调控山羊乳腺脂肪酸代谢miRNAs筛选及相关pri-miRNAs克隆验证

microRNA(miRNA)是调控脂类代谢的重要分子。本研究采用数据库预测和自由能分析法,筛选与山羊(Capra hirus)乳腺脂肪酸代谢相关的miRNA,并对预测得到的miRNA进行克隆验证。预测结果表明,通过MicroCosm、TargertScan和PicTar3个在线数据库预测与山羊脂肪酸代谢相关的30个基因相对应的miRNA,预测得到50条miRNA,其中3个数据库预测一致的miRNA为13条,2个数据库预测一致的为37条。结果显示,脂肪酸合酶基因(FASN)对应4个不同的miRNA,嗜乳脂蛋白基因(BTN1A1)对应2个,而磷酸甘油酰基转移酶6基因(AGPAT6)没有预测到miRNA靶位点;FASN与BTN1A1的3’UTR上miR-103的结合位点分别有3个和2个。通过MFOLD软件对预测所得的50条miRNA靶位点两侧序列的自由能(ΔG>-20kcal/mol)进行分析,9种miRNA与调控脂肪酸代谢基因相关度较高,分别为miR-103/BTN1A1、miR-15/FASN、miR-23/LPL(脂蛋白酯酶)、miR-27/PPARγ(过氧化物酶体增殖物激活受体)、miR-29/GPR41(短链脂肪酸受体)、miR-146/BTN1A1、miR-195/FASN、miR-200/SCD(硬脂酰辅酶A去饱和酶)和miR-497/GPR41,其中miR-103/27/195分别位于BTN1A1、PPARγ和FASN的靶位点与已知物种间同源性较高,增加了这些miRNA/mRNA结合的可能性。此外,靶位点单侧和双侧ΔG小于阈值的miRNA/mRNA分别为14对和9对,其中miR-27/mRNA预测的靶基因为4个,依次为FASN、ACOX1(乙酰辅酶氧化酶基因1)、LPL和PPARγ,miR-103和miR-15的靶基因同为FASN、BTN1A1和ACOX1。以西农萨能奶山羊(Capra hirus)基因组DNA为模板,可扩增出与5条miRNA(miR-103-1/23a/27a/146b/200a)分别相对应的初级miRNA(pri-miRNA);通过序列分析和二级结构分析表明,5条pri-miRNA均包含完整的pre-miRNA序列,同时具有典型的茎环结构,能够产生相应的miRNA。与牛的同源性分析表明,除pre-miR-27a同源性为98%外(山羊pre-miR-27a3’端第11个碱基为G,而牛为A),其余4条pre-miRNA同源性均为100%。因此,本研究筛选的9种miRNA可能调控山羊乳腺脂肪酸代谢,克隆的5条pri-miRNA为其功能研究提供基础。     

甜杨低温响应microRNAs的克隆与分析

MicroRNAs（miRNAs）作为一类21碱基左右的非编码小RNAs,参与植物生长发育的调控,并在植物对生物与非生物胁迫的应答过程中发挥重要作用。本研究依据miRNA高度保守特点,利用已公布的毛果杨（Populus trichocarpa）基因组序列设计引物,从甜杨（Populus suaveolens）基因组中克隆获得了12个miRNA基因座序列。序列比对结果表明,这些miRNA基因均为毛果杨低温响应miRNA基因的同源序列。同时,以低温（0℃）处理0～48h的甜杨幼苗为试材,通过半定量RT-PCR法对miRNA基因的成熟体序列在不同处理时间下的表达谱进行分析,结果显示,大多数miRNA成熟体序列在甜杨低温胁迫下的表达模式与其在毛果杨中的表达极为相似,由此可推测这些保守性miRNAs可能在甜杨和毛果杨两物种对低温胁迫的应答反应中发挥相似的功能,而miR168a、miR168b和miR475a在两物种间表达现象的差异,表明它们可能通过调控多种靶基因而发挥不同作用。本文结果将为进一步研究甜杨基因功能提供基础。     

金华猪和大约克猪分娩后21d乳腺microRNAs的预测和差异研究

microRNAs(miRNAs)是一类单链小RNAs,是重要的基因表达调控因子,通过与靶基因的3'UTR序列互补来调控基因的表达。鉴定乳腺组织的miRNAs及其靶基因,对揭示miRNA在乳腺组织基因调控中的作用十分重要。本研究分别从分娩后21d金华和大约克母猪的乳腺组织中提取小RNA并构建各自的cDNA文库,通过Illumina Genome AnalyzerⅡx测序平台对它们进行高通量深度测序。将测序初始序列经过序列类型、长度、丰度的筛选得到比对序列,然后与已有的miRNA数据库、Genome和EST数据库进行比对。将两个猪种检测到的miRNA进行品种间差异性比较,并在差异性结果中选择相对丰度较高的前10个miRNA对其进行生物信息学分析。结果发现:金华猪乳腺组织的比对序列有9672024条,大约克猪6946905条;共检测到金华猪单一序列miRNA有848个,大约克猪683个;金华猪预测的新单一序列miRNA有369个,大约克猪231个;两个猪种间差异显著的miRNA有288个(P<0.01);相对丰度较高的前10个miRNA的靶基因有1829个,这些靶基因主要参与了抗原加工和呈递、Ⅰ型糖尿病、缝隙连接...     

调控植物花发育的miRNAs的研究进展

花发育是高等植物生长发育过程中的重要事件,可剖分为开花诱导、花的起始和花器官发育3个阶段,是由多种基因参与的十分复杂的调控过程。20年来,人们应用克隆、诱变和突变体等研究技术从模式植物中分离和鉴定了大量调控花发育的功能基因或调控因子,其中,microRNA(miRNA)是本世纪初才发现的一类新的调控因子。miRNA是生物体内长度约为21个核苷酸的非编码小RNA,通过与靶mRNA的互补配对而在转录后水平上对基因的表达进行负调控,导致mRNA的降解或翻译抑制。大量研究证实miRNA在花发育中起着重要的作用。文章重点综述了植物miRNA的作用机制、其功能研究方法及7个miRNA家族在花发育中的生物功能,并对其未来的发展方向进行了展望。     

马氏珠母贝(Pinctada matensii)3个DM结构域的克隆及系统进化分析

Dmrt 基因编码的是一类新的具有锌指结构的转录因子，它们均含有一个DM(Double sex 和Mab - 3) 结构域，在性别分化发育和体节分化等过程中起着重要调控作用。尽管已在多种动物中克隆了Dmrt基因的多个成员，但在贝类中未见任何有关Dmrt基因的报道。本研究通过简并PCR克隆技术，从马氏珠母贝（Pinctada matensii）基因组中克隆到3个不同的DM序列（pmDmrt2，pmDmrt3 pmDmrt4）。证实了在马氏珠母贝基因组中也存在Dmrt基因家族的多个成员。序列分析表明，pmDmrt2编码的氨基酸序列与斑马鱼、爪蟾、红原鸡、家鼠、人等的Dmrt2的一致性为95 %；pmDmrt3编码的氨基酸序列与斑马鱼、青鳉、红原鸡、家鼠、人的Dmrt3的一致性为85%；pmDmrt4编码的氨基酸序列与青鳉、红鳍多纪鲀的Dmrt4一致性高达97%，进一步证明该基因家族在无脊椎动物和脊椎动物都具有高度的进化保守性。     

60Co-γ射线辐射水稻小RNA测序变异分析

为探讨γ射线辐射引起水稻损伤效应的小RNA变异,采用0、300和400 Gy的⁶⁰Co-γ射线辐射处理水稻高粳糯种子,利用Illumina HiSeq^TM 2500高通量测序平台对辐射后的高粳糯三叶期叶片进行小RNA测序。结果显示,0 Gy(对照)组共获得7 395 578个小RNA,254个已知miRNA成熟序列,26个新miRNA成熟序列;300 Gy剂量组(Gy3)共获得10 315 701个小RNA,265个已知miRNA成熟序列,29个新miRNA成熟序列;400 Gy剂量组(Gy4)共获得6 469 869个小RNA,261个已知miRNA成熟序列,29个新miRNA成熟序列。GO富集分析显示,Gy4 vs CK组差异miRNAs对应的候选基因富集到生物过程、细胞组分和分子功能三大类共58个小类,其中涉及分子功能的基因最多。Gy3 vs Gy4组差异miRNAs对应的候选基因富集到生物过程和分子功能两大类共7个小类,以离子结合、过渡金属离子结合和氧化还原酶活性占主要比例。KEGG富集分析显示前20条显著富集途径,Gy3 vs CK组差异miRNAs对应的候选基因富集到植物病原互作最高,富集最显著的是植物昼夜节律。Gy4 vs CK组差异miRNAs对应的候选基因组富集到代谢途径最高,富集最显著的是甘油磷脂代谢和醚脂类代谢,Gy3 vs Gy4组差异miRNAs对应的候选基因富集到甘油磷脂代谢、真核生物的核糖体发生和内吞作用三个途径最高,富集最显著的是醚脂类代谢。本研究从RNA水平为辐射诱变水稻引起当代的苗期损伤效应提供了新见解。     

青鳉鱼DBI基因全长cDNA的克隆与蛋白结构分析

地西泮结合抑制因子(diazepam binding inhibitor,DBI)具有抑制由葡萄糖诱导的胰岛素分泌、促进胆固醇跨线粒体膜转运和调节脂肪酸合成与代谢等多种生理功能。本研究使用反转录PCR结合RACE方法克隆了青鳉鱼(Oryzias latipes)的DBI基因全长cDNA序列。该序列全长592bp,包含长度为102bp的5'端非编码区(5'-UTR),长度为220bp的3'端非编码区(3'-UTR),和长度为270bp的开放阅读框,推测其编码89个氨基酸。同源性分析结果显示青鳉鱼DBI蛋白序列与大西洋鲑、鲤鱼、斜带石斑鱼、斑马鱼、非洲爪蟾、大鼠和人的同源性分别为82%、76%、76%、75%、72%、71%和70%,说明DBI基因在脊椎动物的进化过程中非常保守。同源建模显示青鳉DBI蛋白的4个α螺旋结构围成一个脂酰CoA结合口袋,与已测定果蝇DBI蛋白具有非常相似的三级结构。本研究结果为阐明脊椎动物在进化过程中DBI分子结构的演变规律及DBI在低等脊椎动物中的作用机理等提供了有意义的科学参考。     

拟南芥中Importin β蛋白负向调节MicroRNA活性

MicroRNAs(miRNAs)是真核生物基因调节网络上的一个重要成员,同时其自身代谢和活性也受到调节。miRNA是一类内源性的长约20～24nt的非编码小RNA,通过特异性降解靶mRNA或诱导翻译抑制的方式调控真核生物的生长发育、器官     

人类基因组miRNA转录调控区保守性DNA序列生物信息学分析

MicroRNA(miRNA)的表达调控方式一直是一个有争议的问题,为了研究miRNA潜在的转录调控特点,本文通过Sanger网站miRNA数据库获得人类miRNA的信息,并建立miRNA相关信息数据库,用MEME和Wordspy两个软件对其上游2000bp序列进行保守性分析,得到保守性的DNA序列(motif),用TESS软件分析保守性DNA序列,预测其转录因子结合情况。通过比较位于基因间、反义链和内含子中的三类不同miRNA转录调控区的保守性和自主转录能力的差异,结果发现位于基因间、反义链上的miRNA上游调控区的保守性比位于内含子的miRNA高,在miRNA的转录调控区存在RNA聚合酶Ⅱ类型的转录因子结合位点,miRNA还表现出自身独特的转录调控方式。通过分析,我们还得到了miRNA表达调控中一些重要的转录因子以及独特的调控序列。本研究结果为miRNA转录调控机制的进一步研究提供了理论依据。     

植物miRNA编码小肽(miPEP)的研究进展

miRNA(microRNA)是一类长度在19~24nt的小分子RNA,参与动植物生长发育过程中的基因转录后表达调控。miPEP(microRNA-encoded peptide)是由miRNA初始转录物(primary miRNA,pri-miRNA)翻译生成的短肽。植物中的miPEP通常促进对应pri-miRNA的表达,从而增强miRNA对靶基因表达的调控。本文从miPEP的形成、生物学功能和调控机理三个方面对植物miPEP研究进展进行综述,同时也针对miPEP研究领域一些关注的问题进行讨论。     

miR-106-363基因簇在脊椎动物中的进化分析

microRNA（miRNA）是一类在真核生物体内广泛表达的非编码小分子RNA,在生物体生长、发育以及疾病发生等过程中都起着极其重要的作用。miR-106-363基因簇是一个高度保守的基因簇,编码miR-106、miR-18、miR-20、miR-19、miR-92和miR-363等6个miRNA。本文通过对miRBase数据库检索以及同源搜索的方法在16种脊椎动物中搜索到了miR-106-363基因簇。该miRNA基因簇在高等脊椎动物中高度保守,稳定存在。系统进化树分析表明,miR-106-363基因簇与miR-17-92基因簇有着共同的祖先,且在进化上miR-17-92基因簇有着更早的起源。     

植物miR168的研究进展

microRNAs（miRNAs）是真核生物中一类长约22 nt的非编码小分子RNA,它通过对靶mRNA的切割或抑制靶mRNA的翻译调控基因的表达,从而对靶基因实施转录后水平负调控,在植物器官的形态建成、生长发育、信号转导及植物对逆境胁迫的应答中起着重要的作用。miR168是植物特有的一类RNA小分子,其主要的靶基因AGO1蛋白是RNA沉默复合体的重要组成成分,广泛参与对靶mRNA的剪切。本文综述了miR168的发现及其在植物中的分布、miR168与AGO1蛋白的关系、miR168对逆境胁迫的响应以及其在动植物间的跨界调节等,为进一步帮助人们了解miR168的功能及其参与动植物间跨界调节这一特性奠定良好的基础。     

应用两种策略克隆猪miRNAs let-7b及 let-7c

MicroRNAs（miRNAs）为一类大小约22个核苷酸的非编码小分子RNA，它们能通过与靶mRNA 的3′UTR（非编码区）完全互补导致mRNA降解，或不完全互补结合阻断mRNA翻译。研究表明，miRNAs在动植物的生长发育，免疫调节，病毒感染等过程中发挥了重要作用。本文分别利用构建小RNA的cDNA文库和RNA加尾、引物延伸RT-PCR克隆法从猪骨骼肌中鉴定了miRNAs let-7b和let-7c，并综合比较了这两种方法的优缺点，为推动猪miRNA的克隆鉴定提供了新的策略。     

植物逆境microRNA的研究进展

MicroRNA（miRNA）在生物中广泛存在,在调控植物生长和发育方面起重要作用。多种非生物逆境会影响植物生长,不同逆境胁迫还会使植物相应的miRNA诱导或下调表达,有时一种miRNA会同时受几种逆境胁迫影响。本文综述了植物中参与温度、水分、盐、养分、氧化、ABA、重金属及其它非生物逆境胁迫的miRNA及其作用机制的研究进展。     

拟南芥中与植物生长和耐寒相关的miRNA表达载体的构建

本研究通过PCR方法从拟南芥基因组序列中分离了3个理论推断与耐寒相关的miRNA片段（miRNA402,miRNA319和miRNA393）和1个与植物生长相关的片段miRNA172。利用重叠延伸PCR技术将miRNA172小分子,以及3个与耐寒相关的miRNA402,miRNA319和miRNA393小分子串连在一起分别导入植物表达载体pVKH-35S-GUS-pA,取代表达载体中的GUS基因,构建了pVKH-35S-mir172-pA和pVKH-35S-mir31＋402＋393-pA融合表达载体。经PCR和双酶切及测序鉴定,pVKH-35S-mir172-pA和pVKH-35S-mir319＋402＋393-pA构建成功,为后续利用基因工程手段,miRNA转化木薯,提高木薯生长和木薯耐寒相关研究奠定基础。     

苎麻纤维不同发育时期差异表达miRNAs的表达谱分析

miRNA在植物生长发育过程中起着重要的调控作用。本研究从苎麻纤维伸长期和胞壁加厚、端壁溶合期的中苎1号苎麻韧皮组织为材料的miRNA芯片中筛选出3个差异表达的miRNAs：miRl450、miRl56h和miRl72bl。利用半定量RT—PCR技术对3个差异表达miRNAs在4个苎麻纤维发育时期（苎麻纤维分生期,纤维伸长期,胞壁加厚端壁融合期和纤维成熟期）的韧皮组织以及花、叶、根和地下茎等组织和器官中的表达情况进行研究。结果表明供试的3个miRNA在苎麻纤维伸长期和胞壁加厚端壁融合期的表达量均为差异表达,进一步验证了芯片结果,其中mi1450在纤维成熟期表达量最高,在纤维伸长期的表达量最低;mi156h在花、地下茎、根和叶中的表达量显著高于4个苎麻纤维发育时期;mi172bl在纤维分生期的表达量最高,在花中的表达量最低。本研究建立了苎麻miRNA的茎环RT．PCR检测体系,为进一步研究miRNA在苎麻纤维发育过程中的作用奠定了基础。     

MicroRNA调节豆科作物营养胁迫响应的研究进展

micorRNA (miRNA)是一类长度为20~24个核苷酸的非编码小RNA(small RNA,sRNA),在植物生长发育、 生物和非生物胁迫响应方面起十分重要作用。越来越多的证据表明,miRNA在植物适应养分胁迫方面起重要的调节作用。豆科植物是一类具有生物固氮能力的植物,为人类提供蛋白和食用油,显然土壤养分胁迫会抑制豆科作物生长发育而降低产量。过去数十年对于miRNA介导模式植物拟南芥和水稻养分胁迫响应的研究较多,但近年来有关豆科作物养分胁迫相关的miRNA报道在增加。近年研究结果表明,miRNA通过对靶基因的调节在豆科植物适应营养胁迫中起关键作用,如感受外界养分状态的改变及维持体内养分的动态平衡。本文综述了近年来miRNA介导豆科作物适应养分胁迫的研究进展,主要对磷、 氮、 硫、 铁、 铜、 钙等养分亏缺或毒害反应的调控,讨论了miRNA调节豆科作物适应养分胁迫的机理,并对今后豆科作物miRNA的研究做出了展望。     

人乳汁中microRNA的稳定性研究

为了研究人乳汁中的microRNAs（miRNAs）在体外储存状态下的稳定性。本研究采用模拟体PbYL汁储存条件,对乳汁进行室温孵育24h,反复冻融6次,100℃孵育10min,以及模拟体内消化环境（RNA酶～T137℃孵育1h）的处理条件,通过实时荧光定量PCR（qRT．PCR）方法检测处理前后乳汁中9个内源性免疫相关和1个外源性人工合成miRNA的相对表达量变化差异。研究结果显示：处理前后乳汁中内源性miRNAs和外源性miRNA均显著性降解（p〈0．01）。内源性miRNAs降解为初始量的25％～70％之间,而外源性miRNA则急剧降解至初始量的0．06％～0．96％。我们的实验表明人乳汁中内源性的miRNAs较外源性miRNAs在体外不同环境下具有更强的稳定性。     

鸡β-防御素-1真核表达载体构建及其在Flp-In-293细胞中的表达

以防御素为研究对象探讨其药用开发价值已是国内外生物医学研究领域的热点之一,鸡β-防御素-1（Gallinacin-1,Gal-1）对许多致病菌都具有杀菌作用,具有很好的研究开发价值。本研究以含有Gal-1成熟肽全长cDNA的重组质粒pMD19-T-Gal-1为模板,通过PCR在Gal-1成熟肽基因C末端引入6×His-tag,并将其克隆到pcDNA3.1（＋）载体中,构建真核表达质粒pcDNA3.1（＋）-Gal-1-His;经脂质体介导转染Flp-In-293细胞,48h后间接免疫荧光分析,结果重组质粒pcDNA3.1（＋）-Gal-1-His转染的Flp-In-293细胞中有绿色荧光,而阴性对照中无荧光,表明Gal-1-His在Flp-In-293细胞中得到了表达。本研究结果将为进一步研究Gal-1的功能奠定基础。