用彗星试验检测土壤污染对蚯蚓活体基因损伤

彗星试验,又称单细胞凝胶电泳,因其能够在单细胞水平上灵敏地检验DNA链断裂,成为研究遗传毒性效应的新技术,近年来得到重要应用。比较而言,如何利用该技术来检验土壤无脊椎动物活体基因损伤的报道则很少。本研究以丝裂霉素C(MitomycinC)为遗传毒性阳性物质,研究了用彗星试验检验赤子爱胜蚓(Eiseniafoetida)活体基因损伤的实验方法,对尾长、“彗尾”DNA含量和尾矩三个指标定量表达实验结果的敏感性进行讨论,并以污水灌溉土壤样品为例研究了污染土壤导致的蚯蚓体内DNA单链断裂。结果表明,采用彗星试验检测蚯蚓体内DNA单链断裂的基因损伤效应可以作为生物效应标志终点,尾矩和尾长作为敏感指标可以更好地表达遗传毒性物质基因损伤的剂量-效应关系。     

快速分析DNA损伤成为可能

ScienceDaily——人体DNA一直受到各种有害物质的损伤。从老龄化、遗传性疾病到癌症,DNA损伤和细胞修复能力损伤对我们的健康具有重要而广泛的意义。然而,研究DNA损伤所用的工具相当有限,但麻省理工学院的研究人员开发出一种快速分析DNA损伤的新工具,这可能对人体健康产生影响。     

异养氨氧化细菌基因组DNA的检测方法比较

氨氧化细菌是参与土壤氮素循环的重要微生物类群之一,其基因组DNA提取质量的准确分析,可直接影响后续分子实验的可行性和精确性。本试验针对3株异养氨氧化细菌的纯培养菌株,应用琼脂糖凝胶电泳、微量紫外分光光度计和Qubit荧光计分别检测不同提取方法获得的基因组DNA的浓度,同时结合细菌通用引物扩增16S r DNA全长来判定提取DNA的质量,进而筛选出可用于检测可培养氨氧化细菌基因组DNA浓度的方法。研究结果表明,针对不同浓度的DNA样品,尽管3种检测方法获得的结果表现出明显差异,但在16S r DNA-PCR中均仍能获得良好的扩增结果。与微量紫外分光光度法相比,Qubit方法对基因组DNA浓度的检测结果更为精确,特别在低浓度DNA检测中,能够较真实的反映基因组DNA的实际情况。     

植物DNA错配修复缺陷及其对诱变育种的意义

DNA错配修复(MMR)是DNA损伤修复的一个重要途径,主要司职于DNA合成、遗传重组及损伤过程中新发生的单个及少数碱基的缺失、插入及错配的修复,对维持基因组稳定性和DNA复制保真度至关重要。原核生物的MMR系统主要由MutS、MutH和MutL组成,在高等植物中也鉴定出MutS和MutL的同源物,但未发现MutH。本文介绍了近年来有关植物DNA错配修复及相关基因功能的研究进展,探讨了植物MMR功能缺陷产生的途径及其对植物诱变育种的意义,为进一步利用MMR缺陷突变体进行植物诱发突变与诱变育种研究提供借鉴。     

铀胁迫对大豆幼苗细胞DNA损伤的彗星试验研究

通过室内培养方法,用八氧化三铀配制浓度为100、200、400、600、800、1000μmol·L^-1的6种铀溶液和对照组培养大豆幼苗,采用彗星试验研究了铀胁迫对大豆幼苗细胞DNA的损伤情况。结果表明,铀溶液能对大豆幼苗细胞DNA造成损伤;配制的6种浓度的铀溶液均对大豆幼苗根部细胞DNA造成损伤,其中浓度为800和600μmol·L^-1的铀溶液对大豆幼苗根部细胞DNA的损伤最严重;铀浓度为1000μmol·L^-1的铀溶液对大豆幼苗茎部细胞DNA的损伤最严重;配制的6种浓度的铀溶液对大豆幼苗叶部细胞DNA的损伤不明显。     

莫能菌素对蚯蚓（Eisenia fetida）活体DNA的损伤研究

通过单细胞凝胶电泳实验研究了不同浓度莫能菌素暴露对赤子爱胜蚓（Eisenia fetida）体腔细胞DNA的损伤,结果显示,50mg.kg-1莫能菌素处理组尾部DNA含量值最大、尾长值最大、Olive尾矩值最大,分别为34.539%、107.736μm和29.354;随着莫能菌素暴露剂量的增加,尾部DNA含量、Olive尾矩和尾长损伤频率增加;尾部DNA含量对莫能菌素暴露最为敏感,对照组和各处理组的尾部DNA含量之间均存在显著性差异（P〈0.05）;对照组与15、25、50 mg.kg-1处理组的Olive尾矩和尾长损伤频率之间均存在显著性差异（P〈0.05）;暴露浓度与尾部DNA含量、Olive尾矩和尾长具有良好的剂量-效应关系（P〈0.05）。实验结果表明,蚯蚓体腔细胞DNA损伤可作为指示莫能菌素影响的生物标志物,彗星试验是检测莫能菌素暴露对赤子爱胜蚓活体基因损伤的有效手段。     

SCGE技术检测镉对大弹涂鱼外周血细胞DNA损伤

本研究以大弹涂鱼为实验材料，采用SCGE技术并对该技术中通过对缓冲液、铺胶方法、裂解液及不同解旋时间的优化来检测镉对大弹鱼外周血细胞DNA的损伤作用。结果表明，染毒后镉使大弹涂鱼外周血细胞均出现了拖尾现象，经过筛选，采用Ringer’s缓冲液、“三明治”式铺胶法、裂解液C、40min解旋时间进行实验效果最好。通过优化SCGE条件所得结果来看，本研究提高了SCGE对大弹涂鱼血细胞DNA损伤的检测效率，为SCGE技术间接作为水环境监测的有效工具提供更多的方法学参考。     

基于锁式探针技术的番茄病原细菌DNA芯片快速检测技术

研究了番茄上番茄溃疡病菌、番茄细菌性叶斑病菌和番茄青枯病菌3种细菌的基于锁式探针扩增技术的DNA芯片检测方法。在锁式探针扩增方式上,选择连接酶依赖的PCR扩增,并用荧光素Cy3对扩增产物进行标记,结合DNA芯片技术进行研究,建立基于锁式探针技术的DNA芯片检测方法。结果显示,该方法能从供试的10菌株中分别检测出番茄上3种病原物;基于锁式探针技术的DNA芯片检测方法特异性强,在供试的菌种中,只有靶标细菌能被特异性地检测到,其他菌株检测均为阴性;基于锁式探针技术的DNA芯片检测方法灵敏度高,最低检测DNA浓度为500 fg/μL,比常规PCR检测灵敏度高出1个数量级;混合锁式探针与混合DNA的DNA芯片检测,能特异地检出靶标菌,适合口岸番茄种子的多病原高通量检测。     

染色质改构因子BRG1降低UV照射引起的细胞凋亡

生命体的遗传物质基础是DNA分子,多种因素可以作用于细胞内的DNA分子,导致多种类型的DNA损伤。若受损的DNA得不到及时和有效的修复,细胞将走向凋亡或发生变异。染色质改构复合物（chromatin remodeling complex）在基因表达调控和DNA复制等方面扮演着重要角色。依赖ATP的染色质改构复合物SWI/SNF的核心亚基Brahma Related Gene1（BRG1）在染色质结构调整和基因转录调控等多个细胞进程中具有重要作用,仅有有限的文献报道BRG1参与到DNA的损伤修复过程。因此,进一步研究与验证BRG1在调控DNA的损伤修复进而挽救细胞凋亡中的作用十分重要。本文通过利用不同强度的UV照射检测细胞凋亡的情况,初步建立了DNA损伤修复的实验体系。将BRG1表达质粒瞬时转染到SW13（BRG1-/-）细胞系中,并利用30J/m2的UV照射,分别在0h、6h和24h检测细胞早期凋亡程度。结果表明,SW13（BRG1-/-）细胞中瞬时表达BRG1可以明显降低由UV照射引起的细胞凋亡,其中UV照射后24h的细胞表现最明显。我们进一步在HeLa细胞中通过瞬时表达BRG1验证了上述结果。由于BRG1通过染色质改构在基因的转录调控、复制和重组等方面起着重要的作用,我们推测BRG1可能通过染色质改构参与了DNA的损伤修复过程,进而影响了细胞凋亡。     

不同金属辅基和酶剂量对超氧化物歧化酶抗氧化、促氧化作用的影响

研究含不同类型金属辅基(Mn或Cu,Zn)的超氧化物歧化酶(SOD)的抗氧化/促氧化作用特征,以及酶剂量对其抗氧化/促氧化作用的影响。用化学发光法分析超氧化物歧化酶对由Fenton体系产生的羟基自由基(.OH)导致DNA氧化损伤的影响。进一步利用.OH所致质粒DNA氧化后在琼脂糖凝胶电泳中的构型改变为实验模型,比较不同类型金属辅基和剂量对SOD抗氧化/促氧化活性的影响。Mn-SOD对.OH引起的DNA氧化损伤没有显著影响。然而,Cu,Zn-SOD在较高浓度(>200 U/ml)下,表现出强烈的促氧化效应,能够加剧DNA氧化损伤。研究结果表明,金属辅基对SOD的抗氧化或促氧化效应有着重要的影响,这可能与金属辅基在Fenton反应中的氧化还原特性相关。高浓度的Cu,Zn-SOD对.OH所致DNA氧化损伤存在显著的促氧化效应。高浓度的Mn辅基离子不能与Fenton体系中H2O2直接作用,并且不能促进羟基自由基的形成。     

草莓分子标记技术发展与应用

栽培草莓(Fragaria×ananassa)为八倍体多年生草本植物,具有复杂的遗传背景,多数农艺和品质性状均为多基因控制,为草莓的遗传育种工作带来了挑战。DNA分子标记直观反映基因组的差异和变化,对于遗传高度杂合、生产周期长的多年生果树来说,能够有效提高育种效率。近年来,分子标记技术在果树辅助育种、基因定位、遗传图谱构建、QTL定位、品种鉴定和基因组研究等方面应用广泛,有力地推动了果树分子育种的发展。本文综述了分子标记技术在草莓生产育种中的研究应用现状,以期为后续的研究提供参考,推动草莓的生产和育种。     

转基因棉花GHB119品系特异性定量PCR检测方法的建立

为了保障和促进我国口岸进口转基因产品安全相关法律法规的顺利实施,针对我国农业部未颁发农业转基因生物安全证书的棉花品系GHB119,本研究利用TaqMan实时荧光PCR(Real-time PCR)技术,根据转基因棉花(Gossypium sp.)GHB119 3'端外源插入片段与棉花基因组DNA之间的邻接区序列设计引物和探针,并对引物、探针以及扩增体系进行了筛选和优化,建立了转基因棉花GHB119品系特异性实时荧光定量PCR检测方法。结果表明,建立的检测方法特异于转基因棉花GHB119成分检测,检测下限(limit of detection,LOD)为10拷贝的基因组DNA,定量下限(limit of quantification,LOQ)为25拷贝GHB119基因组DNA,对盲样的定量结果显示,测定值与设定值间的偏差(bias)、标准偏差(standard deviation,SD)、相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)等均在可接受范围内。本研究建立的GHB119品系特异性实时荧光定量PCR检测方法特异性好,灵敏度高,能够快速、准确地对混合样品中转基因棉花GHB119成分进行定量检测分析。     

用彗星实验技术检测环境遗传毒性物质

彗星实验（COMET Assay）是近年发展起来的在单细胞水平上定量检测DNA损伤的灵敏方法。经过不断改进和完善，用该方法检验的基因损伤已成为鉴别遗传毒性物质的敏感标记物，在致癌作用机制、环境污染监测以及环境毒理和风险评价等研究中，均发挥了重要作用，国内已有越来越多的研究人员开始采用这项技术。本文对彗星实验技术的发展过程、在环境中的应用以及未来的发展趋势进行综述，以利科研人员更加准确地掌握该技术，合理解释有关数据，来推动其进一步的应用和发展。     

耐辐射异常球菌磷酸戊糖途径对DNA损伤修复的影响

耐辐射异常球菌(D.radiodurans)超强的辐照抗性归因于其高效的DNA损伤修复系统,磷酸戊糖途径(PPP)作为细胞各种糖类代谢枢纽,是合成核苷酸和核酸所需的核糖以及生成细胞还原力(NADPH)的重要途径。为探究D.radiodurans R1中PPP对DNA损伤修复的影响,本研究敲除PPP中编码限速酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)的基因zwf,比较UV辐照后突变株Δzwf与野生型D.radiodurans的生理生化差异。结果表明,zwf突变导致菌株对UV辐照敏感;UV辐照后Δzwf胞内NADPH、D-核糖、核苷酸合成前体IMP、UMP含量明显降低;葡萄糖酸-δ-内酯及D-核糖能完全和部分恢复Δzwf的UV辐射抗性。综上可知PPP通过提供DNA损伤修复原料及还原力,在DNA损伤修复过程中起着重要作用。本研究结果为DNA损伤修复机理提供参考。     

赭曲霉毒素A引起HepG2细胞损伤及DNA甲基化水平降低

赭曲霉毒素A (ochratoxinA,OTA)是一种污染食品的真菌毒素,对许多动物具有肾毒性,肝毒性,免疫毒性,致畸和致癌作用.本研究以人肝癌细胞HepG2为体外模型,研究OTA引起的细胞损伤及对DNA稳定性的影响.MTT结果显示,OTA能抑制HepG2细胞的生长,存在时间剂量——效应关系.OTA引起细胞上清中酸脱氢酶(LDH),谷草转氨酶(GOT)和谷丙转氨酶(GPT)活性的升高,诱导细胞内活性氧(ROS)生成,降低超氧化物歧化酶(SOD)活力.彗星实验结果显示OTA引起DNA链断裂,形成拖尾现象.同时,本研究还首次研究了OTA对DNA甲基化的影响.HPLC/MS/MS结果显示,经OTA处理后的细胞,其DNA中5-甲基脱氧胞苷(5mdC)百分数显著低于对照组.这些结果表明OTA会抑制HepG2细胞生长,引起氧化损伤,破坏DNA的稳定性和完整性.本研究表明OTA引起的肝毒性可能与氧化损伤和DNA损伤有关.     

水稻DNA损伤修复同源基因纯合突变系的鉴定

在长期的进化过程中,生物逐步形成了应对各种DNA损伤的修复机制,以保护基因组的完整性,减轻或消除DNA损伤的影响。本研究通过同源搜索找到了与DNA损伤修复相关水稻同源基因,在水稻插入突变体库中搜索出插入突变系,并成功引进了其中的26份T1代突变材料。通过对插入位点的分子鉴定和进一步培育,获得了14份涉及8个水稻DNA损伤修复同源基因的T3代纯合插入突变系,并对其进行了初步的遗传分析和表型考察。这些纯合突变系涉及的水稻基因可能在DNA错配修复(Os02g0592300、Os09g0407600、Os10g0509000)和碱基切除修复(Os02g0465112、Os06g0643600、Os05g0567500、Os04g0673400、Os09g0420300)中发挥重要作用。与亲本相比,除1份材料外,其他纯合突变体系及其野生型姐妹系的结实率均有显著降低;某些纯合突变系的千粒重与亲本相比有显著下降。这些水稻DNA损伤修复基因突变系的育成为开展水稻DNA修复的遗传学和分子生物学研究以及培育抗逆水稻提供了珍贵的实验材料。     

涕灭威及其复合物对茎线虫DNA的影响

选择了一种毒性很高的氢基甲酸酯农药涕灭威、一种最常见的阴离子表面活性剂十二烷基苯磺酸钠（SDBS）及一种土壤中普遍存在的天然物质腐殖酸、组成两种复合污染体系；研究了它们对茎线虫的生态毒理效应和对DNA的影响。结果发现，涕灭威-SDBS复合体系在4d内对茎线虫的DNA造成了明显的损伤，而涕灭威-SDBS-腐残酸复合体系在8d内对茎线虫DNA造成的损伤却远远低于未加入腐殖酸的复合体系。关于涕灭威及其复合污染物对茎线虫的生态毒理效应和对DNA损伤的研究尚未见文献报道。     

大黄鱼精子的超低温冻存及细胞结构损伤的检测

为了解超低温冻存对大黄鱼精子细胞结构损伤的影响,本研究以Cortland溶液为稀释液,二甲基亚砜(DMSO)及乙二醇(EG)为抗冻剂,0.25 mL的麦细管为冻存管,两步降温法(平放在离液氮面3～4 cm处3～5 min后入液氮中保存)超低温冻存大黄鱼(Pseudosciaena crocea)精子,并用单细胞凝胶电泳(SCGE)技术检测了冻精的DNA损伤,荧光双染色-流式细胞术(FCM)检测了冻精的细胞膜性结构损伤.结果表明,DMSO及EG浓度在5％～20％时,冻精的活力与鲜精相比无显著差异;其中DMSO及EG浓度在10％时,冻精的激活率、运动时间、寿命分别为(87.00±2.45)％、(8.99±0.24) min和(13.11±0.65) min及(87.50±2.52)％、(8.45±0.48)min和(12.84±0.50) min; DMSO及EG浓度在25％和30％时,冻精的活力显著下降.SCGE检测显示,DMSO及EG浓度在5％～20％时,冻精的DNA损伤与鲜精相比差异不显著;DMSO及EG浓度为25％和30％时,冻精的DNA损伤明显加重;冻精的DNA损伤与抗冻剂DMSO及EG的浓度成正相关.FCM检测显示,DMSO及EG浓度在5％～20％时,冻精中线粒体及细胞膜结构保持完整性的精子比例与鲜精相比无显著差异;DMSO及EG浓度在25％和30％时,冻精中的线粒体及细胞膜结构保持完整性的精子比例明显下降.分析认为,较高浓度的DMSO及EG是引起冻精活力下降,DNA、线粒体及细胞膜结构损伤加重的主要原因;为确保大黄鱼冻精的质量,应以10％DMSO或10％EG为抗冻剂.     

用~3H-TdR研究混合重金属对鲫鱼DNA合成的影响

应用3 H 胸腺嘧啶核苷 ( 3 H TdR)示踪法研究混合重金属对鲫鱼 (Carassiusaura tus)遗传毒性的影响。结果表明 ,最佳取样时间为注射3 H TdR后 6h。鱼体各组织对混合重金属的毒性反应呈现双向效应 ,即低浓度时 ,表现出损伤、修复作用 ;高浓度时 ,DNA合成受到抑制。鱼卵、鱼鳃对重金属最敏感 ,损伤浓度为 0 0 773mg L ;而大脑对混合重金属耐受性最强。DNA损伤修复作用和DNA合成作用都存在剂量效应 ,随着暴露时间的延长 ,毒性作用增大。鱼体各组织对重金属的毒性反应可由DNA损伤修复变成合成抑制。经过 72h暴露后 ,3 H TdR在肝脏、鱼鳃、鱼卵中掺入量约低于对照的 5 0 %。     

纳米氧化锌对人胚肾HEK293细胞的遗传毒性

纳米氧化锌在人体内积蓄产生生物毒性,引起了人们对其安全性的重视.为了评价纳米氧化锌的遗传毒性,设置10、25、50、75和100 mg/L 5个剂量组的纳米氧化锌培养液与人胚肾细胞(HEK293细胞)分别接触培养12、24和48 h后,采用单细胞凝胶电泳(SCGE)试验分析纳米氧化锌对细胞DNA的损伤情况,体外微核试验检测细胞微核率.结果显示,随着培养基中纳米氧化锌浓度的增加,与对照组相比,染毒细胞头部DNA含量显著降低,尾部DNA含量、尾矩、Olive尾矩数值显著升高(P＜0.05);微核试验发现染毒组的微核率显著升高.研究结果提示,高浓度的纳米氧化锌可引起HEK293胚肾细胞DNA和染色体水平损伤,表现出遗传毒性效应,为纳米氧化锌的安全性提供了可靠的理论依据.