基于PCR的SSR标记分离方法综述

SSR分子标记是目前应用最广泛的第二代共显性分子遗传标记。SSR标记具有物种特异性,要应用该方法需要提前开发相应物种的特异SSR标记,而获得微卫星标记的经典方法是通过构建基因组片段文库和特殊标记SSR探针杂交法获取,这些方法经济成本相对较高且耗时耗力。近年来,该领域的研究中积累了很多研究成果和技术改进,发展起来几种基于PCR简便易操作且节约成本的SSR标记分离方法,例如基于RAPD的微卫星分离方法、基于ISSR抑制PCR扩增法、序列标签微卫星分析法、选择性扩增微卫星分析法以及荧光ISSR-PCR分离微卫星和微卫星扩增文库法等。本文主要对这些方法逐一进行综述,旨在为各个物种SSR标记的开发提供参考。     

水稻条纹病毒北京双桥(RSV-SQ)分离物RNA4片段序列分析

对我国水稻条纹病毒（Ｒｉｃｅ ｓｔｒｉｐｅ ｖｉｒｕｓ,ＲＳＶ）北京双桥（ＲＳＶ－ＳＱ）分离物ＲＮＡ４片段进行克隆及测序,结果表明ＲＮＡ４全长为２１５７ｂｐ。序列同源性比较发现,在核苷酸水平上,ＳＱ分离物与Ｔ、Ｍ及ＣＸ分离物的ｖＲＮＡ４ＯＲＦ同源性分别为９８．３％、９８．３％和９６．１％,ｖｃＲＮＡ４ＯＲＦ的同源性分别为９８．１％、９７．８％和９４．０％,ＲＮＡ４ＩＲ的同源性分别为９４．８％、８９     

鸭微卫星标记的筛选及其遗传多样性分析

采用磁珠富集法从AFLP片段中筛选微卫星标记,并对5个福建地方鸭品种的遗传多样性进行检测。基因组DNA用EcoRⅠ/MseⅠ内切酶酶切的同时与接头连接,酶切连接产物与用生物素标记的探针杂交,应用磁珠捕获100~2000bp含有微卫星序列的DNA片段并通过pGEM-T载体转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞中,构建富集微卫星序列的基因组文库。随机挑选46个阳性克隆,测序获得14条含有微卫星的DNA序列并递交到GenBank（登录号：FJ599499~FJ599512）。设计合成14对微卫星引物,通过PCR优化从中选择5对引物用于5个福建地方鸭品种的遗传多样性分析。结果显示,5对微卫星引物共检测到31个等位基因,各微卫星基因座的有效等位基因数为1.969 7~2.834 4,多态信息含量和杂合度的平均值分别为0.5133和0.7480,遗传多样性丰富,说明磁珠富集法适合用于鸭微卫星标记的分离与筛选,筛选得到的5个微卫星位点可作为有效的遗传标记用于福建省地方鸭品种遗传多样性的研究。     

黄颡鱼微卫星标记筛选及特征分析

通过磁珠富集法首次筛选黄颡鱼微卫星标记并对其特征进行分析。用生物素标记的寡核苷酸探针(AC)8、(CT)8、(AT)7、(GATA)8、(GATT)7进行微卫星片断的富集,挑选部分阳性克隆测序获得38个含有微卫星的DNA序列,总计设计并合成了22对微卫星引物。以普通黄颡鱼基因组DNA为模板,进行PCR扩增,结果筛选出18个多态性微卫星标记,每对引物等位基因数2-8个（平均3.78）,遗传杂合度0.2225-0.8101（平均0.5755）,多态信息含量0.3425-0.7900（平均0.5336）。此外18对多态性微卫星引物中有16对在黄颡鱼属其它4种鱼类具有通用性,13对在鲇形目中的3种鱼类具有通用性。因此,可以推断筛选的多态性微卫星标记可用于黄颡鱼属和鲇形目鱼类的遗传分析。     

磁珠富集法筛选白鲢的微卫星分子标记

通过磁珠富集法筛选白鲢（Hypophthalmichtys molitrix）的微卫星分子标记.从血液中提取白鲢大片段基因组DNA,限制性内切酶Sau3AI部分消化,使大部分片段介于400～900bp,低熔点琼脂糖凝胶回收.在筛选的基因组片段上连接1个20bp的双链接头,构建白鲢全基因组PCR文库,用生物素标记的微卫星探针（CA）15进行筛选,磁珠富集含有微卫星序列的DNA片段,获得含有微卫星的单链序列;将这些序列通过PCR扩增,连接pGEM-T载体,转化入感受态大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α,得到一个微卫星序列文库;又经同位素标记的微卫星探针（CA）15进行第2次筛选,获得149个阳性克隆,经测序分析,获得微卫星序列138个,这可用引物设计软件PrimerPremier 5.0设计引物81对.     

RAPD分子标记应用于斑茅分类的研究

用斑茅（ＳａｃｃｈａｒｕｍａｒｕｎｄｉｎａｃｅｕｍＲｅｔｚ）及甘蔗属（ＳａｃｃｈａｒｕｍＬ．）、蔗茅属（ＥｒｉａｎｔｈｕｓＭｉｃｈｘ）的几个种进行ＲＡＰＤ标记，试验结果表现出较好的重演性。进而通过计算遗传相似系数进行聚类分析。认为斑茅不宜列在甘蔗属，而应该划入蔗茅属或另立新属。     

甜菜黑色焦枯病毒核酸特性,RNA2的cDNA克隆和部分序列分析

以感染甜菜黑色焦枯型病毒新疆及宁夏分离物的苋色藜为材料提纯病毒，提取其ＲＮＡ，经琼脂糖凝胶电泳后分别回收不同的ＲＮＡ组分，以不同组合接种苋色藜，证实新疆分离物ＲＮＡ１能单独侵染并复制，但ＲＮＡ２组分必须依赖ＲＮＡ１才能完成其侵染和复制过程。同时发现，宁夏分离物ＲＮＡ可以代替新疆分离物ＲＮＡ１支持ＲＮＡ２的复制。通过核酸酶保护试验和对ＢＢＳＶ新疆及宁夏分离物ｃＤＮＡ标记探针与两者的ＲＮＡ进行的Ｎｏｒ     

小麦RIL群体SSR标记偏分离的遗传分析

以普通小麦3338与斯卑尔脱小麦Altgold杂交得到的F6代重组近交系群体为材料，筛选出334个（271个SSR和63个EST-SSR标记）多态性标记，以此为基础构建了一个包含287个分子标记的遗传图谱。对这些多态性标记进行偏分离分析发现82个表现为偏分离（P＜0.05），其中70个可以定位到遗传连锁图谱中。这些偏分离标记中有33个标记位点偏向母本3338，占40.2%，49个标记位点偏向父本Altgold，占59.8%。这些偏分离标记在图谱上的分布有两种：成簇分布和孤立位点的偏分离。在5条不同染色体上发现6个偏分离热点区域，这些偏分离热点区域的形成可能与配子体选择有关。     

小麦杂种优势群研究III普通小麦和斯卑尔脱小麦微卫星分子标记遗传差异的研究

选用１５份我国不同生态区的普通小麦品种（系）及９份不同国家的斯尔脱小麦品种（系）,利用微卫星分子标记对小麦种间,品种（系）间遗传差异进行了研究,探讨扩大杂交小麦育种亲本遗传基础的途径。所利用的１８对微卫星引物的２４份材料中均有搁增产物,共扩增出分子量小于５００ｂｐ的条带４９５条,其中４６８条带（占９６．７８％）具有多态性,平均每个引物可拉增出２６．６条多态性带。研究发现,９份斯卑尔脱小麦微卫星多态     

松树、杨树及桉树表达基因序列微卫星比对分析

微卫星是生物基因组中变异频率最快的序列,结构基因中微卫星重复数的变化会引起基因的框移突变,导致基因表达完全不同或截短的蛋白。因此在进化过程中,基因区微卫星会受到强烈选择的影响。为研究基因区微卫星在不同树种中的变化情况,在本研究中,利用SPUTNIK程序分析了NCBI数据库中松树（Pinus spp.）、杨树（Populus spp.）及桉树（Eucalyptus spp.）的表达序列标签（express sequence tag,EST）序列各3万条。结果显示,桉树和杨树EST序列含有微卫星的比例比较接近,分别为18.7%和15.3%,而在松树中则发生了较大分化,只有8.2%。研究发现,三碱基重复单元是这3个树种编码序列中微卫星的主要重复类型。除三碱基重复微卫星外,桉树和杨树EST序列中其它类型微卫星的丰度随着重复单元长度的增加而减少,而在松树中则呈相反现象。同时值得注意的是松树EST序列中变异频率快的微卫星（〉20bp）数量明显比桉树及杨树少。研究还发现,3个树种中微卫星获得或丢失重复单元的速率都随着重复单元的增加而降低。本研究首次报道了不同树种基因区微卫星比较研究,发现了一些松树与杨树、桉树相比较EST序列中所含微卫星在丰度及变异频率方面存在的异同。基因所含微卫星序列对基因的功能有重要影响,本研究的结果将为了解不同树种中基因区微卫星的特征提供重要参数,同时也将为利用所研究树种的EST序列开发多态性高的微卫星标记提供有益的生物信息学参考。