黑龙江凉水自然保护区苏云金芽孢杆菌的收集与鉴定

黑龙江凉水自然保护区是我国现有保存下来的较大片原始红松林基地之一,总面积6394hm^2,森林覆盖率95％以上。本研究从小兴安岭凉水自然保护区采集土样782份,采用醋酸钠培养基结合高温方法筛选土壤中的芽孢杆菌,通过光学显微镜观察鉴定产生伴胞晶体的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis．Bt）。总计分离得到芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌分别为1735株和33株,Bt菌株的分离率和出菌率分别为1．90％和4．22％。利用SDS-PAGE和PCR—RFLP方法对筛选获得的成分离株进行了杀虫晶体蛋白和基因型分析,结果表明14株产菱形伴胞的＆菌株,SDS-PAGE电泳分析芽孢后期产生分子量大小130kD蛋白带,PCR-RFLP分析初步鉴定为crylAc基因,其它产圆形或其它不定形晶体蛋白的＆分离菌中,芽孢后期主要蛋白大小为20～150kD不等,PCR—RFLP方法鉴定结合PCR片段测序分析这些菌株含有新型cry4、cry39和cry40基因等。本研究是“中国助资源收鉴与利用”项目组成部分之一,凉水自然保护区苏云金芽孢杆菌的收集与鉴定目的是要对整个东北地区成资源分布和多样性作一个初步评估,实验结果表明东北森林地区具有丰富多样的威菌株和杀虫基因资源。     

苏云金芽孢杆菌基因组研究概况

迄今为止，全球已有2个Bt株菌株完成了全基因组测序，1个Bt菌株正在拼接中，15个Bt菌株正在进行测序中。已有22个晚质粒完成了全序列测定。助是作为生物农药使用最广泛的微生物菌株，也是最为成功地将其杀虫晶体蛋白基因应用于植物转基因的微生物。在基因组进化、新基因发现、基因表达调控等方面一直是科学家研究的热点，并取得了相当多的成果。本文概述了苏云金芽孢杆菌基因组测序现状、基因组特征及比较基因学等方面的研究进展。     

煤矿中苏云金芽胞杆菌(Bt)菌株的分离及其鉴定

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是一种已被广泛用于农业害虫生物防治的昆虫病原细菌。本研究从永春天湖山矿区采集的159份样品中分离出1株Bt,光学显微镜检测发现菱形伴孢晶体。以cry1/7/9、cry2、cry3、cry4/10、cry5、cry6、cry8、cry11和cry1I的通用引物对该Bt分离菌进行Cry毒素基因分析,利用SDS-PAGE和双向电泳-质谱法(2-dimensional electrophoresis/mass spectrometry,2-DE/MS)对Bt分离菌进行蛋白鉴定。结果表明,分离菌含有cry1基因型,经克隆、测序后可知,菌株中的cry1亚基因型与cry1Ac有极高的同源性。分离株表达的晶体蛋白约为130 k D,通过蛋白质谱分析表明,杀虫蛋白为Cry1Ac,与PCR-RFLP所得出的结果一致;通过质谱分析还鉴定出分子伴侣Gro EL、F0F1型ATP-β亚基合成酶、延伸因子Tu和丙酮酸脱氢酶。生物信息学分析结果表明,这些蛋白主要参与帮助新生肽的正确折叠、能源生产和转换,以及提高细胞的应激能力以抵御外界不良刺激。本研究从煤矿中分离鉴定出Bt菌,为发现新资源、新型杀虫蛋白基因以及利用微生物治理重金属污染提供基础资料。     

苏云金芽孢杆菌Cry1Ac杀虫晶体蛋白及其分子设计

Cry1Ac编码的杀虫晶体蛋白是苏云金芽孢杆菌（Bt）产生的多种杀虫晶体蛋白中对鳞翅目昆虫有很高毒性的蛋白。第一个Cry1Ac杀虫晶体蛋白最早在库斯塔克亚种HD73中以伴胞晶体形式分离获得,其编码区为3534bp,编码蛋白分子量为133kD,含1178个氨基酸,等电点为4.84。白此以来,Cry1Ac杀虫晶体蛋白结构、功能以及应用研究一直是Bt杀虫晶体蛋白研究的重要方向。本文介绍了苏云金芽孢杆菌中应用最广泛的Cry1Ac杀虫晶体蛋白家族的结构、功能及其基因分类,并进一步就基于苏云金芽孢杆菌Cry1Ac杀虫晶体蛋白的基因工程研究做了分析,提出了持续利用Bt Cry1Ac杀虫晶体蛋白的一些见解。     

海南岛热带雨林区芽孢杆菌收集及Bt菌鉴定

本研究系统地对海南岛热带雨林自然保护区进行了土壤样品的采集、芽孢杆菌的分离收集和Bt菌株的鉴定。从尖峰岭热带雨林区、五指山热带雨林区、吊罗山热带雨林区、霸王岭热带雨林区总共采集了土壤样品1882份,采用醋酸钠培养基结合高温方法分离出芽孢杆菌3924份,鉴定出Bt分离株158份,Bt菌株的分离率和出菌率分别为4.03％和8.40％。结果分析表明,海南岛热带雨林区芽孢杆菌及Bt菌株分布对环境和生态表现出一定的规律性,一般海拔900m至1400m的反菌株含量高、植被覆盖率高,土壤腐殖质含量高的热带沟谷雨林带眈菌株含量最高。显微观察发现,获得的Bt菌株其伴胞晶体有菱形、球形、方形、椭球形、不定性等多种形状。利用SDS-PAGE方法对获得的Bt分离株进行了伴胞晶体进行分析,发现伴胞晶体的分子量有20kD到150kD不等。进一步利用PCR-RFLP技术对Bt分离株进行了cry基因型的分析,初步发现这些Bt菌株含有cry1、cry3、cry4、cry6、cry30、cry40等基因型。我们还利用鳞翅目昆虫小菜蛾和鞘翅目昆虫椰心叶甲进行部分Bt分离株的生物测定,初步结果显示本研究鉴定出的Bt分离株具有不同的抗虫靶标,对同一靶标昆虫也表现出不同的杀虫活性。整体而言,本研究结果显示出海南岛热带热带雨林自然保护区因其独特的热带地理生境、自然的生物演化系统,使得热带雨林区蕴藏了Bt菌株资源多样化,值得期待挖掘出一些新的菌株和新的基因资源。     

苏云金杆菌营养期杀虫蛋白vip3A-LS1基因的克隆与表达

从土壤中分离得到营养期对鳞翅目害虫高毒的Bt LS1菌株。分子检测菌株中存在营养期杀虫蛋白基因，进行了该基因的克隆表达。设计全长基因引物扩增得到了约2.3kb的靶片段；克隆序列分析证实为新Vip3A基因，命名为Vip3A-LS1，GenBank登录号DQ016968，Bt基因命名委员会命名为Vip3Aa22。该基因推导蛋白与其它已知同源蛋白8个氨基酸不同。构建vip3A-LS1基因的表达载体，SDS-PAGE检测约88kD目的蛋白大量表达；生物测定表明，胞内可溶性蛋白对棉铃虫和甜菜夜蛾活性最高。纯化蛋白对初孵棉铃虫和甜菜夜蛾的LC50分别为73.6和32.2µg/g。     

苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白vip3A-LS1基因的克隆与表达

从土壤中分离得到营养期对鳞翅目害虫高毒的苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)LS1菌株,分子检测该菌株中存在营养期杀虫蛋白基因,进行了该基因的克隆和表达。设计全长基因引物扩增得到了约2.3kb的靶片段,序列分析证实为新vip3A基因,命名为vip3A-LS1,GenBank登录号为DQ016968,Bt基因命名委员会命名为Vip3Aa22。该基因推导蛋白与其它已知同源蛋白有8个氨基酸不同。构建vip3A-LS1基因的表达载体,SDS-PAGE检测约88kD目的蛋白大量表达;生物测定表明,胞内可溶性蛋白对棉铃虫(Helicoverpa armigera)和甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)活性最高。纯化蛋白对初孵棉铃虫和甜菜夜蛾的LC50分别为73.6和32.2μg/g。     

苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白VIP3研究进展

营养期杀虫蛋白（vegetative insectcidal protein,VIP）是由苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）在营养生长指数中期至稳定期期间分泌产生的一类新型杀虫因子,分为VIP1、VIP2和VIP3三种,以VIP3的研究最为深入。VIP3A对鳞翅目害虫具广谱杀虫活性,可作用于敏感昆虫中肠上皮细胞刷状缘膜囊致离子通道的形成,杀虫活性达纳克级水平。利用Bt ICPs不同启动子与vip3基因重组可提高VIP3蛋白的表达量和稳定性。转vip3基因植物也已有构建成功的报道。本文从VIP3的类型和杀虫活性、作用机理、vip3基因的定位和分离、vip3基因重组和转vip3基因植物等方面详细介绍了VIP3近十年来的研究进展。     

转Bt cry1Ah基因抗虫玉米的获得及其遗传稳定性分析

Btcry1Ah基因是从国内苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）分离株BT8中克隆鉴定的新型杀虫蛋白基因。研究利用该基因构建了植物表达载体pHUAh,用基因枪法转化玉米杂交组合Q31×Z31的胚性愈伤组织,得到13株阳性转基因玉米（Zea mays L.）植株。通过生物活性分析筛选得到了2个高抗转基因事件B1-1和B1-7,对其T1～T5代转基因植株进行了5代跟踪检测,结果表明,外源基因在玉米植株可以稳定表达,并且可以逐代稳定遗传。利用ELISA对不同转化事件以及同一转化事件不同组织部位的Cry1Ah蛋白的表达量进行分析,发现该基因在不同转化事件之间以及同一转化事件不同组织部位表达量都存在差异。对T2～T5代转基因植株田间虫测结果显示,转基因玉米对亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）具有显著的抗性,且逐代稳定遗传。B1-1和B1-7有望成为Bt抗虫玉米育种工作的备选材料。     

Btk杀虫蛋白在红壤和棕壤中的吸附热力学研究

采用平衡吸附法测定了苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种(Btk)蛋白在红壤和棕壤中的吸附等温线,并依据等温线进行了吸附平衡常数和热力学参数计算。在278K～318K范围内,Bt杀虫蛋白在红壤和棕壤中的吸附等温线符合Langmuir方程(R2>0.994 1),随着吸附温度升高,Bt杀虫蛋白的吸附量和吸附平衡常数下降,而吸附分离因子RL升高。红壤吸附Bt蛋白的RL值在0.218 1～0.580 1之间,棕壤吸附Bt蛋白的RL值在0.361 7～0.754 1之间,均属于优惠吸附。Bt杀虫蛋白在红壤和棕壤中的吸附是一个自发、放热、熵增过程,红壤吸附Bt杀虫蛋白的活化能在13.43～14.78 kJ mol-1之间,棕壤吸附Bt蛋白的活化能在10.89～11.47 kJ mol-1之间。随着温度升高,活化能和吸附自由能绝对值变大,提示土壤对Bt杀虫蛋白的吸附由物理吸附向化学吸附转变。     

Call for Papers--Bt Research （ISSN 1925-1939）

Bt Research （ISSN 1925-1939） is a new launched, open access and peer-reviewed journal that disseminates significant creative reviews and opinions or innovative research work in the area of Bacillus thuringiensis, including the isolation and identification of novel Bt strains, identification of novel Bt toxic genes and their functions, the insecticidal mechanism Bt toxics, Bt genetic engineering, transgenic Bt plants, the resistance mechanism of target-insect to Bt toxins, and the development of novel experimental methods and techniques for Bt Research.     

Impacts of Bt transgenic cotton on integrated pest management

Transgenic cotton that produced one or more insecticidal proteins of Bacillus thuringiensis (Bt) was planted on over 15 million hectares in 11 countries in 2009 and has contributed to a reduction of over 140 million kilograms of insecticide active ingredient between 1996 and 2008. As a highly selective form of host plant resistance, Bt cotton effectively controls a number of key lepidopteran pests and has become a cornerstone in overall integrated pest management (IPM). Bt cotton has led to large reductions in the abundance of targeted pests and benefited non-Bt cotton adopters and even producers of other crops affected by polyphagous target pests. Reductions in insecticide use have enhanced biological control, which has contributed to significant suppression of other key and sporadic pests in cotton. Although reductions in insecticide use in some regions have elevated the importance of several pest groups, most of these emerging problems can be effectively solved through an IPM approach.     

AcMNPV chiA基因表达产物对棉铃虫围食膜的破坏及对Bt和NPV的增效作用研究

采用PCR方法扩增出苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV）几丁质酶基因（chiA）编码区1.6kb全长片段,并将该片段分别克隆至原核表达载体pET30a和杆状病毒Bac to Bac表达系统转移载体pFastBac中,分别在大肠杆菌（E. coli）BL21(DE3)和草地贪夜蛾细胞系Sf-9中进行了表达。SDS-PAGE分析表明,在大肠杆菌和昆虫细胞中均有效表达了60kDa的蛋白。将表达产物饲喂5龄棉铃虫幼虫后取其围食膜,扫描电镜结果显示,围食膜结构遭到破坏形成大量孔洞。生物测定结果表明,以上两种表达产物对Bt和NPV均具有增效作用。以AcMNPV ChiA在大肠杆菌和细胞系Sf-9中的表达产物分别与Bt Cry2Ac蛋白混合饲喂棉铃虫幼虫,增效率分别为33.4％和54.5％,其LT50较对照处理分别缩短了17.8h和20.6h;当AcMNPV ChiA在大肠杆菌和细胞系Sf-9中的表达产物分别与甘蓝夜蛾核型多角体病毒（MbNPV）混合处理棉铃虫幼虫时,其LT50与对照比较分别缩短了16.6h和22.4h。     

Rapid digestion of Cry34Ab1 and Cry35Ab1 in simulated gastric fluid

Two genes were identified in Bacillus thuringiensis Berliner (Bt) that code for the proteins that comprise a Cry34Ab1/Cry35Ab1 binary insecticidal crystal protein. Maize, Zea mays L., plants have been transformed to express the Cry34Ab1/Cry35Ab1 proteins, and as a result, these plants are resistant to attack by western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera LeConte, a major pest in the Midwestern corn-growing area of the U.S.A. As part of the safety assessment for the proteins, digestibility studies were conducted. Digestion experiments with both proteins demonstrated rapid degradation in simulated gastric fluid, comparable to other registered plant-incorporated protectants. Quantitative and qualitative approaches for determining digestibility are illustrated.     

AcMNPV chiA基因表达产物对棉铃虫围食膜的破坏及对Bt和NPV的增效作用

采用PCR方法扩增出苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcMNPV)几丁质酶基因(chiA)编码区1.6kb全长片段,并将该片段分别克隆至原核表达载体pET30a和杆状病毒BactoBac表达系统转移载体pFastBac中,分别在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)和草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞系Sf-9中进行了表达。SDS-PAGE分析表明,在大肠杆菌和昆虫细胞中均有效表达了60kD的蛋白。将表达产物饲喂5龄棉铃虫(Helicoverpa armigera)幼虫后取其围食膜,扫描电镜结果显示,围食膜结构遭到破坏形成大量孔洞。生物测定结果表明,以上两种表达产物对苏云金芽孢杆菌(Bt)和核型多角体病毒(NPV)均具有增效作用。以AcMNPVChiA在大肠杆菌和细胞系Sf-9中的表达产物分别与BtCry2Ac蛋白混合饲喂棉铃虫初孵幼虫,增效率分别为33.4%和54.5%,其LT50较对照处理分别缩短了17.8和20.6h;当AcMNPVChiA在大肠杆菌和细胞系Sf-9中的表达产物分别与甘蓝夜蛾(Mamestra brassica)核型多角体病毒(MbNPV)混合处理棉铃虫初孵幼虫时,其LT50与对照比较分别缩短了16.6和22.4h。     

Comparing conventional and biotechnology-based pest management

Pest management has changed dramatically during the past 15 years by the introduction of transgenes into crops for the purpose of pest management. Transgenes for herbicide resistance or for production of one or more Bt toxins are the predominant pest management traits currently available. These two traits have been rapidly adopted where available because of their superior efficacy and simplification of pest management for the farmer. Furthermore, they have substantially reduced the use of environmentally and toxicologically suspect pesticides while reducing the carbon footprint of pest management as reduced tillage became more common, along with fewer trips across the field to spray pesticides. The most successful of these products have been glyphosate-resistant crops, which cover approximately 85% of all land occupied by transgenic crops. Over-reliance on glyphosate with continual use of these crops has resulted in the evolution of highly problematic glyphosate-resistant weeds. This situation has resulted in some farmers using weed management methods similar to those used with conventional crops. Evolution of resistance has not been a significant problem with Bt crops, perhaps because of a mandated resistance management strategy. Transgenic crops with multiple genes for resistance to different herbicides and resistance to additional insects will be available in the next few years. These products will offer opportunities for the kind of pest management diversity that is more sustainable than that provided by the first generation of transgenic crops.     

苏云金芽孢杆菌菌剂对棉花根际土壤细菌数量及多样性的影响

采用稀释平板培养法与PCR-DGGE技术, 以阿维菌素为阳性对照, 水为阴性对照, 研究了大田喷施推荐剂量(0.1 kg·hm^-2)和高剂量(10 kg·hm^-2)苏云金芽孢杆菌(Bt)菌剂对棉花根际土壤细菌种群数量及结构的影响。结果表明, 喷雾处理后1~3 d, 不同处理组土壤细菌数量间无显著性差异, 在3 d时细菌数量均值达到最大, 之后开始下降, 12 d后清水对照、推荐剂量Bt菌剂、高剂量Bt菌剂处理组土壤细菌数量均值维持在4.0×107 CFU·g^-1左右; 推荐剂量Bt菌剂处理样品土壤细菌数量在6 d时显著高于清水对照, 其余时间与清水对照间无显著性差异; 高剂量Bt菌剂处理与清水对照在整个试验期间均无显著性差异; 阿维菌素处理组土壤细菌数量在0~6 d内与清水对照无显著性差异, 而在12~45 d内显著低于其他3个处理组。DGGE图谱显示, Bt菌剂处理对棉花根际土壤17种细菌均无显著抑制作用。聚类分析结果表明, Bt菌剂对土壤细菌群落结构的扰动在12 d后得到恢复。与阴性对照组相比, Bt菌剂对土壤细菌多样性指数无显著影响, 而阳性对照阿维菌素对土壤细菌种群消长和多样性指数有较强的影响。对DGGE图谱中17条电泳条带的序列分析, 证明棉花根际土壤中存在起固氮作用的慢生根瘤菌属细菌和具有污染修复与净化活性的鞘脂菌属、鞘氨醇单胞菌属和红球菌属细菌。Bt菌剂与阿维菌素处理均对这些土壤有益菌群无明显不利影响。总体结果表明, Bt菌剂无论是在正常推荐剂量下还是在较高剂量(推荐剂量的100倍)下使用, 对棉花根际土壤微生态环境产生的冲击都较小, 是一种生态安全性较高的生物农药。