转基因棉花MON757转化体特异性PCR检测方法及应用

转基因棉花(Gossypium hirsutum)MON757转化体是孟山都公司研发的转cryIAc基因的抗虫棉,在美国、加拿大、澳大利亚等国被批准种植或允许用作食品饲料原料,但在我国尚未获得批准种植和应用.目前国内外尚没有转基因棉花MON757特异性的纯杂合检测和定量检测方法报道.为了检测我国棉花中MON757转化体的存在情况,本研究以转基因棉花MON757转化体的插入位点基因组序列和外源插入片段/基因组连接区序列为靶标,建立了特异性的MON757转化体纯杂合定性PCR检测方法和实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测方法.所建立的MON757转化体纯杂合定性PCR检测方法的检测引物由分别位于MON757外源基因插入位点两侧基因组和外源插入片段上的3条引物组成,能准确地鉴别棉花植株和种子中MON757转化体的纯合、杂合状态.建立的MON757转化体特异性的qRT-PCR检测方法具有良好的可重复性和灵敏度,其检测下限(limit of detection,LOD)为11个拷贝,定量下限(limit of quantitative,LOQ)为44个拷贝.用此方法对2014年湖北省的49份商品棉花种子进行了检测,结果有5份种子样品检测到MON757转化体.采用MON757转化体纯杂合定性PCR检测方法对这5份种子样品各60个单粒分别进行了检测,同时采用qRT-PCR检测方法对这5份种子样品进行定量测定.结果表明,有1份含量在1.5％左右,4份含量超过了20％,两种方法的测定结果基本一致.本研究建立的MON757转化体纯杂合定性PCR检测方法和qRT-PCR检测方法在田间棉花植株和种子中MON757转化体纯杂合状态的测定以及混合样品中MON757转化体含量的测定方面都具有重要的应用价值.     

转cry1Ac基因抗虫棉鄂杂棉1号的旁侧序列和品系特异性检测

为更好地了解我国转基因棉花的转化品系,建立快速准确的品系鉴别方法,本研究采用长链PCR、Genome Walking的方法解析转基因抗虫棉(Gossypium hirsutum L.)新转化品系鄂杂棉1号的整合结构和外源DNA整合的基因组旁侧序列.以旁侧序列为靶标,设计引物,对引物的筛选优化、特异性和灵敏度测试结果显示,建立的鄂杂棉1号品系定性PCR检测方法具有特异性,检测灵敏度为40个拷贝,相当于100 ng模板的0.1%.对市场的21个样品棉花样品检测,有3个样品检测出具有与"鄂杂棉1号"相同转化品系来源,表明本研究建立的品系特异性检测方法可应用于我国转基因棉花育种材料的鉴别和筛选.     

转基因大豆SHZD32-1转化体普通PCR和qRT-PCR检测方法的研究

转基因大豆(Glycine max)SHZD32-1是我国自主研发的耐除草剂大豆转基因品系,该材料将耐草甘膦基因G10-EPSPS导入栽培品种中豆32(Glycine Max,Zhongdou 32)使其获得耐除草剂抗性,具有广阔的应用前景。到目前为止,尚没有针对SHZD32-1的检测方法系统研究的报道。本研究以转基因大豆SHZD32-1转化体的插入位点基因组序列和外源插入片段/基因组连接区序列为靶标,通过设计和筛选引物、探针,特异性、灵敏度等测试,建立了特异性SHZD32-1转化体普通PCR和q RT-PCR检测方法。检测方法特异性实验中,普通PCR和q RT-PCR方法均只在含有SHZD32-1的样品中扩增出阳性结果,而其他不含有SHZD32-1的检测样品中均为阴性结果;方法灵敏性检测中,普通PCR检测法检出限为0.1%,q RTPCR法检测下限(limit of detection,LOD)为21个拷贝;方法稳定性实验中,普通PCR和q RT-PCR方法在其相应最低检出限浓度下进行60次重复试验,结果均为阳性。本研究建立的SHZD32-1转化体特异性PCR检测方法特异性好、灵敏度高、稳定性强。转基因作物转化体特异性检测方法的研究是转基因生物分子特征评价的重要内容之一,其为转基因生物安全监管和追溯提供了技术支持。     

实时定量PCR检测转基因水稻科丰6号插入拷贝数和转基因含量

建立转基因成分灵敏、准确的定量标识是实施转基因安全阈值管理的一个基本步骤,其中实时定量PCR技术是检测产品中转基因含量的主要技术方法。本研究利用该技术确定了双价(cry1Ac+CpTi)转基因抗虫水稻(Oryzasativa)科丰6号中有3个拷贝的外源基因插入。通过对外源基因Bt和转化事件特异的边界特异序列为对象的绝对定量和相对定量检测方法的研究,发现以边界特异序列为对象的事件特异性检测和以目的基因Bt为对象的检测都能够满足相对定量检测的要求。在100ng基因组DNA中,Bt基因和特异性检测的相对定量检测限分别为0.1%和0.5%,在绝对定量检测中,特异性检测的检测限为5个拷贝。不同检测方法对4个已知转基因含量的样品检测结果与预期均一致。结果表明,以转基因产品占总产品比例为定义的转基因含量的测定中,多拷贝或单拷贝基因为对象的不同定量方法的检测对转基因产品的相对定量结果没有影响,本研究对转基因产品的定量阈值设定具有一定的借鉴意义。     

转基因玉米pNK603质粒分子的构建与应用

随着转基因植物和相关产品的迅速发展,转基因检测相关标准物质的需求越趋紧迫,本文针对转基因玉米(Zea mays)NK603进行了质粒分子标准物质的构建和适应性研究.通过从转基因玉米NK603阳性材料中定性扩增转化体特异性片段(NK603-108bp)和玉米的内标基因片段(zSSIIb-151 bp),将得到的PCR产物酶切连接后构建到T载体上,经过酶切、PCR扩增和测序三重验证,得到了pNK603质粒分子.选用不同转基因作物的转化体特异性引物和内标准基因引物对构建的pNK603质粒分子的特异性进行检测,PCR结果显示除了特异性目的条带外,并未发现非特异性扩增.同时采用pNK603质粒分子和转基因玉米阳性基因组DNA作定量标准对已知含量的3个水平的转基因基体物质进行转基因含量测定,实时荧光定量PCR结果发现,两种标准所得到测定的数据没有达到统计学差异显著.T检验表明,PCR扩增效率、两种标准所产生的内源或外源基因的标准曲线的斜率和截距没有显著性差异.这些结果表明,pNK603质粒分子可以作为转基因玉米NK603转化体特异性的定性和定量检测用标准物质.     

转基因大豆GTS40-3-2转化事件特异性PCR检测

GTS40-3-2是抗草甘膦转基因大豆,为建立GTS40-3-2大豆转化体特异性PCR检测方法,本研究以GTS40-3-2标准品为实验材料,根据已公布转基因大豆GTS40-3-2基因与大豆基因组连接序列信息,利用Primer5.0软件设计了5对品系特异性引物,对每对引物进行了退火温度、特异性及扩增效率的PCR检测,结果显示,5对特异性引物均能够从GTS40-3-2中扩增出大小约279bp、238bp、470bp、490bp和257bp的预期产物,可用于特异性检测转基因大豆GTS40-3-2转化事件。以转基因大豆GTS40-3-2含量为5%、2%、1%、0.5%和0.1%的标准品进行PCR灵敏度检测,结果表明5对引物的检测灵敏度均能达到0.1%。通过荧光定量PCR对5对特异性引物的Ct值与溶解曲线比较,最后选择出RRS2引物对为转基因大豆GTS40-3-2品系特异性检测的最适引物。本文结果将为我国未来转基因生物产品成分检测提供科学合理的实验参考。     

转基因水稻Bt汕优63的整合结构和品系特异性定量PCR方法

为更好地监测转基因抗虫水稻(Oryza sativa L.)Bt汕优63品系的存在,满足转基因标识管理的要求,同时也为了解决阳性植物基因组DNA不容易获得的问题,本研究采用热不对称交互PCR(TAIL-PCR)、Genome Walking和长链PCR(LD-PCR)方法测定了基因枪转化的转cry1Ab/cry1Ac融合基因水稻品系Bt汕优63的外源插入DNA全序列,构建了含有Bt汕优63 3′旁侧和水稻内标基因gos9序列的标准质粒分子pMDBt63作为标准物质,建立了Bt汕优63实时荧光定量PCR方法.外源插入DNA全长9 818bp,位于水稻基因组10号染色体(AP008214)第5348630位,由8个来源于两个转化质粒的DNA片段组成,其中两个cry1Ab/cry1Ac表达框以正向串连的方式插入.gos9和3′旁侧两个定量标准曲线的相关系数(R2)分别为0.9997和0.9992,扩增效率(E)分别为98.05%和99.46%.每反应100 ng模板DNA的检测限(LOD)为10拷贝,定量限(LOQ)为100拷贝.此外,对已知5%和1%转基因含量的混合样品DNA进行定量检测,结果的平均值分别为4.98%和1.07%.结果表明标准质粒pMDBt63作为标准物质建立的定量方法可用于Bt汕优63的定量检测.     

DNA条形码与实时荧光定量PCR技术在铁皮石斛鉴定中的应用

为建立铁皮石斛准确、高效的鉴定体系,本研究以101份石斛属和蝴蝶兰属植物样品为试验材料,通过对比ITS、psbA-trnH、matK及rbcL基因在石斛属植物中的鉴定能力,筛选出ITS作为本研究最理想的DNA条形码。以ITS序列作为靶基因,设计铁皮石斛特异引物和特异探针,以及石斛属通用引物和探针,利用实时荧光定量PCR(TaqMan)技术,建立铁皮石斛多重实时荧光PCR检测新体系,通过特异性、灵敏度和实际样本验证,发现参试样品中的25份铁皮石斛均可被有效鉴定,与其他鉴定方法相比,该方法具有特异性强、灵敏度高(高出普通PCR 100倍)、重复性好且高效经济的优势。本研究结果对铁皮石斛的资源保护与利用起到了积极作用。     

洋葱腐烂病菌荧光定量PCR检测体系的建立

唐菖蒲伯克霍尔德菌洋葱致病型(Burkholderia gladioli pv.alliicola),是重要的植物病原细菌检疫性有害生物.本研究的目的是建立特异、灵敏、快速的TaqMan探针荧光定量PCR方法用于检测洋葱腐烂病菌(B.gladioli pv.alliicola).利用洋葱腐烂病菌保守基因序列设计和筛选特异性引物和TaqMan探针,优化PCR反应体系和反应条件.荧光定量PCR菌液检测灵敏度达到1.02×102 CFU/mL,DNA检测灵敏度达到1.73×10-4 ng/μL,反应时间仅需1h左右,对14种伯克氏菌属Burkholderia)参比菌种的特异性检测结果显示,洋葱腐烂病菌具有明显的扩增曲线生长,表明建立的荧光定量PCR体系具有非常高的特异性.同时对洋葱(Allium cepa)种子进行了模拟带菌检测,结果表明,建立的洋葱腐烂病菌荧光定量PCR检测体系能够检出模拟样品中的洋葱腐烂病菌,验证了检测体系的实用性.本研究建立的洋葱腐烂病菌荧光定量PCR检测体系能够有效用于洋葱腐烂病菌的鉴定,为进出口口岸和基层检验检疫部门提供了一种简便、快速、准确的洋葱腐烂病菌分子检测手段.     

山茶根结线虫的LAMP-LFD快速检测方法

为了提高检测效率,本研究利用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)扩增核酸,用横向流动试纸条(lateral flow dipstick,LFD)检测产物,建立了一种山茶根结线虫(Meloidogyne camelliae)的LAMP-LFD快速检测新技术.以山茶根结线虫核糖体DNA内转录间隔区(ribosomal DNA-intemal transcribed spacer,rDNA-ITS)为检测靶标,设计3对特异性引物进行生物素标记的实时荧光LAMP反应,优化后的LAMP扩增条件为63℃反应15 min.比较LFD、实时荧光曲线以及琼脂糖凝胶电泳等3种产物检测方法,结果表明,LAMP产物与异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的探针ITS-HP杂交5 min后即可在LFD上显色,从LAMP反应开始到LFD结果判断仅需25min,比常规PCR技术缩短约2h.LAMP-LFD技术能特异性地检测山茶根结线虫,对其基因组DNA的检测灵敏度为4 pg/μL,低于常规PCR方法100倍;对其单条2龄幼虫(J2)检测灵敏度为1/1 000条线虫.本研究建立的快速、灵敏、特异性LAMP-LFD检测技术可应用于山茶根结线虫的口岸检验.