the number of sunken points and holes on the granule surface increased, so that the specific surface expanded, which improved the carboxymethylation.     

Evolution of tetraploid wheat based on variations in 5′ UTR regions of Ppd-A1: evidence of gene flow between emmer and timopheevi wheat

Previous study showed that tetraploid wheat was divided into two groups (Type AI and Type AII) based on sequences around Ppd-A1 gene (Takenaka and Kawahara in Theor Appl Genet 125(5):999–1014, 2012). That study focused on domesticated emmer wheat and used only 19 wild emmer wheats, so could not be clear the evolutional relationship between Type AI and Type AII. Here, a total of 669 accessions comprising 65 einkorn wheats, 185 wild emmer wheats, 107 hulled emmer wheats, 204 free-threshing (FT) emmer wheats, and 108 timopheevii wheats were studied by PCR assay and DNA sequencing for Type AI/AII. Type AII was an older type than Type AI because all einkorn accessions had Type AII. In wild emmer, Type AI was distributed in the northeast regions of its distribution and Type AII was found to be centered on Israel. A total of 37.4 % of hulled emmer accessions were Type AI, while 92.2 % of FT emmer accessions were Type AI. Differences in the proportion of Type AI/AII in domesticated emmer suggested a strong bottle-neck effect. We also found two MITE-like sequence deletion patterns from a part of Type AII accessions (dic-del and ara-del). Dic-del was found from only Israeli wild emmer accessions and ara-del was found from almost all timopheevii wheat accessions. Only three timopheevii accessions did not have ara-del, and one wild emmer accession and ten hulled emmer accessions had ara-del. These accessions suggested gene flow between emmer and timopheevii wheat.     

油菜花发育同源异型基因BAP2的克隆及序列分析

拟南芥(Arapidopsis)同源异型基因AP2对花分生组织和花器官的发育具有重要的表达调控作用。根据AP2基因信息利用同源序列法分离了油菜(Brassicarapa)的AP2基因(BAP2,GenBank登陆号:AF941097),并且比较了正常油菜与无花瓣油菜BAP2基因序列的差异。研究结果表明,BAP2基因的DNA序列长度为2138bp,包含9个内含子,外显子区与AP2基因的同源性达90%以上;推导的氨基酸序列为433aa,具有完整的核定位信号区和高度保守的AP2结构域,推测与AP2基因具有相似的功能。正常油菜和无花瓣油菜的BAP2基因序列仅有2处碱基存在差异,这2处碱基均位于内含子区,推导的氨基酸序列则完全一致,因此初步认为白菜型油菜花瓣缺失突变与BAP2基因无关。     

燕麦AsKUP1的克隆与功能分析

植物钾离子转运蛋白中的Na~+不敏感性KUP/HAK/KT转运蛋白对植物耐盐胁迫起着重要作用。为了阐明钾离子转运蛋白基因AsKUP1在燕麦中响应盐胁迫的表达模式和鉴定其生物学功能,从燕麦中克隆了AsKUP1,利用RACE方法获得AsKUP1全长序列,并对其进行生物信息学分析;构建了pCAMBIA1301-AsKUP1植物过表达载体,转化拟南芥,并运用实时荧光定量PCR方法分析AsKUP1在拟南芥中的表达情况。结果表明,AsKUP1全长2 951bp,包含2 334bp的ORF序列,预测编码777个氨基酸,等电点为8.55,分子量为87.0k D。序列分析表明,AsKUP1与山羊草和小麦KUP/HAK/KT家族亲缘关系较近,预测该蛋白有14个疏水跨膜结构域,位于细胞质膜的概率较大。此外,盐胁迫下,T2转基因种子萌发率为57%,野生型为43%;经潮霉素筛选分离比为3∶1的2个转基因株系后代T3转基因株系根长分别是野生型的1.46倍和1.34倍,T3转基因植株鲜重、干重分别是野生型的1.56倍和1.44倍,Na~+含量无显著差异,而K~+含量为野生型的1.25倍,说明AsKUP1的表达提高了拟南芥植株的耐盐性。本研究结果为揭示钾离子转运蛋白家族基因AsKUP1在植物中的耐盐机制和通过转基因技术提高植物耐盐能力奠定了基础。     

毛叶苕子磷饥饿响应基因VvPHR1的克隆及功能研究

【目的】磷饥饿响应因子PHR (phosphate starvation response)在植物根系发育和磷养分吸收中起重要作用,本研究主要阐明毛叶苕子VvPHR1基因生物学功能,为培育磷高效型绿肥作物提供理论依据。【方法】通过转录组测序获得毛叶苕子VvPHR1基因序列。采用酵母单杂交方法验证VvPHR1基因的转录激活功能,构建其过表达载体,利用花粉管通道法分别遗传转化野生型和突变体(Atphr1)拟南芥,获得超量表达VvPHR1基因和突变体功能回补转基因材料。对正常磷(1 mmol/L Pi)和低磷(1μmol/L Pi)的培养基中生长30天的拟南芥取样,采用实时荧光定量PCR对野生型和转基因拟南芥中VvPHR1及下游磷转运基因的表达进行分析,并对转基因材料进行表型分析,测定其主根长、鲜重、总磷及无机磷(phosphate,Pi)含量。【结果】毛叶苕子转录组中有13个PHR基因,转录本129590、96227、120424与拟南芥的PHR1相似度最高,其中转录本120424在低磷诱导下表达量最高,将该转录本命名为VvPHR1基因。该基因cDNA全长1008 bp,编码335个氨基酸...