DDRT-PCR与反向Northern杂交技术结合分离马铃薯mRNA差异表达片段*

mRNA差异显示(DDRT-PCR)[1]技术因其简便、快速和灵敏度高的特点,已在动植物分子生物学研究领域得到广泛应用.     

杂种和纯种猪之间脂肪组织差异表达基因的分离、克隆和序列分析

实验选取中国地方品种梅山猪和外国品种大白猪进行正反向杂交产生杂种梅大和大梅猪，用mRNA差异显示技术，分析了亲本和杂种猪背部皮下脂肪组织间基因差异表达。结果发现，在10条5＇端随机引物和10条3＇端锚定引物共100对引物组合的差异显示扩增下，共获得l500多条可重复的扩增条带，选取其中能够重复出现的40条差异表达带（在4组样本中不能同时出现的条带）进行重扩增、克隆并测序。通过GenBank／BLAST比对发现，其中有4条EST分别与GenBank序列同源性较高，其余36条属于新的EST，将这36条EST提交GenBank获得注册号，并选取其中的3条进行半定量RT-PCR验证并检测其相对表达，其中2条表现不同程度的差异，l条没有明显差异。为提高DDRT-PCR真阳性，实验中的4种组合各屠宰6头以建立RNA池，采取低高严谨结合的退火温度进行差异显示扩增以及只回收在2次PCR扩增均能重复出现的条带。结果表明，所获得的36条新的EST在亲子代之间的差异表达方式不尽相同，这些差异表达的基因可能与脂肪组织杂种优势的形成有关。     

葡萄银染mRNA差异显示分析体系的建立及优化

mRNA差异显示(mRNA differential display)技术是筛选差异表达基因有效的方法之一（Peng and Agthui,1992)。本研究以中国葡萄属野生种的葡萄叶片为材料,采用改进的SDS／酚法(张今今等,2003)提取叶片总RNA,采用优化后的银染差显体系,比较葡萄白粉病病原菌诱导前后6个不同时期的样品,获得了数量适宜、差异显著和重复性好的差异表达cDNA片段。     

瓜叶菊热胁迫下的基因差异表达

应用mRNA差异显示技术(DDRT-PCR) 对瓜叶菊离体筛选获得的耐热变异体N1-2-1及其母株N1在热胁迫下的基因差异表达进行分析。结果显示：从40对引物中共扩增出1419条，筛选到100条在热胁迫下耐热变异体N1-2-1和母株N1间差异明显的基因片段，差异率为7.2%，其中有41条差异片段来自N1-2-1，其中有6个经过Northern杂交验证只在N1-2-1中表达而在母株N1中不表达的差异片段，进一步克隆测序和数据库比对分析表明：有2个分别与马铃薯和水稻热胁迫时产生的应答反应有关，有一个与花色素苷转酰基酶有关，另外3个（DF2、 DF5、DF6）未发现蛋白质同源序列，推测为新的cDNA片段。     

牛体外受精胚胎早期发育差异表达基因的筛选及定量检测

卵母细胞成熟和母源型-合子型过渡过程中,存在大量基因的表达差异,使得应用mRNA差异显示(DDRT-PCR)筛选对胚胎发育起关键作用的基因成为可能。为了解牛卵母细胞成熟过程及体外受精胚胎不同发育阶段相关基因mRNA表达规律,本研究以牛生发泡(GV)期卵母细胞、体外受精获得的8细胞期胚胎和囊胚期胚胎为检测对象,利用mRNA差异显示技术筛选这三个时期mRNA表达差异基因,并用实时定量PCR分析差异基因在这三个时期以及体外成熟卵母细胞中的mRNA丰度。结果成功筛选得到5个差异片段,经测序和GenBank数据库比对分析,检索到与这5个片段有高同源性的已知基因,分别为无机焦磷酸1基因(PPA1)、ErbB2互作蛋白基因(ERBB2IP)、350kD中心体相互作用蛋白基因(CEP350)、核糖体蛋白L27a基因(RPL27A)和Ⅱ类主要组织相容复合物下调因子基因(IK),实时定量PCR检测和SPSS统计分析结果表明,PPA1、ERBB2IP和CEP350mRNA表达量随胚胎发育进程呈不同程度的降低趋势,RPL27AmRNA表达量在囊胚期由降低转为升高,IK的转录物含量在囊胚期前呈波动变化,到囊胚期显著降低。本研究结果为进一步了解卵母细胞成熟对后续胚胎发育的影响以及合子基因组激活机制提供了实验依据。     

(英文)

为了揭示猪杂种优势的分子机理，利用mRNA差异显示技术研究梅山猪，大白猪和梅大杂交猪背最长肌中基因表达的差异, 分离14条在杂种与纯种背最长肌中差异表达的表达序列标签(EST), 并用半定量RT-PCR鉴定。核苷酸序列分析表明, 这14个EST与已知的基因或表达序列标签没有明显的同源性，随后这14条EST 被提交到GenBank数据库。组织表达谱分析揭示了这些EST在心、脾、 肝、肾 、 小肠、 卵巢、 肺等绝大多数组织中表达, 说明这些基因对生命过程很重要。这些研究结果表明梅山×大白杂交组合的杂种与纯种之间的不同基因差异表达的方向存在巨大差异，猪杂种优势可能是在一定阶段有诸多不同的必不可少的基因向各种方向差异表达共同作用的结果。     

菜粉蝶提取物诱导黄瓜抗炭疽病相关基因cDNA片段的分离与分析

摘要：采用mRNA差异显示技术，以菜粉蝶提取物作为诱导剂，研究黄瓜幼苗抗炭疽病相关基因的差异表达，共得到67条差异表达基因片段。选其中5条被诱导表达的差异片段(D1、D2、D3、D4、D5)进行克隆、测序。生物信息学分析表明：D1片段序列(344bp)与来自叶绿体psbB基因编码的47kD蛋白结合叶绿素a构成的蛋白复合物photosystemIICP47同源性高达95.0%，其可能具有类似CP47的反复折叠的跨膜蛋白，在系统获得抗性信号途径中介导细胞壁和细胞质之间的信号传导；其余片段与已登记的基因同源性较低。     

水稻受白叶枯病菌诱导抗性相关基因片段的克隆

利用已知植物Ｒ类基因保守结构域,设计简并引物作为随机引物,运用ｍＲＮＡ差异显示技术,分析水稻愈伤组织受白叶枯病菌诱导的ｍＲＮＡ表达丰度差异,获得３个差异片段。对３个差异片段进行了回收、重扩增与克隆,并对其中的一个差异片段进行了序列测定和杂交鉴定。该片段长度为６８０ ｂｐ,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交结果证实该片段受白叶枯病菌诱导表达且在抗性品种中的诱导表达明显强于在感病品种中的诱导表达。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂     

基因工程技术在烟草研究中的应用现状与展望

介绍转基因、RAPD分子标记、基因芯片、mRNA差异显示以及蛋白质组学等基因工程技术在烟草中的应用,指出这些技术不仅在烟草遗传图谱建立、系统分析、物种及品系的鉴定、转基因烟草鉴定和检测等方面发挥着重要作用,而且在改善烟草品质和建立烟草基因组学方面也有广阔的应用前景,并从抗病性、抗虫性、抗旱性、抗除草剂等方面介绍了基因工程技术在烟草抗逆性中的研究现状,对转基因烟草的安全性问题进行了探讨。     

差异显示法分离水稻耐淹涝相关的基因

摘 要：应用mRNA差异显示技术(DDRT—PCR)对耐淹材料FR13A和敏感材料IR39595-503-2-1-2在淹涝胁迫下的基因差异表达进行分析。结果显示：从40对引物中共扩增出1428条片段，筛选到102条在耐淹涝材料和敏感材料间差异明显的基因片段，差异率为7.1% 。其中有42条差异片段来自耐淹涝材料，有7个差异片段已通过Northern杂交验证在耐淹涝材料FR13A中表达，进一步克隆测序并进行数据库比对分析表明：有4个与受到水分胁迫时产生的应答反应和生理生化变化有关，其中一个与ATP结合蛋白的高度同源，3个与异柠檬酸酶脱氢酶，NADH2脱氢酶和乙醛酸转移酶部分序列高度同源。其余3个为新的cDNA片段。