碱性土壤基因组DNA的分离纯化和基因文库的构建

直接从广西南宁市凤凰纸业排污沟碱性土壤样品中抽提和分离纯化混合基因组DNA，所获得DNA的产量为每克土壤样品10～30pg。采用限制性内切酶EcoR1酶处理后，构建了以pGEM-3Zf( )为载体的DNA部分文库。文库的容量为23650个转化子。外源片段DNA平均大小为3．2kb。建库效率为每克环境样品获得6000个左右的含1～15kb外源随机插入片段的克隆。通过DNA序列测定和同源性比较，对从文库随机词取的16个转化子序列进行分析，发现13个外源插入片段包含序列尚未确定的DNA片段。     

海南根瘤菌I66 nodD基因DNA片段的克隆

从海南根瘤菌（Rhizobium hainanense)I66提取总DNA，用XbaI完全酶切，然后用苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti)042B的nodDDNA片段作探针进行Southern杂交，杂现2条含有nodD基因DNA征段的阳性条带，分别为4.0和6.0kb，电泳回收含有4.0-6.0kb的DNA片段，用pUC18作载体连接，并转化E.coliDH5α，构建含有nodD的部分基因文库，提取该文库的质粒与nodD探针做点杂交，筛选到nodD的阳性克隆，称为pUOD75。再将pUOD75的nodD片段克隆到pBBR-MCS-5,构建成pBOD75。用两亲本杂交，把pBOD75转入豌豆根瘤菌蚕豆生物型（Rhizobium eguminosarum bv.viciae)根瘤菌I66nodD基因在毛地黄黄酮诱导下得到表达，说明其表达产物可能具有结瘤调节功能。     

环境微生物基因组学的生态学管窥

自然界约99%的微生物不能通过传统的分离筛选途径进行培养(即未培养微生物),为获得新的基因资源,更全面地认识微生物多样性和微生物在自然环境和生物圈中的重要作用,近年来随着分子生物学的快速发展及其在微生物研究中的广泛运用,以环境中未培养微生物为研究对象的新兴学科--环境微生物基因组学成为国内外学者的研究热点.本文介绍了环境微生物基因组学的分析研究策略及生态作用:从环境样品中直接提取所有微生物的总DNA,采用适宜的载体克隆到宿主细胞中构建宏基因组文库,再筛选新的活性物质或基因;从生态学角度分析微生物不可培养的原因,可利用环境微生物基因组技术进行土壤污染修复、畜禽养殖除臭、鉴定新物种以及确定特定生态环境体系中未培养微生物种群与群落的结构组成及物种的进化模式.     

盐生植物海马齿盐胁迫全长cDNA文库的构建与分析

为了研究盐生植物耐盐基因表达调控,本实验以海水浇灌的海马齿植株为供试材料,构建了盐胁迫下的全长cDNA文库。构建方法如下：采用改良的CTAB法提取总RNA,SMART法反转录合成cDNA,LD-PCR方法合成双链cDNA。LD-PCR产物经蛋白酶K消化和SfiⅠ酶切后,经CHROMA SPIN＋TE-1000分离柱子除去小片段DNA后,回收0.5kb以上的片段,按照适当的比例连接λTripIEX2载体。连接产物利用MaxPlaxTMLambda Packaging Extracts进行体外包装,得到海马齿初级cDNA文库。初始文库的独立克隆数为2.4×106pfu,初级文库滴度大于4.80×106pfu/mL,重组率为93.75%,插入片段为0.5～5kb,扩增文库的滴度为1.21×109pfu/mL,所得文库质量较高。本研究表明该cDNA文库适合于盐生植物海马齿相关基因的克隆和分析。     

高盐极端环境土壤基因组DNA的分离纯化方法研究及基因文库的构建

以钦州市犀牛角镇晒盐池内(盐浓度>25%)的土壤样品为研究对象,对土壤混合基因组DNA的提取和纯化方法进行了深入研究,结果表明,冻融法、十二烷基磺酸钠(SDS)和蛋白酶K联合使用的提取法,能有效提高DNA得率,DNA的产量达到每克土壤样品10~15μg。交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、Sephadex G-200树脂以及大量胶回收的使用,可有效纯化DNA,纯化的DNA产量可达每克土壤样品4~6μg,DNA片段大小>30 kb。将纯化的DNA用B amHⅠ部分酶切后构建以pLAFR 3为载体的混合基因组文库,该文库包含15 600个克隆,外源片段DNA平均大小为18 kb。通过DNA序列测定和同源性比较,对从文库中随机挑取的10个克隆进行了序列分析,发现9个外源插入片段包含未知DNA序列。     

土壤微生物DNA木聚糖酶基因多样性的研究

采用国产硅胶Gk254（60型）代替进口Glass bead的改良方法抽提土壤微生物DNA，然后设计了一对扩增木聚糖酶基因片段的新简并引物，对抽提的土壤微生物DNA进行PCR扩增。扩增片段连接pMD18T载体，转化大肠杆菌，重组片段通过酶切进行RFLP分析后，测序分析得到10个木聚糖酶基因片段。对所得片段翻译的氨基酸序列进行BLAST分析表明有8个片段与来自放线菌的木聚糖酶具有较高的同源性，2个与假单胞菌的木聚糖酶具有较高的同源性。所得10个木聚糖酶片段的氨基酸序列同源性比较显示，第27个氨基酸均为天冬酰胺（N），暗示这些来自土壤微生物DNA的基因片段编码耐碱的木聚糖酶。通过构建系统进化树，发现扩增的木聚糖酶片段之间的相似性均在70％以上。     

黑籽南瓜基因组可转化人工染色体(TAC)文库的构建及分析

黑籽南瓜(Cucurb ita ficifolia)具有很强的抗逆能力,对低温、干旱、贫瘠土壤以及瓜类枯萎病等逆境均具有较强的抗性,这些优良的抗性基因很难通过有性杂交转移到其它瓜类作物上,但可通过可转化人工染色体(TAC)以大片段的形式转化到其它瓜类作物中.本研究利用TAC载体构建了黑籽南瓜基因组DNA文库,该文库包含57 560个克隆,保存在150块384孔板中,其库容量相当于黑籽南瓜基因组的7倍.TAC文库克隆插入片段大小分布范围为20～100 kb,超过40 kb插入片段克隆占40％以上,插入片段平均大小为45kb.在挑取的15个TAC克隆中无空克隆;细菌继代培养30、60和100代后质粒的酶切鉴定表明,TAC克隆可以在大肠杆菌(Escherichia coli) DH 10B中稳定复制和保存,说明本研究构建的文库质量较高.该研究结果表明,TAC文库为黑籽南瓜抗性基因的克隆、功能验证、物理图谱的构建和基因组测序等有关研究提供了基础资料.     

枯草芽孢杆菌B11基因文库的构建及与拮抗物质的生物合成相关基因的克隆

枯草芽孢杆菌菌株B 11对广泛的植物病原真菌和细菌都具有拮抗作用。以柯斯质粒pW EB∷TNC为载体构建了枯草芽孢杆菌菌株B 11的基因文库,文库含9 000个克隆。文库克隆中插入的DNA片段平均为42.1 kb,该文库含有菌株B 11基因组中任一基因的概率为99.99%。采用平板活性检测法筛选文库,筛选到1个对茄青枯假单胞菌菌株P 13具有拮抗活性的文库克隆GXN 9527,该克隆的重组质粒pGXN 9527含有50 kb的菌株B 11的DNA。文库克隆对革兰氏阴性植物病原细菌如水稻黄单胞菌水稻变种也具有拮抗活性,而对革兰氏阳性细菌如地衣芽孢杆菌和植物病原真菌如尖孢镰刀菌西瓜专化型、立枯丝核菌、水稻稻灰梨孢菌则没有拮抗活性。分别含有pGXN 9527的18、12、9、8 kb B amHⅠ片段的亚克隆对P 13均没有拮抗活性,说明编码该拮抗物质的生物合成基因很可能成簇存在。     

宏基因组中不依赖辅酶B12甘油脱水酶基因的筛选和表达

通过特定的引物,以土壤宏基因组DNA为模板,采用PCR技术扩增获得3．3kb的DNA片段,该片段连接于pSE380载体构建重组质粒pSE380-dhaB12用于测序和表达。序列分析表明,该DNA片段编码的氨基酸序列与已报导的丁酸梭菌不依赖辅酶B12甘油脱水酶的相似性达99％。通过IPTG诱导,dhaB12基因在大肠杆菌中表达成功,SDS—PAGE分析表明有88kD和34kD两条蛋白质条带,在没有辅酶B12存在的情况下,所表达的酶具有明显的甘油脱水酶活性。     

紫色水稻土水稳性团聚体土壤微生物基因组DNA提取方法探讨

为了找到提取土壤微生物总DNA的最佳方法,通过OD值检验、凝胶电泳、PCR和DGGE分析,比较了Reddy法、基于DNAout kit试剂盒改进的实验方法、以及Kuske修订法、Edgcomb改进法、SDS高盐提取法、Eichner调整法等常用的不同土壤微生物基因组的DNA提取方法在亚热带地区长期免耕紫色水稻土水稳性团聚体0.25～2.0 mm粒径上的提取效果.结果表明,6种方法都可以从团聚体中提取到长度大于23.1 kb的DNA片段,但不同方法提取的DNA的产量存在明显差异,土壤总DNA均不需纯化就可以用于PCR扩增,使用细菌16S rDNA基因V3区的通用引物可扩增得到相应的片段.研究表明,改进的DNAout kit试剂盒法是长期免耕紫色水稻土水稳性团聚体中微生物基因组DNA的最佳提取方法.