鸡爪槭ApPSY和ApPDS基因克隆及其表达分析

为了探究八氢番茄红素合成酶基因(PSY)和八氢番茄红素脱氢酶基因(PDS)在鸡爪槭叶片呈色中的作用机制,本研究以鸡爪槭黄金槭叶片为材料,采取RT-PCR技术,克隆得到ApPSY基因和ApPDS基因的cDNA序列,对其生物信息学进行初步分析,并检测了不同叶色品种及不同发育时期槭树叶片中基因的表达情况。结果表明,ApPSY基因cDNA序列长1 497 bp,有一个1 257 bp的完整开放阅读框,共编码418个氨基酸;ApPDS基因cDNA序列长1 974 bp,有一个1 692 bp的完整开放阅读框,共编码563个氨基酸。生物信息学分析表明,ApPSY和ApPDS蛋白质均为亲水性蛋白质,无信号肽和跨膜结构。进化树结果显示,鸡爪槭ApPSY、ApPDS与柚子、葡萄柚和甜橙的亲缘关系较近。实时荧光定量PCR分析结果表明,在不同发育时期叶片中ApPSY基因在呈色期表达量最高,而ApPDS基因在小绿期表达量最高;在不同叶色品种叶片中ApPSY基因在黄金槭品种中的相对表达量最高,ApPDS基因则在橙之梦品种中的相对表达量最高。本研究结果为进一步阐明ApPSY和ApPDS基因在鸡爪槭中的生物学功能提供了理论依据。     

加强Psy基因表达和通过RNAi抑制Lcy基因表达的载体构建

通过基因工程手段加强八氢番茄红素合成酶（Psy）基因的表达和通过RNAi抑制番茄红素β-环化酶（Lcy）基因（该基因是调控番茄红素转化为其他类胡萝卜素的主要的基因）的表达是培育高番茄红素品种的重要手段之一。根据GenBank中拟南芥的Psy基因序列（NM-121729），通过聚合酶链式反应（PCR）从拟南芥的cDNA中扩增出了长1296的Psy基因。根据GenBank中番茄的Lcy基因序列（X86452）和Pds启动子序列（U46919）分别设计特异引物从番茄中扩增出了Lcy基因的高度保守的长302bp的DNA片段和长1790的Pds启动子片段。根据RNAi的原理，将Lcy基因的长302bp的DNA片段以正反两个方向通过一段内含子序列连接在一起形成RNAi片段插入到抗Kan的pVCT2020的表达载体中，并通过具有果实特异性特点的启动子——八氢番茄红素去饱和酶基因（Pds）启动子控制该干扰片段的表达，同时将Psy基因在Pds启动子调控下插入到同一载体中，从而构建成了能同时加强Psy基因的表达和抑制Lcy基因表达的植物表达载体。     

氮、钾、钙不同配比对木薯生长发育及块根品质的影响

氮、钾、钙为植物生长发育中必需营养元素,均能对木薯生长发育产生影响,如能协调氮、钾、钙营养均衡将有助于作物产量与品质的进一步提高,对木薯的高产优质具有重要的指导意义。以SC9食用型木薯品种为材料,红壤∶蛭石=1∶2为供试栽培介质,设计三因素(氮、钾、钙)两水平(1为高水平,2为低水平)8处理正交试验,以盆栽形式种植100 d(快速生长期)、210 d(块根膨大期)进行氮、钾、钙配比试验,11个月后收获,分析8个处理下木薯光合速率、块根产量、全株总生物量、块根养分含量和品质的差异。结果表明:氮、钾、钙肥对木薯光合速率、总生物量、块根产量、养分含量及品质均有显著影响。在生长发育方面,高氮高钾处理在低钙配合下对叶片光合速率具有显著促进作用。在块根产量方面,高钾高钙处理显著提高木薯全株总生物量;低氮水平显著促进木薯块根产量;氮、钾、钙元素及互作对木薯块根养分含量有显著影响,尤其高钙低氮水平对块根钾含量具有显著的促进作用。在品质方面,低氮水平显著提高块根总糖、蛋白质含量;高钾水平能提高块根总糖含量;低钙水平能提高块根蛋白质含量。因此,木薯施肥应注重减少氮肥的投入,适当与钾、钙肥的合理配比进行施用,才能达到高产优质的效果。综上所述,氮、钾或钙的缺乏或过量,以及相对不平衡,均不利于木薯的生长发育,合理配比施用才能发挥3种元素的最大功能。木薯盆栽试验最佳肥料施用量为氮0.280 g/kg、钾0.210 g/kg或0.420 g/kg、钙0.165 g/kg,该用量的食用型木薯产量相对较高,块根品质较好。     

木薯SBEI基因片段克隆及块根特异性反义表达载体的构建

为了抑制木薯支链淀粉的合成,提高直链淀粉含量,改变木薯淀粉结构,培育工业用燃料酒精型木薯品种,本研究利用RT-PCR方法,用木薯块根cDNA克隆获得支链淀粉合成的关键酶基因SBEI的部分片段,对其进行序列分析表明与GenBank序列高度同源,同源性为99.22％;并以pBI121为基础,构建了以块根特异性表达启动子Sporamin驱动的SBEI基因反义结构的植物表达载体。     

广西地方食用木薯种质资源遗传多样性分析

为研究广西地方食用木薯材料的遗传多样性,以48份广西地方食用木薯为试验材料,分析其变异系数、遗传多样指数、聚类分析、多态性和遗传相似性系数。结果表明,收集的木薯材料的平均表型变异系数为37.9%,平均遗传多样性指数为0.807,其中主茎分叉角度的变异系数最大,为86.7%,块根内皮颜色的遗传多样性指数最大,为1.842。13对SSR引物共扩增出118个条带,其中多态性条带为106个,多态性比率为86.23%;分子标记聚类结果发现,遗传相似性系数在0.415~1.000之间;通过对比发现表型聚类和分子聚类结果不一致,其中表型聚类发现类群划分与地理来源之间没有关联,但与株型性状有一定的关联;在遗传相似系数为0.62时,SSR分子标记聚类为两类材料,第一类材料地理分布无规律,第二类材料大多分布在桂南。本研究结果表明,广西地方食用木薯资源遗传多样性具有一定的丰富度,可为创制优异食用木薯种质资源和新品种选育奠定基础。     

氮磷钾配比对木薯养分吸收动态及产量影响

【目的】木薯是重要的粮食作物,也是优质的淀粉工业原材料,被认为是非粮生物质能源的最合适原料。氮、 磷、 钾含量水平显著影响木薯产量,但有关木薯养分阶段性累积特征及其对生物量和产量形成影响的相关研究仍较少。本文比较了不同肥料配比情况下,木薯生物量, 氮、 磷、 钾累积量变化趋势,探讨了不同生育期氮、 磷、 钾含量及累积量的重要性及施肥对其影响。【方法】以我国主栽木薯品种华南205为材料,2009年在广东省郁南县丘陵坡地开展田间施肥试验,共设CK、 NP、 NK、 PK、 NPK 5个施肥处理。于苗期、 块根形成期、 块根生长早期、 块根快速膨大期和成熟期调查生物量和氮、 磷、 钾含量,得出氮、 磷、 钾累积动态。以各时期氮、 磷、 钾含量及累积量作为原始变量进行主成分分析,判断各时期氮、 磷、 钾含量及累积量的重要性,并分析不同肥料配比对各时期氮、 磷、 钾含量及累积量的影响。【结果】华南205的生物量累积动态呈S型曲线, 生物量在苗期较小,进入块根形成期后快速提高,当进入成熟期后增长逐渐减缓。氮肥对生物量影响最大,其次是钾肥,磷肥的影响最小。木薯氮含量的变幅为3.99%~0.93%, 磷含量为0.82%~0.26%, 钾含量为1.39%~0.89%。氮、 磷、 钾含量均在苗期最高,且随着生育期的推进不断降低,尤以氮含量降幅最大。不同氮、 磷、 钾肥料配比显著影响木薯的氮、 磷、 钾含量。PK处理的氮含量较NPK处理降低了32.96%,NK处理的磷含量较NPK处理降低了16.21%,NP处理的钾含量较NPK处理降低了50.37%。氮、 磷、 钾累积量与产量显著相关。主成分分析表明木薯整个生育期的营养状况与块根形成期的氮含量、 苗期的钾含量及块根生长阶段的磷含量相关性最大。氮、 磷、 钾的吸收累积量随着木薯生长不断提高,其中块根形成期、 块根生长早期、 块根快速膨大期的氮累积量较大,块根形成期、 块根快速膨大期的磷累积量较大,块根生长早期、 块根快速膨大期、 成熟期的钾累积量较大。主成分分析表明块根快速膨大期的氮、 磷、 钾累积量对整个生育期养分累积影响显著,同时,苗期及块根生长早期的氮、 钾累积量对养分累积总量影响也较大。【结论】木薯氮、 磷、 钾含量随着植株生长不断下降,而累积量却不断提高。不同氮、 磷、 钾肥料配比显著影响木薯的氮磷钾含量及累积量、 物质累积及产量形成,其中氮肥的影响最大,其次是钾肥,磷肥的影响最小。综合分析表明,苗期、 块根形成期、 块根生长早期为氮、 磷肥的最佳施用时期,块根形成期、 块根生长早期及块根快速膨大期为钾肥的补充阶段。     

农杆菌介导的洋桔梗遗传转化体系的建立

以洋桔梗叶片为外植体,建立了植株再生体系,并在此基础上,用根癌农杆菌介导法,研究了影响洋桔梗转化的若干因素。结果表明,诱导最佳培养基为MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.15mg/L,不定芽诱导率达74.5%;不定芽生根培养基为1/2MS+IBA 0.5 mg/L,生根率达90%。不定芽分化阶段和生根阶段的Km筛选浓度分别为45mg/L和15mg/L;根癌农杆菌菌液浓度OD600值为0.6,侵染时间10min,共培养时间3d,有利于抗性芽的产生。Km筛选得到的抗性植株经过PCR和Southern检测表明,八氢番茄红素合成酶基因(PSY)已经整合到洋桔梗基因组中。     

木薯氮磷钾营养特性及其施肥效应研究

以传统木薯品种‘华南205’及新育品种‘华南5号’为材料,通过田间试验,研究了不同时期植株养分含量状况,探讨了施肥措施对不同品种养分含量的影响。结果表明,木薯产量与块根生长阶段(块根形成期、块根生长早期、块根快速膨大期)的氮含量和苗期、块根快速生长期和快速膨大期的钾含量显著正相关(P0.01)。淀粉含量与块根形成期的氮含量显著正相关,与苗期及成熟期的磷含量以及成熟期的钾含量显著负相关(P0.01)。施用氮肥显著提高了木薯的氮含量,施用磷肥和钾肥对氮含量没有显著影响。施用磷肥可使木薯的磷含量小幅提高,而仅苗期达到显著水平,氮肥、钾肥对木薯的磷含量也有一定影响。钾肥显著提高了木薯钾含量,氮肥、磷肥对钾含量没有显著影响。‘华南205’和‘华南5号’的氮含量和磷含量对氮肥、磷肥的响应相对一致,但‘华南205’的钾含量对钾肥的响应明显强于‘华南5号’。‘华南205’和‘华南5号’的氮含量和磷含量水平相对一致,但‘华南205’在块根形成期的氮含量显著高于‘华南5号’,而苗期的磷含量显著低于‘华南5号’,‘华南5号’从苗期至块根膨大期的钾含量均高于‘华南205’,其中块根形成和快速生长期的差异达到显著水平。因此,木薯推荐施肥过程中,在均衡氮磷钾养分的基础上,还需结合考虑品种特性。     

广西木薯种质圃木薯品系耐贮性调查

木薯是重要的粮食和工业加工作物,受不良天气、运输及储藏条件的影响,在收获后至加工期间因块根不耐贮藏变质造成的损失巨大,因此耐贮性木薯品种的选育显得尤为重要。试验采用目测块根褐化程度评估法,通过对木薯种质圃的45个品系耐贮性进行观察比较,筛选出耐贮性强的品系,为木薯耐贮性育种提供试材。据观察结果,木薯品系W28、15-22和15-23-1耐贮性相对较差,贮藏第2 d就出现褐化,第7 d褐化面积超过50%;木薯品系17-2、AC2、15-65和16-50耐贮性相对较好,21 d的贮藏期后,褐化面积小于50%。为木薯特异性品种选育提供参考。     

中国南瓜果皮颜色基因连锁的SNP分子标记的开发及应用

为了解中国南瓜(Cucurbita moschata Duch.)果皮颜色性状的遗传规律,筛选与皮色性状紧密连锁的SNP分子标记,本试验以中国南瓜墨绿无斑果皮自交系CMO-1(P1)和浅绿有斑果皮自交系CMO-97(P2)为试验材料构建F_2遗传群体,对果皮颜色pc(pericarp color)基因进行遗传分析和基因定位研究,将定位区间内的SNP分子标记转化为dCAPS分子标记进行开发及应用。结果表明,浅绿有斑果皮对墨绿无斑果皮表现为显性,由1个显性单基因控制。此外,利用前期构建的高密度遗传图谱,在8号连锁群上检测到了1个与中国南瓜果皮颜色性状和斑纹性状连锁的基因位点,2个性状可能由同1个基因控制。将此基因定位在具有最高表型解释概率的标记R1_47757附近,两侧翼标记为R2_47028和R2_63809,遗传距离为1.86 c M,物理距离为145.13 kb。生物信息学分析表明,该区段存在32个预测候选基因。同时,根据检测到的与皮色性状相关基因位点内的SNP分子标记信息,设计dCAPS分子标记引物,经过PCR扩增及酶切验证,开发出2个扩增效率高、稳定性好的dCAPS分子标记,根据酶切带型可以准确的将F_2群体中的墨绿无斑表型和浅绿有斑表型区分开,且可以用于鉴定中国南瓜自交系材料的果皮颜色。本研究结果为南瓜果皮颜色的形成机理及开展南瓜分子标记辅助育种奠定了一定的理论基础。     

甘蓝SSR标记在近缘种青花菜的通用性及其应用

本研究对50条甘蓝SSR引物在其近缘种青花菜中的通用性进行了分析,结果表明,38对引物在青花菜上可有效扩增,扩增产物分子量在100～1500bp,有效扩增比率为76%,其中18%具有较好的多态性,揭示了两种作物基因组间存在一定的相似性。同时利用获得的多态性较好的9对引物对青花菜进行基因型鉴定和遗传多样性分析,20份青花菜基因型中共检测到51个基因位点,平均每个引物组合可扩增出5.67个条带,多态性为66.7%。多引物组合可鉴别出所有青花菜基因型。聚类分析结果表明同一来源的基因型间具有相近的遗传基础,且聚类与熟性具有一定的相关性。本研究为今后青花菜种质资源的收集、利用及分子标记辅助育种提供了新的SSR标记和参考。     

Earthworm primers for DNA-based gut content analysis and their cross-reactivity in a multi-species system

Specific primers can be used in polymerase chain reactions (PCR) to amplify prey DNA from the gut content of generalist predators at high specificity and sensitivity. A prerequisite for applying this approach to field studies, however, is to confirm that primers are actually targeting specific prey species or prey groups and do not produce false positive results by amplifying DNA either from predator species or from the wide range of potential alternative prey found under natural conditions. Here, we report on a new group-specific primer pair for earthworms designed from cytochrome oxidase c subunit 1 (COI) sequences of 11 earthworm species found in Central Europe that can be used to detect consumption of earthworms by invertebrate predators. Besides inter-specific also considerable intra-specific variation was found for COI sequences among most of the earthworm species. We, therefore, combined a universal forward primer with an earthworm-specific reverse primer which amplified a 523 bp product from all 11 species tested. Earthworm DNA amplification was also successful in the presence of excess DNA of a predator species. The primer pair was tested against 82 non-target invertebrate species commonly found in the same habitats, including potential prey for generalist predators and predators themselves. The earthworm primer was highly specific: only one of the non-target species showed a product of similar length as the earthworms, whereas PCR with 12 non-target species produced amplicons whose length differed from that of earthworms. We conclude that the new primer will be a useful tool to investigate the role earthworms play as a food resource in soil food-webs. Moreover, we suggest that future studies utilizing DNA-based approaches for prey detection should select non-target species for cross-reactivity tests according to their abundance and importance rather than choosing representatives of taxonomic units; this will help validate the results achieved using species- or group-specific primers and guarantee their meaningful ecological interpretation.     

苹果基因邻近未知序列的PCR扩增与测序方法

本文提出的方法是首先利用已知基因序列设计三个巢式PCR引物p14、p15和p16,然后设计3’端为常见酶切位点、5’端为随机引物序列p17的9个酶切位点引物,用p14外引物与9个酶切位点引物进行第一轮PCR扩增,其中前5个反应的退火温度较低可以将酶切位点引物的5’端序列引入到PCR产物中,其余反应则以此PCR产物为模板采用较高的正常退火温度进行,退火温度较高是为了使整个酶切位点引物能稳定地结合到最初反应形成的产物上。为提高PCR产物的特异性和产量,用p15和p16引物分别与p17引物配对进行第二轮和第三轮PCR扩增,电泳检查发现PCR产物条带后进行纯化和测序。为保证序列的正确性,利用测得的DNA序列再设计新引物f3x与p14(或p15)配对,直接用提取的DNA为模板进行PCR扩增和测序。利用此方法成功地获得了苹果FPPS基因邻近的启动子序列528bp和5’UTR序列142bp,并已在GenBank注册（登录号FJ263960）。利用Blastn发现这是GenBank中首次发表苹果FPPS基因启动子序列。这说明用该方法获取基因邻近的未知序列是可行的。     

AS-PCR技术检测鸡EX-FABP基因型方法的建立

摘要： 鸡(Gallus gallus )胞外脂肪酸结合蛋白(extracelluar fatty acid binding protein, EX-FABP)基因型与鸡腹脂量的积累密切相关。尝试了用等位基因特异性PCR(allele-Specific PCR, AS-PCR) 技术检测EX-FABP基因型的方法，确定了检测的参数和方案, 对AS-PCR检验单碱基突变的方法和策略进行了讨论,并在此基础上对该技术进行了改进，建立了等位基因特异性片段长度差异PCR（allele-specific and length-different PCR, ASLD PCR）技术。     

转基因大豆GTS40-3-2转化事件特异性PCR检测

GTS40-3-2是抗草甘膦转基因大豆,为建立GTS40-3-2大豆转化体特异性PCR检测方法,本研究以GTS40-3-2标准品为实验材料,根据已公布转基因大豆GTS40-3-2基因与大豆基因组连接序列信息,利用Primer5.0软件设计了5对品系特异性引物,对每对引物进行了退火温度、特异性及扩增效率的PCR检测,结果显示,5对特异性引物均能够从GTS40-3-2中扩增出大小约279bp、238bp、470bp、490bp和257bp的预期产物,可用于特异性检测转基因大豆GTS40-3-2转化事件。以转基因大豆GTS40-3-2含量为5%、2%、1%、0.5%和0.1%的标准品进行PCR灵敏度检测,结果表明5对引物的检测灵敏度均能达到0.1%。通过荧光定量PCR对5对特异性引物的Ct值与溶解曲线比较,最后选择出RRS2引物对为转基因大豆GTS40-3-2品系特异性检测的最适引物。本文结果将为我国未来转基因生物产品成分检测提供科学合理的实验参考。     

Geographical distribution and morphological diversity of red-fleshed kiwifruit germplasm (Actinidia chinensis Planchon) in China

The fruit flesh color of kiwifruit (Actinidia chinensis) is generally green or yellow when ripened. Developing kiwifruit cultivars with new fruit flesh color such as red-fleshed color has stimulated much interest for kiwifruit breeders and researchers recently due to its potentially importance for meeting the increasing and changing markets and consumers. In the present study, the whole geographical distribution and morphological variation of wild red-fleshed kiwifruit in China were investigated. In total of 56 accessions of red-fleshed kiwifruit were found across 19 separated localities, representing different ecological and climatic conditions throughout South and Central China. Characterization of nine horticulturally important fruit traits of all accessions showed that there are extensive variations in fruit shape, fruit hairs and as to red intensity, spread of the red pigments and background flesh color. The results presented here have updated the current knowledge on the natural distribution and ecological adaptation of wild red-fleshed kiwifruit resource, which should be valuable for kiwifruit agriculture such as the determination of planting areas of red-fleshed kiwifruit cultivars. The accessions with extensive morphological variation can also contribute to kiwifruit breeding in future such as developing new cultivars with red color flesh.     

与黄瓜感花叶病毒病基因连锁的分子标记

本研究以黄瓜(Cucumis sativus L.)高感黄瓜花叶病毒(CMV)和高抗CMV亲本组合(HZL04-1×F-3)的F2分离群体为试材,采用极端个体分组法和AFLP技术筛选与黄瓜抗CMV基因连锁的分子标记.AFLP引物组合E22M88在抗病组和感病组间约200 bp处表现多态性.经F2单株分析,在感病亲本和感病单株中扩增出了约为200 bp的特异片段,而抗病亲本和抗病个体无此条带.该特异标记与CMV抗性基因相连锁,遗传距离为9.74 cM.测序结果显示,目标片段的大小为202 bp,并将该标记转换为了序列特征化扩增区域(SCAR)标记.提供了黄瓜材料CMV抗性鉴定的分子方法和手段,可用于分子标记辅助育种.     

龙眼SCoT-PCR反应体系的优化

目标起始密码子多态（start condon tardeted polymorphism,SCoT）分子标记结合了ISSR标记和RAPD标记的优点,具有操作简单﹑成本低廉﹑多态性丰富﹑重复性好﹑引物设计简单且通用性良好等诸多优点。本实验以石硖龙眼的新鲜叶片为试材,采用单因素试验的方法分别研究模版、引物、rTaqDNA聚合酶、dNTPs、缓冲液（Mg2＋）及退火温度共6因素各8个水平对龙眼SCoT-PCR扩增结果的影响。结果表明：龙眼SCoT标记的20μL优化反应体系为：10×BufferⅡ（含Mg2＋）2.0μL、DNA模板30ng、引物浓度为30μmol/L、rTaqD-NA聚合酶用量为0.45U、dNTP浓度为4.0mmol/L。适宜的扩增程序为：94℃预变性4min;95℃变性50s,49.5℃退火40s,72℃复性2min,36个循环;最后72℃延伸10min。利用24个龙眼品种验证该反应体系,1.5%琼脂糖电泳检测结果显示,扩增产物在400-2200bp之间,不同品种间DNA谱带具有多态性,反应体系具有良好的稳定性和可重复性。     

Molecular characterization of salinity tolerance in wheat (Triticum aestivum L.)

Random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers were used to estimate the genetical variability of three salt-resistant genotypes, SARC-1, SARC-5 and S-24, exposed to saline environment. High-yielding and salt-sensitive variety MH-97 was used as standard for comparison. The behavior of these genotypes under saline environment was analyzed by using the hydroponics screening methods at the seedling stage. One hundred and fifty primers were tested of which 52 primers revealed differences between SARC-1 and SARC-5, 54 revealed differences between SARC-1 and S-24 and 61 revealed differences between SARC-5 and S-24. Polymorphism differences between MH-97 and SARC-1, MH-97 and SARC-5 and MH-97 and S-24 were 53%, 64% and 42%, respectively. Four primer pairs amplified special fragments, which were located in all the three salt-resistant genotypes but none on the salt-sensitive genotype MH-97. Primer GLD-15 (5?-CCGTGGCATT-3?) generated a prominent fragment of length 1460 bp; primer GLF-18 (5?-ACCCGGAACC-3?) produced a fragment of length nearly 980 bp in the salt-resistant genotype; the primer pair GLE-5 (5?-TTCAAGCCCG-3?) located one polymorphic amplified band of 1290 bp and the primer GLH-9 (5?-ATCCAGGTCA-3?) performed as a weak polymorphic band of 640 bp, respectively.     

Development of a multiplex polymerase chain reaction method for simultaneous detection of eight events of genetically modified maize

In this study, we developed a novel multiplex polymerase chain reaction (PCR) method for simultaneous detection of up to eight events of genetically modified (GM) maize within a single reaction. The eight detection primer pairs designed to be construct specific for eight respective GM events (i.e., Bt11, Event176, GA21, MON810, MON863, NK603, T25, and TC1507) and a primer pair for an endogenous reference gene, ssIIb, were included in the nonaplex(9plex) PCR system, and its amplified products could be distinguished by agarose gel and capillary electrophoreses based on their different lengths. The optimal condition enabled us to reliably amplify two fragments corresponding to a construct specific sequence and a taxon specific ssIIb in each of the eight events of GM maize and all of nine fragments in a simulated GM mixture containing as little as 0.25% (w/w) each of eight events of GM maize. These results indicate that this multiplex PCR method could be an effective qualitative detection method for screening GM maize.