禽多杀性巴氏杆菌和大肠杆菌二联灭活油乳剂疫苗免疫保护试验

用禽多杀性巴氏杆菌和大肠杆菌本地分离菌株，分别液体培养、灭活，按一定比例混合，加入油佐剂制成二联灭活油乳剂疫苗。以0．5mL／只、1．0mL／只两个剂量分别肌肉注射免疫2月龄非免鸡30只，同条件设非免疫对照组8只，免疫后21d用两种分离菌株分别攻毒及两种菌混合攻毒。试验结果显示，对禽多杀性巴氏杆菌的保护率为80％，对大肠杆菌病的保护率为100％，对两种菌混合攻毒的保护率为80％。本试验结果说明研制的二联灭活油乳剂疫苗安全有效。     

患病大鲵中嗜水气单孢菌的分离鉴定及其防治

2009年5月,贵州省贵定县人工饲养的大鲵（娃娃鱼）发生了以四肢和腹侧的皮肤溃烂、口腔粘膜弥漫性出血以及肝脏肿大为临床病理特征的传染病。本研究对该传染病进行了病原分离、动物回归、菌株16S rRNA基因测序检测、药物敏感性、药物治疗及灭活乳化疫苗免疫保护方面的实验研究。试验结果表明,动物回归分离菌株与病原分离菌株其形态特征及理化特性一致,分离菌基因16S rRNA测序检测与嗜水气单胞菌的同源性达到99.57%以上,因此确诊该病为鱼类嗜水气单孢菌感染。致病株具有较强的耐药性,敏感药物治疗能抗菌,但皮肤溃烂组织、深部肌肉组织抗炎效果较差。经致病菌株灭活乳化免疫和免疫保护攻毒试验表明,灭活乳化疫苗免疫平均保护率达83.33%。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素apxⅡA基因的真核表达及其核酸疫苗

利用PCR从自行分离鉴定的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneuromoniae,APP）血清7型菌株基因组DNA中扩增apxⅡA基因，构建了一个利用人类巨细胞病毒（Human cytomegalo virus，HCMV）启动子表达apxⅡA基因的真核表达质粒pCDapxⅡA，体外转染PK-15细胞，处理后的样品进行SDS-PAGE和Western blot分析，证实了免疫原性蛋白apxⅡA在细胞中表达。用表达质粒pCDapxⅡA作为核酸疫苗免疫BALB／c小鼠酶联免疫吸附试验，ELISA检测小鼠血清中特异性抗猪胸膜肺炎放线杆菌的抗体，结果第2次免疫后其抗体滴度都在1：128以上。初步证实，用apxⅡA作为核酸疫苗免疫动物可以激活机体产生免疫应答反应。     

鸡传染性支气管炎病毒肾致病株的致弱及免疫研究

用已鉴定的广西鸡传染性支气管炎病毒(IBV)分离株G,C,Z和Q分别通过鸡胚传代进行致弱,在一定代次时分别接种敏感鸡作毒力测定试验.然后用已致弱的毒株在实验室进行攻击保护试验,最后取已致弱而且抗原性良好的毒株在广西各地鸡场进行田间应用试验。结果表明,C株在传至40代时,G,Z和Q株分别传至20代时对鸡的毒性均已大大降低;免疫鸡用标准强毒株(M_(41))攻击,然后用病毒回收的技术来衡量其免疫力,结果各株经免疫两次后均有很好的保护率(60％～100％),均显著优于对照组(P<0.01);致弱株分别在南宁、柳州、容县、岑溪和博自5县市的11个鸡场进行田间试验,试验的鸡有30群共103761羽,试验时分别对疫苗免疫对鸡生产性能的影响、安全性和育成率进行观察和测算,结果表明,作者培育的IBV弱毒苗对鸡是安全的,使用C_(60)或C_(80)和G_(20)株先后两次免疫鸡,对IB有较好预防效果,这些弱毒株有希望成为供生产使用的疫苗。     

引起免疫失败的IBV分离株的生物学特性及结构基因分析

本研究应用鸡胚尿囊腔接种的方法，从广西患传染性支气管炎的免疫失败的病鸡中分离到一株传染性支气管炎病毒（IBV）（命名GX-YL5），通过间接血凝试验、动物回归试验和气管环交叉中和试验对该毒株进行鉴定和主要生物学特性的研究，同时利用RT-PCR技术扩增克隆该病毒的S1基因和N基因并测定其核苷酸序列。结果表明：该病毒株有间接血凝性；致病性较强；血清型不同于常用疫苗株H120、Ma5、4／91。同源性分析表明，S1基因核苷酸和氨基酸序列与参考株的同源性分别为63.5％-81.2％和50.7％-78.8％；N基因核苷酸和氨基酸序列与参考株的同源性分别为85.7％-87.2％和89.5％-91.7％；S1基因和N基因系统进化分析表明分离株与其它参考毒株的亲缘关系较远。S1基因和N基因分型与血清学试验结果相吻合。本研究结果提示了广西分离株GX-YL5可能是一个新的变异株，这可能是目前免疫失败的重要因素，同时也为研制适合本地使用的IBV疫苗提供了科学依据和物质基础。     

猪瘟DNA疫苗的临床免疫实验

在前期研究工作筛选出2种DNA疫苗质粒的基础上,采用3种免疫策略(DNA疫苗单独免疫法、DNA疫苗初免蛋白免疫加强的prime-boost方法以及沙门氏菌(Salmonella)载体介导法),于某规模化猪场对猪瘟病毒(CSFV)的DNA免疫效果进行了临床应用研究。随机选择未经猪瘟疫苗免疫的断奶仔猪60头,分6组进行免疫接种,检测免疫猪抗体产生情况并对各组免疫猪进行攻毒试验。免疫猪血清抗体ELISA检测结果表明,pcDSW组、pIRE2IL2组、pcDSW E2protein组和pIRE2IL2 E2protein组均产生了较高的抗体水平,而沙门氏菌介导的2种DNA疫苗质粒诱导的抗体水平不显著。攻毒试验结果表明,pcDSW和pIRE2IL2单独免疫组或prime-boost组能够抵抗致死剂量的CSFV石门强毒攻击,保护率87.50%￣90.00%。其中pcDSW效果好于pIRE2IL2。而沙门氏菌介导的DNA疫苗组不能产生有效保护。不同接种途径的免疫效果比较结果表明,颈部肌肉注射免疫后产生的抗体水平较后肢胫前肌注射免疫产生的抗体水平高。     

鸡γ干扰素对H5亚型禽流感疫苗的免疫增强作用

利用表达鸡γ干扰素的重组鸡痘病毒(rFPV-IFN-γ)与表达H5亚型禽流感病毒血凝素基因的重组鸡痘病毒(rFPV-HA)或灭活疫苗联合应用，接种SPE鸡、无母源抗体商品鸡和含有母源抗体商品鸡，研究鸡γ干扰素的免疫增强作用。结果发现，rFPV-IFN-γ和rFPV-HA联合应用诱导的HI抗体应答水平同rFPV-HA单独免疫相近；rFPV-IFN-γ和灭活疫苗联合应用后HI抗体应答水平略低于灭活疫苗单独免疫组。攻毒后，对于SPF鸡和无母源抗体商品鸡，rFPV-IFN-γ与rFPV-HA或灭活疫苗联合免疫诱导的保护率同相应疫苗单独免疫相当，均为95％～100％；对含有母源抗体的商品鸡，10^6PFU的rFPV-HA与10^5PFU的rFPV-IFN-γ联合免疫组保护率(33．5％)高于rFPV-HA单独免疫组(11．4％～16．8％)，而其它剂量组合的rFPV-HA与rFPV-IFN-γ联合应用不能提高免疫保护效力；rFPV-IFN-γ与灭活疫苗联合免疫含母源抗体商品鸡诱导的保护率同灭活疫苗单独免疫组相近。结果表明，rFPV-IFN-γ不能促进疫苗诱导的HI抗体应答；适当剂量组合的rFPV-HA与rFPV-IFN-γ联合免疫含有母源抗体的商品鸡，可提高免疫保护效力，发挥免疫增强作用。     

体外免疫法制备单克隆抗体的研究

本研究进行了三次体外免疫制备单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的试验，三次融合率分别为：８５．５９％（４９３／５７６），８４．５５％（４８７／５７６）和８５．０７％（４９０／５７６），而体内免疫法为８７．３３％（５０３／５７６）。在三次试验中，有两次产生抗体，经克隆后，与５５匹含有靶抗原的马红细胞反应中，各次试验获得的各株ＭｃＡｂ的最低反应率分别为８５．４５％（４７／５５），８０．００％（４４／５５），而体内免疫法为８３．６０％（４６／５５）。上述结果表明：小鼠脾细胞在体外培养４ｄ后，并不影响其与ＳＰ２／０（小鼠骨髓瘤细胞）的融合，而且在体外可接受抗原的刺激引起免疫应答，并产生抗体，其特异性与体内免疫法相似。     

检测多杀性巴氏杆菌毒素抗体的单抗竞争ELISA方法的建立

本研究以纯化的多杀性巴氏杆菌毒素基因片段的原核表达产物作为抗原免疫小鼠制备单抗，并利用表达蛋白和多杀性巴氏杆菌毒素单抗酶结合物建立了竞争ELISA方法检测多杀性巴氏杆菌毒素抗体。经过研究确定抗原包被浓度为223ng／mL，待检血清最佳稀释度为1：2，酶标单抗工作浓度为1：3200，血清抑制率大于50%为阳性。应用单抗竞争ELISA和细胞毒性中和试验同时对82份血清进行猪多杀性巴氏杆菌毒素抗体检测，竞争ELISA的检出率为40.2％，细胞毒性中和试验检出率为36.6％，两者符合率达91.5％。试验结果表明，该ELISA方法特异性强，敏感性高，稳定性和重复性好，操作简便。本方法的建立在实验室诊断的标准化、猪群萎缩性鼻炎疫苗免疫效果的评价及流行病学调查方面具有应用价值。     

H5N1型禽流感病毒血凝素HA1蛋白在苏云金芽胞杆菌细胞表面的展示及其免疫原性

利用苏云金芽胞杆菌S-层蛋白CTC表面展示系统研究在细胞表面展示H5N1型禽流感病毒HA1蛋白的可行性及其免疫原性，为研制既安全有效又能常温长期保藏和运输的禽流感口服基因工程疫苗奠定基础。用部分ha1基因（ha1p）代替S-层蛋白ctc基因中部且位于表面锚定序列slh下游的片段，构建了融合基因ctc-ha1p和 csa-ctc-ha1p；利用电脉冲转化法将含融合基因的重组质粒转入苏云金芽胞杆菌无质粒突变株BMB171中，获得了重组菌株BCCH（含ctc-ha1p，并导入一个载有协助细胞表面展示的csaAB操纵子的质粒）和CH（含csa-ctc-ha1p）。通过血凝和血凝抑制试验以及小鼠免疫学实验证实，2个重组菌株均成功地在细胞表面展示了重组HA1蛋白并具有一定的特异性和免疫原性，其中，CH的效果强于BCCH，说明csa-ctc-ha1p这种融合基因的构建方式更胜一筹。研究结果表明，苏云金芽胞杆菌S-层蛋白CTC表面展示系统可用来研制禽流感口服疫苗。