棉花GhMYB146基因克隆及亚细胞定位分析

MYB转录因子是发育、代谢、生物和非生物胁迫应答调控网络中的关键因子。为了分析棉花Gh MYB146转录因子的亚细胞定位,通过RT-PCR和RACE方法从棉花纤维中克隆了1个棉花MYB转录因子Gh MYB146的c DNA序列,采用生物信息学方法分析了Gh MYB146的氨基酸序列,构建了Gh MYB146基因的亚细胞定位载体并进行了亚细胞定位分析。结果表明,克隆的R2R3-MYB基因Gh MYB146的c DNA全长1 027 bp,开放阅读框长879 bp,编码292个氨基酸,蛋白质预测分子量约为33.151 k D,等电点为7.9;推测的氨基酸序列中含有2个高度保守的SANT结构域;Gh MYB146基因组包含3个外显子和2个内含子。进化树分析表明,Gh MYB146和Gh MYB5分为一个分支;亚细胞定位结果表明,Gh MYB146:GFP融合蛋白定位于细胞核中。本试验结果为进一步研究Gh MYB146基因的生物学功能奠定了基础。     

巴西橡胶树HbNAC33基因的克隆和表达分析

植物特有的NAC转录因子在植物的生长发育、胁迫应答和激素调节等方面具有重要功能。本研究从橡胶树胶乳cDNA中克隆了HbNAC33基因,生物信息学分析显示该基因的完整开放阅读框（ORF）为1 092 bp,编码363个氨基酸。HbNAC33蛋白的N-端第3～156位氨基酸之间含有一个典型的NAC结构域,酵母试验表明,HbNAC33具有转录激活活性,转录激活区在C-端,具备了NAC转录因子的基本特征。序列比对和系统进化分析表明HbNAC33蛋白属于NAC转录因子家族中的ANAC011亚族。实时荧光定量PCR分析表明,HbNAC33在叶中的表达量显著高于其他部位;割胶,乙烯利（ET）和茉莉酸（JA）处理均能诱导HbNAC33的表达上调。以上结果表明,HbNAC33可能参与植物的生长发育和胁迫应答过程。     

甜瓜属野生种铝胁迫诱导基因ChAI的克隆及序列分析

应用同源序列克隆策略从铝盐胁迫处理的甜瓜属野生种(Cucumis hystrix Chakr.) 叶片中获得了612bp的片段,通过在EST数据库进行同源检索,发现一条甜瓜EST序列（GenBank登录号：AM724963.2）与之高度同源,据此设计引物并经RT-PCR扩增和序列拼接,最后获得了铝诱导基因cDNA序列全长,命名为ChAI (GenBank登录号：FJ968438 )。序列分析表明该基因全长967bp,其中开放读码框(ORF)长711bp编码236个氨基酸组成的多肽,5′ 和3′ 端非编码区长度各为15bp和241bp。DNAMAN同源性分析表明该基因与葡萄、棉花、羊乳（轮叶党参）、白骨壤（真红树植物）、拟南芥等植物的铝诱导蛋白的氨基酸序列具有78.6%以上的同源性。运用半定量RT-PCR技术对ChAI 基因的转录水平进行分析,根据该基因在铝胁迫下大量表达推测ChAI 与耐铝盐胁迫响应相关,但具体耐铝胁迫机制还有待深入研究。     

中国野生华东葡萄抗白粉病转录因子VpRFP1基因原核表达、纯化及多克隆抗体制备

为揭示中国野生华东葡萄抗病转录因子基因在与葡萄白粉病互作过程中的作用机制,本研究以中国野生华东葡萄(Vitis pseudoreticulata W.T.Wang)高抗葡萄白粉病株系白河35-1为材料,接种葡萄白粉病菌(Unicinula necator(Schw.)Burr.)病原菌诱导后7个不同时期的反转录产物为模板,用RT-PCR扩增得到V.pseudoreticulata RING-finger protein1基因(VpRFP1)的开放阅读框1053bp;将其克隆到pMD19-T载体经测序后,亚克隆到pGEX-4T-1原核表达载体并转化大肠杆菌(Escherichia.coli)BL21;经IPTG诱导表达出64kD的融合蛋白GST-VpRFP1,主要以包涵体表达形式存在;采用电透析法纯化融合蛋白,并以纯化产物免疫新西兰大白兔获得抗血清,Western blot检测免疫-抗原反应良好。本研究结果表明,在27℃、0.1mmol/L的IPTG诱导4h融合蛋白GST-VpRFP1的表达量最大,免疫大白兔获得的抗血清能够用于VpRFP1基因的功能分析。     

大豆MYB 转录因子GmMYBZ2 的鉴定、突变分析及原核表达

大豆（Glycine max）GmMYBZ2基因是典型的植物R2R3-MYB转录因子家族成员之一。通过DNAMAN和酵母(Saccharomyces cerevisiae)单杂交系统分别对其蛋白结构和转录活性进行了分析鉴定,并在大肠杆菌(Escherichia coli )中进行了原核表达。GmMYBZ2除含有典型的R2R3-MYB转录因子的结构特征外,在C端含有1个少有的保守氨基酸基序PDLNLELTIS及一个隐藏的锌指结构。基因组序列分析表明,在263～395 bp位含1个132 bp的内含子。为明确GmMYBZ2 C端保守氨基酸基序及锌指结构对目的蛋白转录活性的影响,分别进行了PCR介导的序列删除突变。酵母单杂交系统分析显示,内含子、保守基序及锌指结构对目的蛋白的转录活性均有抑制作用;原核表达显示,目的蛋白能在补充有稀有密码子的大肠杆菌中成功表达。     

甘蔗Lea基因cDNA全长克隆及表达特性

本研究从甘蔗叶片全长cDNA文库中获得了甘蔗Lea基因cDNA全长序列,命名为Sc-Lea。该基因全长921 bp, 含有一个495 bp编码164个氨基酸的的开放阅读框(open reading frame, ORF), 5’端非编码区（untranslated region,UTR）长64 bp,3’端UTR长362 bp,且在3’端UTR有明显的polyA结构, 起始密码子周围为CCCCAGCCATGGC, -3、+4位为G,C是该段序列的偏好碱基,符合Kozak规则。目的基因原核表达产物分子量大小约为17.9kD。同时还利用定量PCR技术研究了该基因在水杨酸（SA）、H2O2 PEG和NaCl等四种外源非生物胁迫因子作用下的表达特性。研究结果表明,甘蔗Lea基因的表达,会受到PEG和NaCl的强烈诱导,以及H2O2的抑制,同时也会受SA的影响。推测甘蔗Lea基因在甘蔗的抗旱和抗盐机制中发挥作用。     

甘薯茎线虫β-1,4内切葡聚糖酶基因(Dd-eng-1b)cDNA全长的克隆与序列分析

β-1,4内切葡聚糖酶是植物寄生线虫食道腺分泌的一类细胞壁降解酶,在植物线虫的侵染过程中具有重要的作用.以马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)为材料,用RT-PCR和RACE方法,获得了β-1,4-内切葡聚糖酶基因的cDNA全长,并将该基因命名为Dd-eng-1b(GenBank登录号为FJ430142).此cDNA全长序列为1 640 bp,包括1个1 443 bp的完整ORF,编码1含481个氨基酸的蛋白,其理论分子量为50.89 kD,等电点pI为6.94.序列比对分析表明,含有糖基水解酶的保守结构域,属于纤维素酶第五家族成员,N端具有19个氨基酸残基组成的信号肽,C端含有细菌式样的纤维素结合域(CBD Ⅱ).cDNA与基因组DNA重叠分析表明,此基因包含4个内含子,长度分别为36、76、187和344bp,切割点符合5'-GT……AG-3'的规律.系统进化树分析表明,该基因与细菌Bacillus subtilis和Erwina carotovora分泌的纤维素酶属于同一支,推测该基因可能来源于细菌的水平基因转移.     

杜仲EuFLC1基因克隆与生物信息学分析

以杜仲（Eucommia ulmoides Olive）雄花花芽为材料,依靠实验室构建的杜仲转录组库,采用cDNA末端快速扩增法克隆了3＇端包含完整开放阅读框的745bpcDNA序列。经3＇RACE产物和转录组库中5＇端序列拼接,获得全长为872bp的杜仲FLC的cDNA序列,编码86个氨基酸,命名为EuFLC1。生物信息学分析显示：EuFLC1蛋白分子量约为10.005 kD,理论等电点为10.47,为亲水性蛋白;存在3个可能的磷酸化位点、1个可能的核定位信号和1个可能的核输出信号;不存在跨膜螺旋和信号肽;蛋白二级结构中包含2个α螺旋和4个β折叠,无规卷曲连接α螺旋及β折叠;蛋白三级结构同源建模结果表明,EuFLC1蛋白包含2个互相垂直的α螺旋,α螺旋间有2个处于同一平面的β折叠,蛋白的N端和C端为无规卷曲并伸向整体结构的一侧;是含有MEF2_like型MADS-box结构域的MADS-Box基因。Blastp结果中,与EuFLC1同源性较高的序列有：葡萄的floweringlocus C、小粒种咖啡的MADS-box protein FLC subfamily、巨峰葡萄的flowering locus C-like MADS-box protein,因此认为EuFLC1是杜仲FLC基因。系统发育树表明杜仲与同属唇形类植物的小粒咖啡聚为一支,与APGⅢ分类系统的分类结果一致。该基因为首次从第三纪孑遗植物杜仲中克隆到的MADS-Box基因,为研究MADS-Box基因的演化的提供了一个重要材料,为研究杜仲开花时间的分子调控机制奠定了基础。     

马氏珠母贝IKKε同源基因的克隆及表达分析

IKKε（inhibitor of NF-κB kinasesε）是NF-κB（nucleur factorκB）信号通路中的关键成员,参与调控细胞的分化、发育、凋亡及免疫反应。本研究根据马氏珠母贝转录组数据库中注释为IKKε的unigene序列设计引物,应用cDNA末端快速扩增（RACE）技术克隆获得了马氏珠母贝（Pinctada martensii）IKKε基因cDNA的全长序列（PmIKKε）并对其序列特征进行分析;同时利用荧光定量PCR（Real-time PCR）技术检测了马氏珠母贝六个组织中PmIKKε基因mRNA的表达。结果表明：PmIKKε基因cDNA全长2 843 bp,其中5＇UTR为116 bp,3＇UTR为516 bp,含有27 bp polyA,开放阅读框为2 211 bp,编码737个氨基酸残基。预测其分子量为85.07 kD,等电点为6.17。多序列比对显示PmIKKε与其它物种IKKε有较高的同源性,与牡蛎的序列相似性有45%。软件分析结果显示PmIKKε的N端含有一个蛋白激酶功能结构域和一个MAPKK（mitogen-activated protein kinase kinase）的激活位点,C端含有一个亮氨酸拉链（leucin zipper,LZ）和一个螺旋-环-螺旋结构（helix-loop-helix,HLH）。荧光定量PCR分析表明PmIKKε在马氏珠母贝肝胰脏、性腺、血淋巴、鳃、外套膜、闭壳肌六个组织中均有表达,肝胰脏中表达量最高。本研究为进一步阐述PmIKKε在马氏珠母贝生长、发育及先天性免疫中的作用提供理论基础。     

甘薯茎线虫(Ditylenchus destructor)β-1,4内切葡聚糖酶基因(Dd-eng-1b)cDNA全长的克隆与序列分析

β-1,4内切葡聚糖酶是植物寄生线虫口针分泌的一类细胞壁降解酶,在植物线虫的侵染过程中具有重要的作用。本文以甘薯茎线虫为材料,用RT-PCR和RACE方法,获得了β-1,4-内切葡聚糖酶基因的cDNA全长,并将该基因命名为Dd-eng-1b (GenBank登录号为FJ430142)。此cDNA全长序列为1640bp,包括一个1443bp的完整ORF,编码一含481个氨基酸的蛋白,其理论分子量与等电点分别为50.89KD,pI为6.94。序列比对分析表明含有糖基水解酶的保守结构域,属于纤维素酶第五家族成员,N端具有19个氨基酸残基组成的信号肽,C端含有细菌式样的纤维素结合域(CBDⅡ)。cDNA与基因组DNA重叠分析表明,此基因包含4个内含子,长度分别为36bp、76bp、187bp和344bp,切割点符合5‘-GT...AG-3’的规律。系统进化树分析表明,该基因与细菌 Bacillus.subtilis和Erwina carotovora 分泌的纤维素酶属于同一支。