商陆抗病毒蛋白基因转化芥菜的获得及抗性研究

以芥菜(Brassica Juncea Coss.)的子叶为外植体,通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的介导,将商陆抗病毒蛋白基因PAP导入到芥菜中。对所获得的40株抗性植株进行PCR扩增,其中阳性植株为29株;Southern blot分析结果证明PAP基因已被整合到芥菜基因组中,在大多数转基因植株中外源基因呈单拷贝,少数为双拷贝;Northern blot分析结果表明,PAP在转基因植株中正常表达。转基因植株接种病毒试验初步结果表明,转PAP基因的植株对芜菁花叶病毒TuMV的侵染有一定的抑制作用。     

CryIA(c)转基因结球甘蓝的抗虫性研究

以结球甘蓝（Brassica oleracea var．capitata）下胚轴为外植体，通过根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciecin）介导法将苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）杀虫蛋白基因CryIA（c）导入结球甘蓝栽培品种中，共获得56株卡那霉素抗性植株。分别以CryIA（c）和NPTⅡ基因引物进行PCR扩增，结果43株均扩增出了预期的目的带。以CryIA（c）基因为探针，进行Southern blot分析，证明外源基因已经整合到甘蓝基因组中，且多数转基因植株只含有单拷贝的外源基因。离体叶片抗虫实验表明，转基因植株幼虫校正死亡率为40％，平均单虫重达到极显著水平，叶片损害程度差异明显，转基因植株抗性较对照显著提高。通过卡那霉素涂抹叶片和PCR扩增两种方法鉴定，表明外源基因在转基因甘蓝自交后代呈孟德尔单基因遗传。     

Inheritance and Resistance to Insect in CryIA(c) Transgenic Cabbage

以结球甘蓝（Brassica oleracea var. capitata ）下胚轴为外植体，通过根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciecin）介导法将苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）杀虫蛋白基因CryIA(c)导入结球甘蓝栽培品种中，共获得56株卡那霉素抗性植株。分别以CryIA(c)和NPTⅡ基因引物进行PCR扩增，结果43株均扩增出了预期的目的带。以CryIA(c)基因为探针，进行Southern blot分析，证明外源基因已经整合到甘蓝基因组中，且多数转基因植株只含有单拷贝的外源基因。离体叶片抗虫实验表明，转基因植株幼虫校正死亡率为40%，平均单虫重达到极显著水平，叶片损害程度差异明显，转基因植株抗性较对照显著提高。通过卡那霉素涂抹叶片和PCR扩增两种方法鉴定，表明外源基因在转基因甘蓝自交后代呈孟德尔单基因遗传。     

优化的VHb基因和融合杀虫基因在烟草中的表达研究

将人工合成的、密码子优化后的透明颤菌血红蛋白（VHb）基因与含有融合杀虫基因（GFMcryIA基因和CPTI基因的融合）表达载体PGBIF4ABC构建成双价基因植物高效表达载体PGBIF4ABCVHB，通过根癌农杆菌介导转化烟草，获得了38株卡那霉素抗性转基因株，经PCR及Southern blotting检测，证实了双价基因在32株转基因烟草基因组中整合。western blot检测证实了VHb基因的表达,杀虫实验表明融合杀虫基因表达出的毒蛋白具有杀虫活性，转基因烟草平均每株干重高于非转基因烟草植株8％。实验结果表明：VHb基因和融合杀虫基因烟草在烟草中的表达既可使烟草既可增产、又具抗虫性。     

转Bt cry1Ah基因抗虫玉米的获得及其遗传稳定性分析

Btcry1Ah基因是从国内苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）分离株BT8中克隆鉴定的新型杀虫蛋白基因。研究利用该基因构建了植物表达载体pHUAh,用基因枪法转化玉米杂交组合Q31×Z31的胚性愈伤组织,得到13株阳性转基因玉米（Zea mays L.）植株。通过生物活性分析筛选得到了2个高抗转基因事件B1-1和B1-7,对其T1～T5代转基因植株进行了5代跟踪检测,结果表明,外源基因在玉米植株可以稳定表达,并且可以逐代稳定遗传。利用ELISA对不同转化事件以及同一转化事件不同组织部位的Cry1Ah蛋白的表达量进行分析,发现该基因在不同转化事件之间以及同一转化事件不同组织部位表达量都存在差异。对T2～T5代转基因植株田间虫测结果显示,转基因玉米对亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）具有显著的抗性,且逐代稳定遗传。B1-1和B1-7有望成为Bt抗虫玉米育种工作的备选材料。     

双Bt基因提高青花菜对菜粉蝶和小菜蛾抗性

以青花菜（Brassica oleracea L.ssp.italica）下胚轴为外植体,通过农杆菌介导的遗传转化方法将苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）晶体毒蛋白基因Cry1Ac和Cry1C分别导入青花菜栽培品种绿彗星中,各获得35株卡那霉素抗性植株。分别以Cry1Ac和Cry1C特异引物对转基因植株进行PCR扩增,结果得到27株Cry1Ac阳性植株和13株Cry1C阳性植株。以目的基因Cry1Ac和Cry1C为探针,进行Southernblot分析,证明多数植株目的基因已经整合到青花菜基因组中。对含有单拷贝目的基因植株自交纯合后通过有性杂交获得带有Cry1Ac和Cry1C双价的转基因青花菜。利用RT-PCR检测Bt基因在转基因植株中的表达情况,发现不同株系间在RNA水平上存在显著的表达差异,部分株系中双价Bt同时得到表达。ELISA检测转基因植株Bt毒蛋白含量为0.12～0.82μg/gFW。结合室内和田间饲虫试验,证明抗虫效果与Bt毒蛋白表达水平正相关。通过多世代选择,获得高抗菜粉蝶（Pieris rapae L.）和小菜蛾（Plutella xylostella L.）的纯合转基因青花菜材料。双价抗虫基因共同作用,提高了青花菜的抗虫性。     

转柽柳金属硫蛋白基因（MT1）烟草的获得及对重金属镉的抗性分析

将柽柳（Tamarix. sp）金属硫蛋白基因（MT1）插入到植物表达载体pBI121，利用农杆菌（Agrobactrium tumefaciens）介导法将MT1导入烟草基因组。对转基因T1植株的卡那霉素抗性分析表明，多数转基因植株后代表现为3:1的分离比例，只有少数转基因植株的抗性分离表现为15:1或不符合孟德尔遗传的分离比例。说明整合到烟草基因组的外源基因多为单拷贝基因，也有少数为多拷贝基因。对具有卡那霉素抗性的转基因植株进行PCR-Southern检测和Northern杂交分析表明，外源MT1基因已整合到烟草基因组，并且得到了正确表达。转基因植株对重金属镉的抗性比对照显著提高，表现为转基因植株的株高和鲜重均明显优于非转基因株系。     

毛白杨杂种外源基因稳定性及对土壤微生物的影响

转基因植物外源基因的稳定性、对土壤微生物种群数量的影响以及外源基因是否水平转移到土壤微生物中,是评估转基因植物生态安全性的重要组成部分。本研究利用PCR技术,分析了种植于山东省东营市试验林达3年的转AhDREB1基因毛白杨杂种(毛新杨×毛白杨)的外源基因稳定性,表明AhDREB1基因仍然存在于转基因植株中。采用平板稀释法对转基因与非转基因植株的根系土壤微生物进行种群数量分析,计数结果表明转基因植株与非转基因植株间根系土壤3大类微生物（细菌、放线菌和真菌）数量无显著差异。利用AhDREB1基因特异引物对土壤总DNA以及菌株DNA进行PCR扩增,均未检测到外源基因扩增产物。研究结果表明该转基因毛白杨杂种对土壤微生物系统尚无明显的影响。     

抑制咖啡酰-辅酶A甲基转移酶(CCoAOMT)表达的转基因多年生杨树检测与分析

本文以生长4年的转反义CCoAOMT基因的白杨杂种（欧洲山杨与银白杨,Populus tremula x Populus alba）及野生型对照为实验材料,测定Klason木质素含量并分析了木质素组分,结果表明转基因植株木质素含量经历4个生长季后,依然比对照降低13%,同时转基因植株木质素组分的G/S比比对照轻微降低。对茎杆切片显微观察表明转基因植株中部分导管向内凹陷,存在轻度变形。转基因植株与野生型对照在株高、胸径等外部生长形态上没有明显差别。     

抑制CCoAOMT表达的转基因多年生杨树检测与分析

本文以生长4年的转反义CCoAOMT基因的白杨杂种（欧洲山杨与银白杨,Populus tremula x Populus alba）及野生型对照为实验材料,测定Klason木质素含量并分析了木质素组分,结果表明转基因植株木质素含量经历4个生长季后,依然比对照降低13%,同时转基因植株木质素组分的G/S比比对照轻微降低。对茎杆切片显微观察表明转基因植株中部分导管向内凹陷,存在轻度变形。转基因植株与野生型对照在株高、胸径等外部生长形态上没有明显差别。     

西红柿原系统素基因转化水稻的抗虫性研究

构建了两个含西红柿原系统素基因的双元载体pNAR304（UbiI5’+Prosystemin+NOS3’）和pNAR305 (UbiI5’+Prosystemin+NOS3’+ PinⅡ5’+PinⅡ+PinⅡ3’)，并用农杆菌介导方法将其转入水稻品种秀水63、合江19和日本晴。经潮霉素抗性、PCR和Southern blot确证，共获得转基因水稻14株。Northern blot检测表明，原系统素基因(Prosystemin)和马铃薯蛋白酶抑制剂基因(PinⅡ)在这些转基因植株中都能转录表达。然而，植株的二化螟和褐飞虱抗虫性鉴定表明：单独转入Prosystemin（pNAR304）不能提高转基因水稻的抗虫能力；Prosystemin和PinⅡ双价（pNAR305）转基因植株能明显提高水稻的抗虫性，但其抗性水平与PinⅡ单个基因的转基因水稻植株间并无显著差异。 这表明，Prosystemin基因转入水稻并不能有效调节转基因水稻PinII基因的表达量。据此试验结果推测，水稻中可能不存在类似于西红柿系统素的信号途径，很可能水稻的伤害信号转导是经由与双子叶植物系统素体系不同的其它途径来实现的。     

根癌农杆菌介导的抗除草剂转基因甘薯植株的获得

以甘薯品种栗子香的胚性悬浮细胞为受体材料, 用根癌农杆菌介导法,获得了表达bar基因的抗除草剂转基因甘薯植株。农杆菌菌株LBA4404携带含有bar基因的双元载体pCAMBIA3300。共计450个胚性细胞团用于遗传转化。在添加2 mg/L 2,4－D、100 mg/L Carb和0.5 mg/L PPT 的固体MS培养基上选择培养8周后,得到了19个PPT抗性愈伤组织。将这19个抗性愈伤组织转移到添加1 mg/L ABA、100 mg/L Carb和0.5 mg/L PPT 的固体MS 培养基上,其中的10个抗性愈伤组织共再生出103株拟转基因植株。PCR分析表明,其中的69株为转基因植株。Southern blot分析表明,bar基因稳定整合到转基因植株的基因组中。除草剂喷洒试验结果表明,转基因植株具有高度除草剂抗性。     

表达液胞膜AtNHX1的转基因白三叶提高了耐盐性

以白三叶吸胀种子的子叶为转化体,用农杆菌介导法将拟南芥液胞膜Na+/H+ 逆向转运蛋白基因AtNHX1转入白三叶,经过筛选、分化和再生,得到了具有卡那霉素抗性的转基因植株。对这些植株进行PCR、Southern 印迹和 Northern 杂交分析,结果表明,外源目的基因已经整合到白三叶基因组中并且得到了表达。室内耐盐性试验结果表明,表达AtNHX1的转基因植株总叶面积和地上部分干重都显著高于非转基因对照,说明液胞膜上的AtNHX1基因有助于提高白三叶耐盐性。     

番茄ACO基因的克隆及其RNAi对乙烯释放的抑制

筛选番茄(Lycopersicon esculentum)幼苗cDNA文库获得与番茄抗性相关的克隆E11,设计引物,利用RT-PCR方法从受到病原侵染的番茄叶片中获得长1018bp的候选片段,同源性分析发现该片段与其它作物上发表的ACO基因序列高度同源,同源率83%～99%,推断该基因为番茄ACO基因家族的新成员。在此基础上,用BP克隆的方法构建该基因的RNA干涉(RNAi)载体pD311,对番茄进行遗传转化,获得卡那霉素抗性植株27棵,分子检测证实外源片段成功导入番茄基因组中。对获得的转基因植株的乙烯生成量测定结果表明,RNAi结构的导入大大抑制了内源ACO基因的表达,从而导致乙烯的生成大大降低。     

转大麦烟酰胺合成酶基因提高水稻逆境胁迫耐受性的研究

维持铁等金属离子的动态平衡是保持植物细胞功能正常的先决条件。烟酰胺合成酶基因在单子叶禾本科的缺铁胁迫应答反应中起着关键作用,它的催化产物烟酰胺(NA)是铁及其他二价金属离子在体内吸收和转运的重要载体,且能与Fe2+结合形成Fe2+-NA复合物,从而使植物在酸性土壤中免受铁毒害。利用农杆菌介导法,将大麦烟酰胺合成酶基因NASHOR1转入水稻台北309中,经PCR及PCR-Southern杂交检测,确定目的基因已经整合到水稻基因组中。铁、锰、铜和锌含量的检测结果显示:与非转基因对照植株相比,转基因植株的金属元素含量都明显提高,铜、锌、锰和铁元素含量分别增加了15%、80%、31%和44%,但铁、锰和锌元素增量在株系间差异较大。在干旱胁迫下,转基因植株的超氧化物歧化酶(SOD)活性和脯氨酸含量都高于非转基因对照植株的,暗示大麦烟酰胺合酶基因在一定程度上提高了水稻的耐旱性。     

甘蔗尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因(UGPase)转化拟南芥及转基因植株的生理特性分析

尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase,UGPase)是植物糖代谢的主要参与酶之一,在植物的生长发育过程中起着重要作用。本研究将甘蔗(Saccharum officinarum)UGPase基因cDNA片段连接至载体pBI121,通过BamHⅠ和SacⅠ酶切鉴定及测序验证,结果表明,植物表达载体成功构建;通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的介导,采用浸花法转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)。结合卡那霉素抗性筛选和PCR检测,获得了5株T0代转基因植株。对T1代转基因植株进行PCR及Southern blot分析,结果表明,目的基因已成功转入拟南芥中,并且不同的转化植株含有目的基因的拷贝数不同。对T2代转基因植株进行PCR和RT-PCR检测,结果表明,目的基因不仅能在自交系后代中稳定遗传,而且在RNA水平也有表达。同时,对T2代转基因植株的可溶性总糖、蔗糖及淀粉含量进行测定,结果表明,与野生型相比,转基因植株中可溶性总糖含量没有明显的变化,但蔗糖含量有所提高,并且差异明显,比野生型植株提高了50.85%~96.99%,而淀粉含量都较野生型植株的低,降低了9.69%~36.76%。说明UGPase在蔗糖与淀粉的转换过程中起着较为重要的作用,其催化的反应方向影响着组织中这两种产物(蔗糖和淀粉)的分配。     

Prd29A启动子在小麦中的诱导表达活性及大肠杆菌海藻糖合成酶基因的转化

以gus基因为报告基因，通过瞬时表达测定了Prd29A诱导型启动子在小麦愈伤组织中的诱导表达活性。结果表明，Prd29A-gus基因的表达水平可在不同浓度NaCl盐的胁迫条件下得到显著提高。由此证实，Prd29A启动子在小麦中具有较强的诱导表达活性。在此基础上，将Prd29A诱导型启动子驱动下的大肠杆菌海藻糖合成酶基因（otsA）采用花粉管途径导入目的小麦品系，经PCR筛选、Southern鉴定及转化后代海藻糖含量的测定，获得了一批otsA转基因植株及株系，为进一步选育耐盐抗旱的转基因小麦新品系奠定了基础．     

优化的VHb基因和融合杀虫基因在烟草中的表达

将人工合成的、密码子优化后的透明颤菌血红蛋白(VHb)基因(vgbM)与含有融合杀虫基因(GFMcryIA和CPTI)表达载体pGBIF4ABC构建成双价基因植物高效表达载体pGBIF4ABCVHB,通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导转化烟草(Nicotiana tabacum),经PCR及Southernblot检测,证实了双价基因在32株转基因烟草基因组中整合。Westernblot检测证实了vgbM基因的表达,杀虫实验表明,融合杀虫基因表达的毒蛋白具有杀虫活性,转基因烟草平均每株干重高于非转基因烟草植株8%。表明VHb基因和融合杀虫基因烟草在烟草中的表达可使烟草可增产,又具抗虫性。