菠菜性别相关EST-SSR标记的开发及应用

为了明确菠菜EST序列中SSR的总体特点,开发菠菜EST-SSR引物;为利用EST-SSR引物进行菠菜性别相关特异序列的克隆奠定基础,本文从NCBI上获得1093条EST,利用在线软件SSRIT检测所含SSR序列,并进行分析。共检索出68条SSR序列,分布于64条EST中,检出率为6.22%,包括22种重复基元。其中二核苷酸重复基元的EST-SSR占主导地位,占总SSR数目的32.3%。利用在线引物设计软件Primer3.0设计了7对EST-SSR引物,在适合的PCR反应体系下,分别以雌、雄菠菜DNA基因组为模板,对设计的EST-SSR引物进行筛选,结果显示以EST序列HS097148设计的一对引物从菠菜雌雄基因组中扩增出一条雄性特异的条带,表明通过菠菜EST-SSR引物获得菠菜性别相关特异序列是可行的。     

SSR分子标记鉴定玉米杂交种纯度的研究及应用综述

从玉米基因组DNA提取、引物的筛选、PCR反应体系优化、部分推广玉米品种纯度鉴定引物信息等方面综述了SSR分子标记在玉米杂交种纯度鉴定方面的研究及应用。     

云南杂交玉米SSR标记核心引物的筛选及多样性分析

为降低合成引物成本,加快杂交玉米品种鉴定进程,筛选适用于云南玉米杂交种SSR标记鉴定的核心引物。本研究用玉米SSR标记鉴定规程中推荐的40对SSR引物对12个杂交玉米品种DNA进行扩增,筛选出多态性高、扩增效果好、稳定性好的20对引物,推荐其作为云南玉米杂交种特异性鉴定的核心引物。并用筛选的核心引物对云南220个杂交玉米材料进行多样性分析及评价。筛选的20对SSR引物在12个杂交玉米品种中共检测到216个等位变异,平均每对引物检测到10.80个。20对SSR核心引物在220个杂交玉米材料中共检测到236个等位变异,平均每对引物检测到11.80个;平均有效等位变异为3.158 8;平均Shannon-Weaver多样性信息指数为3.028 2。聚类分析表明,220个杂交玉米材料间的相似系数为0.62~0.95。以0.62为阈值可将220个杂交玉米材料划分为两大类群,第Ⅰ类群包括10个玉米材料,占4.5%;第Ⅱ类群包括210个玉米材料,占95.5%。本研究筛选的20对SSR引物多态性高、扩增效果好、稳定性好,可作为云南玉米杂交种特异性鉴定的核心引物。     

大白菜简单序列重复(SSR)和插入/缺失(InDel)标记的开发及通用性分析

为探讨大白菜基因组序列中SSR位点的分布规律并开发SSR引物,利用SSRHunter软件对大白菜A10(16899818～17299817)的DNA序列进行简单序列重复(SSR)位点查找,共得到394个SSRs,平均每1.02kb出现1个SSR。二核苷酸和三核苷酸重复是最主要的SSR类型,分别占79.44%和18.78%。为了提高SSR标记开发的准确性和通用性,对检索得到的含SSR位点的序列进行了同源比对,选取符合条件的15条SSR序列并设计引物;依据Blast过程中发现的在SSR位点不存在差异而在其侧翼序列中存在插入/缺失(InDel)差异的序列,设计了19条InDel引物。用34对SSR及InDel引物在6个大白菜(Brassica rapassp.pekinesis)材料中进行多态性研究,发现28对引物能扩增出理想的PCR产物,有效扩增率为82.35%,其中27对引物具有多态性,多态性比率为79.41%。为验证SSR引物的真实性,随机对4对SSR引物的部分白菜扩增片段进行了测序,发现100%的片段具有相应的SSR位点。28对SSR和InDel引物在甘蓝(B.oleracea)、油菜(B.napus)和萝卜(Raphanus sativus)品种的有效扩增率分别为85.71%、100%和77.78%,说明新开发的SSR和InDel标记具有较好的多态性和通用性。利用6对引物分析了48份十字花科种质的遗传多样性,结果表明48份材料被明显地区分成白菜和甘蓝组、萝卜组、油菜组3大类群,与传统分类一致。大白菜SSR和InDel标记的开发对于十字花科种质亲缘关系及遗传多样性分析具有重要的应用价值。     

基于石蒜属转录组序列的SSR分子标记开发应用

为开发石蒜属简单重复序列(SSR)分子标记,并研究SSR引物在石蒜属内的通用性,本研究对石蒜属石蒜、忽地笑、中国石蒜、长筒石蒜、换锦花、香石蒜6个种质转录组测序,检测SSR位点并设计引物,通过PCR扩增和毛细管电泳判断引物的有效性和多态性,绘制石蒜属17个种质资源的指纹图谱并对杂交后代的真实性进行早期检测。结果表明,共获得404 481条Unigenes,利用数据库进行同源比对和功能注释,并对Unigene进行SSR位点挖掘和分析,共检测到59 612个SSR位点。其中,单核苷酸重复>二核苷酸重复>三核苷酸重复,分别占SSR总数的62.88%、20.06%和14.66%,四核苷酸及以上重复单元相对较少。选取并合成8对荧光引物进行PCR扩增,通过毛细管电泳检测发现,8对荧光引物共检测到60个多态位点,多态位点数平均为7.50,多态性信息含量(PIC)值变化范围为0.148 0~0.940 8,平均值为0.593 0。利用引物扩增带型组合法构建了石蒜属17个种资源的指纹图谱,其中引物QZ209可区分所有供试材料,并可用于杂交后代鉴定。本研究开发的SSR标记具有丰富的多态性,在石蒜属植物的资源多样性分析、杂交种鉴定及遗传图谱的构建应用中具有重要意义。     

大白菜硫代葡萄糖甙合成基因SSR标记的开发

硫代葡萄糖甙(glucosinolates,GS)是一种含氮、硫的重要植物次生代谢产物,是十字花科蔬菜风味的主要来源。本研究根据拟南芥(Arabidopsis thaliana)和大白菜(Brassica rapa ssp.pekinensis)基因组序列信息,比对GS生物合成相关基因的序列信息,发现大白菜中与GS含量相关的候选基因102个,分布于10条染色体上。拟南芥GS合成基因在大白菜中的同源基因个数分别为:零拷贝基因8个、单拷贝基因13个、2拷贝基因17个、2个以上多拷贝基因14个。通过FASTPCR6.0软件分析目标基因上下游序列各5kb,共开发出237个简单重复序列(SSR)位点,16个基因没有发现SSR位点,72个基因存在1~4个SSR位点,5个基因存在5个SSR位点,4个基因存在6个SSR位点,4个基因存在7个SSR位点,1个基因存在8个SSR位点。所开发的SSR位点中,共发现4种重复类型:单核苷酸重复最多,共122个,占SSR总数的51.4%;其次是二核苷酸重复类型,共48个,占SSR总数的20.3%;三核苷酸重复类型最少,共7个,占SSR总数的3.0%,另外60个SSR无明显的重复类型。具有SSR位点的86个基因中,77个基因可以设计SSR特异引物,其中49对特异引物在供试的75份大白菜高代自交系中得到有效扩增。其中16对引物具有多态性,占全部引物的20.8%;18对引物无多态性,占全部引物的23.4%;15对引物杂带多,占全部引物的19.5%;另外28对引物无扩增产物,占全部引物的36.4%。最终11对获得了清晰多态性扩增产物,共检测出26个等位基因。本研究为分子标记辅助选择培育高有益GS成分的大白菜新品种提供了基础资料,进而加快大白菜营养品质育种的进程。     

利用生物信息学方法进行基于表达序列标签的玉 米单核苷酸多态性标记的开发

针对简单重复序列（SSR）标记密度不足、单核苷酸多态性（SNP）标记开发一般只基于2种基因型的序列差异,用以检测其他基因型的材料时多态性不高,不能满足玉米基因精细定位需要的现状,本研究从公共数据库下载来自不同遗传背景的玉米表达序列标签（EST）,结合运用各种生物信息学软件,开发基于EST序列的高多态性SNP标记。通过对2018530条EST序列的比对分析,拼接发掘出遍布全基因组的80363个SNP位点。在SNP位点两侧保守序列上设计PCR引物,开发出12388 个SNP标记（www.sicau.edu.cn/web/yms/snp/snp.html）,包含34721个SNP位点。其中,6008个标记只含单一SNP位点,12762个位点的多态性信息含量（PIC）大于04,具有高度多态性。     

核桃EST-SSR标记的开发

从GenBank数据库上公布的5025条核桃（Juglans regia）EST序列中,用SSRHunter软件搜索到485条EST序列中含有540个SSR,SSR出现频率为10.75%,SSR-ESTs检出率为9.7%。利用检出的SSR-ESTs序列设计SSR引物43对,对6个核桃样品、1个黑核桃（J. nigra）样品和1个核桃楸（J. mandshurica）样品进行了PCR扩增,其中40对引物有扩增带,占设计引物的93%,35对引物有多态性,占可扩增引物的87.5%。在有多态性的35对引物中,27对引物在核桃种内有多态性;8对引物在核桃种内无多态性,而在核桃、核桃楸和黑核桃种间有多态性。应用UPGMA方法对检测样品进行聚类分析,结果与传统分类一致。     

小麦AB基因组中一个重复序列的分离、定位与应用

利用102对微卫星引物对5份黑麦（Secale）、4份普通小麦（Triticum aestivum）和1份分枝小黑麦（Triticale）进行SSR分析,引物Xgwm614能在分枝小黑麦中扩增出一个387bp的特异DNA片段（记为FZ387,GenBank登录号为EF179137）,而黑麦未能扩增出。序列比对结果显示该片段与一粒小麦（T. monococcum）（AY485644）和栽培二粒小麦（T. turgidum）（AY494981）A基因组中Gypsy Ty3-LTR反转座子fatima的一部分分别有94%和95%同源性。根据序列同源性比对结果,在FZ387内部设计1对特异引物FaF和FaR。引物Xgwm614F和FaR能在含有A基因组的物种中扩增出约350bp的条带（记为A350）,而其不含A基因组的物种都未扩增出该条带。利用小麦二体和端体代换系材料对其进行定位,结果显示该片段分布在所有A染色体的长臂和断臂上。此外,引物FaF和Xgwm614R能在含有A、B或AB基因组的物种中扩增出约350bp的条带（记为AB350）,而不含AB基因组的材料未扩增出目标条带。利用这两对特异引物对小麦属近缘物种进行PCR扩增,发现只有中国春能够扩增出A350和AB350。序列比对结果和FZ387两侧SSR引物结合区的规律性变化表明该反转座子在进化上可能存在属间多样性和属内相似性。A350和AB350也可以分别作为分子标记检测A染色体和AB染色体。     

适于玉米杂交种纯度鉴定的SSR核心引物的确定及纯度鉴定图谱绘制

为了确定一套适于玉米杂交种纯度鉴定的核心SSR引物，利用10个SSR引物对420份已知玉米杂交种进行DNA指纹分析。综合考虑多态性和杂合率两个指标，确定bnlg161和bnlg1450为玉米杂交种纯度鉴定的首选核心引物，利用这两个引物进行筛选，412个品种（占98%）能够找到具有杂合带型的鉴定引物；确定bnlg439、bnlg125、umc2105、umc1705、bnlg1792这5个引物为玉米杂交种纯度鉴定的备选核心引物；phi072、bnlg162和phi065因多态性或杂合率低，不推荐作为玉米纯度鉴定用引物。研究了纯度鉴定用特异引物的选择问题，并确定了部分品种的纯度鉴定用特异引物。基于以上研究结果，进一步筛选玉米杂交种的双亲互补型引物，建立已知玉米杂交种的纯度鉴定DNA指纹图谱。此外，对玉米杂交种纯度鉴定用核心引物及特异引物的选择标准进行了探讨。     

利用SSR对60个玉米自交系进行杂种优势群划分初探

用SSR对60个玉米自交系的DNA进行分子标记和杂种优势群划分研究。利用14对SSR引物在供试材料中检测出57个等位基因变异,每对引物检测等位基因2～7个,平均为4．07个,多态信息量变化范围为0．389～0．832,平均为0．692。自交系间遗传相似系数变幅为0．058～0．756,UPGMA聚类分析表明,供试自交系可分为五个类群。利用这14对具有较高多态性信息量的引物,可以对供试材料进行初步鉴定。     

普通玉米和特用玉米的SSR标记聚类

利用SSR标记研究了64份玉米自交系（包括普通玉米和特用玉米自交系）的亲缘关系。用30对扩增带型稳定的SSR引物,从供试材料中检测出116个等位基因变异,每对引物检测出等位基因2~10个,平均3.87个。SSR引物的PIC介于0.306~0.893之间,平均多态性信息量为0.717。按UPGMA方法对供试自交系进行聚类,以遗传距离0.586为基准,可将材料划分为11类。64份自交系的SSR标记聚类分析表明,普通玉米与特用玉米糯玉米、甜玉米、爆裂玉米等并不能严格地各自划为一类,只有亲缘关系较近的特用玉米自交系聚在一起,有些特用玉米与普通玉米聚在一起,部分特用玉米具有丰富的普通玉米种质资源遗传背景。特用玉米自交系间的遗传距离与普通玉米自交系间的遗传距离差异达到0.01的极显著水平。此外,不同类型特用玉米间、特用玉米与普通玉米间的遗传差异较大,特用玉米在进化和选育过程中积累并保存了丰富的遗传变异。     

适于玉米杂交种纯度鉴定的SSR核心引物的确定

为了确定一套适于玉米杂交种纯度鉴定的核心SSR引物,利用10个SSR引物对420份已知玉米(Zea mays)杂交种进行DNA指纹分析。综合考虑多态性和杂合率两个指标,确定bnlg161和bnlg1450为玉米杂交种纯度鉴定的首选核心引物,利用这两个引物进行筛选,412个品种(占98%)能够找到具有杂合带型的鉴定引物,确定5个引物bnlg439、bnlg125、umc2105、umc1705和bnlg1792为玉米杂交种纯度鉴定的备选核心引物。研究了纯度鉴定所用特异引物的选择,将特异引物分为两类:第一类是利用单个引物检测,某品种的基因型仅出现1次,将该引物作为该品种在特定品种范围内的特异引物,在420个品种中,累计29个品种具有第一类特异引物,其中umc1705和bnlg1450作为特异引物的次数最多,均为8个,phi072和phi065没有作为特异引物;第二类是根据引物基因频率表,将预测基因型频率低于2.40E-03(即1/420)的基因型作为特异基因型,除了phi072和bnlg161外,其它8个引物均可能成为具有特定基因型品种的第二类特异引物。利用推荐的7个纯度鉴定用核心引物可进一步筛选每个玉米杂交种的双亲互补型引物,建立了已知玉米杂交种的纯度鉴定DNA指纹图谱。     

Event specific qualitative and quantitative polymerase chain reaction detection of genetically modified MON863 maize based on the 5'-transgene integration sequence

Because of the genetically modified organisms (GMOs) labeling policies issued in many countries and areas, polymerase chain reaction (PCR) methods were developed for the execution of GMO labeling policies, such as screening, gene specific, construct specific, and event specific PCR detection methods, which have become a mainstay of GMOs detection. The event specific PCR detection method is the primary trend in GMOs detection because of its high specificity based on the flanking sequence of the exogenous integrant. This genetically modified maize, MON863, contains a Cry3Bb1 coding sequence that produces a protein with enhanced insecticidal activity against the coleopteran pest, corn rootworm. In this study, the 5'-integration junction sequence between the host plant DNA and the integrated gene construct of the genetically modified maize MON863 was revealed by means of thermal asymmetric interlaced-PCR, and the specific PCR primers and TaqMan probe were designed based upon the revealed 5'-integration junction sequence; the conventional qualitative PCR and quantitative TaqMan real-time PCR detection methods employing these primers and probes were successfully developed. In conventional qualitative PCR assay, the limit of detection (LOD) was 0.1% for MON863 in 100 ng of maize genomic DNA for one reaction. In the quantitative TaqMan real-time PCR assay, the LOD and the limit of quantification were eight and 80 haploid genome copies, respectively. In addition, three mixed maize samples with known MON863 contents were detected using the established real-time PCR systems, and the ideal results indicated that the established event specific real-time PCR detection systems were reliable, sensitive, and accurate.     

Universal primer-multiplex-polymerase chain reaction (UP-M-PCR) and capillary electrophoresis-laser-induced fluorescence analysis for the simultaneous detection of six genetically modified maize lines

To meet the labeling and traceability requirement of genetically modified (GM) maize and their products for trade and regulation, it is essential to develop a specific detection method for monitoring the presence of GM content. In this work, six GM maize lines, including GA21, Bt11, NK603, Bt176, Mir604, and Mon810, were simultaneously detected by universal primer-multiplex-polymerase chain reaction (UP-M-PCR), and the amplicons for the six event-specific genes as well as the endogenous Ivr gene were successfully separated by the method of capillary electrophoresis-laser-induced fluorescence (CE-LIF). The UP-M-PCR method overcame the disadvantages in conventional M-PCR, such as complex manipulation, lower sensitivity, amplification disparity resulting from different primers, etc., and in combination with CE-LIF, it obtained a high sensitivity of 0.1 ng for both single and mixed DNA samples. The established method can be widely used for the qualitative identification of the GM maize lines.     

Qualitative and quantitative polymerase chain reaction analysis for genetically modified maize MON863

Qualitative and quantitative analytical methods were developed for the new event of genetically modified (GM) maize, MON863. One specific primer pair was designed for the qualitative polymerase chain reaction (PCR) method. The specificity and sensitivity of the designed primers were confirmed. PCR was performed on genomic DNAs extracted from MON863, other GM events, and cereal crops. Single PCR product was obtained from MON863 by the designed primer pair. Eight test samples including GM maize MON863 were prepared at 0.01 approximately 10% levels and analyzed by PCR. Limit of detection of the method was 0.01% for GM maize MON863. On the other hand, another specific primer pair and probe were also designed for quantitative method using a real-time polymerase chain reaction. As a reference molecule, a plasmid was constructed from a taxon-specific DNA sequence for maize, a universal sequence for a cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter used in most genetically modified organisms, and a construct-specific DNA sequence for the MON863 event. Six test samples of 0.1, 0.5, 1.0, 3.0, 5.0 and 10.0% of GM maize MON863 were quantitated for the validation of this method. At the 3.0% level, the bias (mean vs true value) for MON863 was 3.0%, and its relative standard deviation was 5.5%. Limit of quantitation of the method was 0.5%. These results show that the developed PCR methods can be used to qualitatively and quantitatively detect GM maize MON863.