高致病性猪蓝耳病弱毒疫苗与灭活疫苗体液免疫效果比较

[目的]分析比较高致病性猪蓝耳病弱毒疫苗和高致病性猪蓝耳病灭活疫苗体液的免疫效果。[方法]随机分为试验A组、B组和对照组,分别给予高致病性猪蓝耳病弱毒疫苗接种、高致病性猪蓝耳病灭活疫苗接种和生理盐水,观察三组仔猪接种28 d、60 d、90 d时的S/P值和PRRS抗体阳性率。[结果]试验A组仔猪免疫后28 d时S/P值达到2.0以上,上升速度较快,且免疫28 d后,试验A组的PRRS抗体检测阳性率为96.67%,明显高于试验B组,组间差异具有统计学意义。[结论]高致病性猪蓝耳病弱毒疫苗的抗体水平和抗体上升速度较快,免疫作用较强,在使用时可以优先考虑弱毒疫苗。     

鸡传染性支气管重组鸡痘病毒基因工程疫苗对异源LHB株病毒攻击的免疫保护

rFPV-IFNγS1是一株共表达传染性支气管炎病毒S1基因和鸡干扰素-γ基因的重组鸡痘病毒,将其接种SPF鸡3周后,用传染性支气管管炎病毒异源毒株攻击,考察重组疫苗对异源毒株攻击的保护作用。结果显示,疫苗接种后,免疫鸡血清中抗体很快产生,外周血中CD 4 和CD 8 T淋巴细胞与非免疫对照组相比都有显著差异。用LHB株IB病毒攻击后,免疫鸡的病理损伤明显轻于非免疫对照组,并且其排毒时间明显缩短,排毒量明显减少,攻毒后免疫组的发病率为30%(3/10),死亡率为10%(1/10),非免疫对照组的发病率为100%(10/10),死亡率为40%(4/10)。体重分析结果表明,攻毒前后免疫组与对照组相比,体重均没有显著变化,但攻毒后免疫组鸡体重增长的幅度要高于非免疫对照组。从以上结果可以说明,重组疫苗能在动物体内很好表达,对试验动物产生较好的保护作用,同时也减轻了重组疫苗对体重增长的抑制作用。     

表达伪狂犬病毒gC糖蛋白基因重组腺病毒的构建及其免疫效果研究

通过双酶切将伪狂犬病毒(Pseudorabies virus, PRV)Fa株gC囊膜糖蛋白基因片断亚克隆到5型腺病毒AdMax系统穿梭质粒pDC316中，得到pDC316-gC。用此质粒与腺病毒DNA辅助质粒pBHGloxΔE1,3Cre共转染293细胞,初步成功包装出重组腺病毒Adv-gC。进一步通过PCR鉴定和病毒空斑纯化，得到纯的高效价Adv-gC病毒液。间接免疫荧光实验证明此重组病毒能表达PRV gC蛋白。该病毒经肌肉免疫BALB/c小鼠,结果表明能诱导小鼠产生特异的体液和细胞免疫反应，即针对gC蛋白的总抗体IgG、针对PRV的中和抗体和足垫迟发型超敏反应DTH。攻毒实验表明，此重组病毒能提供100％的免疫保护，而对照组为0%。表达PRV gC基因复制缺陷型重组腺病毒的构建及其免疫效果的初步测试，为研制PRV新型活载体疫苗奠定了基础。     

重组伪狂犬病毒(rPRV-GP5)对伪狂犬病最小免疫剂量的测定

伪狂犬病(Pseudorab ies PR)是由伪狂犬病毒(PRV)引起的,可导致多种家畜和野生动物以发热、奇痒(猪除外)及脑髓炎为主要症状的急性传染病。猪是该病毒的中间宿主和传染源,感染后可引起妊娠母猪发生严重的繁殖障碍造成死胎、流产和木乃伊胎,患病仔猪表现为神经症状和呼吸道病,多以死亡告终。在规模化、集约化、现代化高密度养猪地区,PRV可在猪群间不断传播,是危害我国养猪业的一个重要传染病。用疫苗进行免疫接种是预防、甚至消灭伪狂犬病的根本措施。目前伪狂犬病疫苗在我国应用最多的是Bartha-K 61株,该疫苗是20世纪60年代匈牙利Bartha等人将野毒株用鸡胚成纤维细胞反复传代而获得的一个人工致弱疫苗株,该毒株呈现gE基-因缺失表型,其毒力大大减弱,免疫原性很好,是世界上公认的优良疫苗株。我们以Bartha-K61株为载体构建了表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)CH-1a株GP5基因的重组伪狂犬病病毒(rPRV-GP5),但GP5基因的插入是否会改变伪狂犬病病毒Bartha-K61株对伪狂犬病的免疫保护效力?为此本研究通过测定重组伪狂犬病毒(rPRV-GP5)对伪狂犬病的最小免疫剂量,评价rPRV-GP5对伪狂犬病的保护效力。24只5~6月龄PRV阴性健康绵羊随机分成6组,每组4只,其中1组为生理盐水对照组,其余5组分别后腿肌注重组伪狂犬病毒(rPRV-GP5)冻干疫苗(病毒含量为5×106.0TCID50/mL)5×104.0TCID50/只、5×103.0TCID50/只、5×102.0TCID50/只、5×101.0TCID50/只和5TCID50/只,免疫后15 d每只绵羊肌注伪狂犬病毒猪源强毒S株1000 LD50。结果表明:对照组和5TCID50/只组的全部绵羊攻毒后4~5 d均出现典型伪狂犬病症状并死亡,5×101.0TCID50/只组4只绵羊中有2只发病并死亡,其余各组全部保护。结论:重组伪狂犬病毒(rPRV-GP5)对绵羊最小免疫剂量为100 TCID50/只,GP5基因的插入没有影响伪狂犬弱毒疫苗Bartha-K61株的免疫原性。     

猪瘟DNA疫苗的临床免疫实验

在前期研究工作筛选出2种DNA疫苗质粒的基础上,采用3种免疫策略(DNA疫苗单独免疫法、DNA疫苗初免蛋白免疫加强的prime-boost方法以及沙门氏菌(Salmonella)载体介导法),于某规模化猪场对猪瘟病毒(CSFV)的DNA免疫效果进行了临床应用研究。随机选择未经猪瘟疫苗免疫的断奶仔猪60头,分6组进行免疫接种,检测免疫猪抗体产生情况并对各组免疫猪进行攻毒试验。免疫猪血清抗体ELISA检测结果表明,pcDSW组、pIRE2IL2组、pcDSW E2protein组和pIRE2IL2 E2protein组均产生了较高的抗体水平,而沙门氏菌介导的2种DNA疫苗质粒诱导的抗体水平不显著。攻毒试验结果表明,pcDSW和pIRE2IL2单独免疫组或prime-boost组能够抵抗致死剂量的CSFV石门强毒攻击,保护率87.50%￣90.00%。其中pcDSW效果好于pIRE2IL2。而沙门氏菌介导的DNA疫苗组不能产生有效保护。不同接种途径的免疫效果比较结果表明,颈部肌肉注射免疫后产生的抗体水平较后肢胫前肌注射免疫产生的抗体水平高。     

鸡γ干扰素对H5亚型禽流感疫苗的免疫增强作用

利用表达鸡γ干扰素的重组鸡痘病毒(rFPV-IFN-γ)与表达H5亚型禽流感病毒血凝素基因的重组鸡痘病毒(rFPV-HA)或灭活疫苗联合应用，接种SPE鸡、无母源抗体商品鸡和含有母源抗体商品鸡，研究鸡γ干扰素的免疫增强作用。结果发现，rFPV-IFN-γ和rFPV-HA联合应用诱导的HI抗体应答水平同rFPV-HA单独免疫相近；rFPV-IFN-γ和灭活疫苗联合应用后HI抗体应答水平略低于灭活疫苗单独免疫组。攻毒后，对于SPF鸡和无母源抗体商品鸡，rFPV-IFN-γ与rFPV-HA或灭活疫苗联合免疫诱导的保护率同相应疫苗单独免疫相当，均为95％～100％；对含有母源抗体的商品鸡，10^6PFU的rFPV-HA与10^5PFU的rFPV-IFN-γ联合免疫组保护率(33．5％)高于rFPV-HA单独免疫组(11．4％～16．8％)，而其它剂量组合的rFPV-HA与rFPV-IFN-γ联合应用不能提高免疫保护效力；rFPV-IFN-γ与灭活疫苗联合免疫含母源抗体商品鸡诱导的保护率同灭活疫苗单独免疫组相近。结果表明，rFPV-IFN-γ不能促进疫苗诱导的HI抗体应答；适当剂量组合的rFPV-HA与rFPV-IFN-γ联合免疫含有母源抗体的商品鸡，可提高免疫保护效力，发挥免疫增强作用。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白的表达及其单克隆抗体的制备

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and resp iratory syndrom e,PRRS)是以妊娠母猪繁殖失败和仔猪出现呼吸困难为特征的传染病,PRRSV是该病的病原体。将PRRSV CH-1a株ORF6基因疏水性较强的区域删除后,克隆于pGEX-6p-1载体中,转化大肠杆菌,并进行诱导表达。经SDS-PAGA分析发现,表达了M r约为37 000的融合蛋白rtM,W estern b lot分析证实,重组蛋白能被PRRSV抗血清所识别。收获融合表达的rtM,按50μg/只的剂量与等量弗氏佐剂乳化后,经腹腔接种BALB/c小鼠,免疫3次后,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,用rtM作为包被抗原,通过间接EL ISA方法筛选阳性克隆,结果获得了1株能稳定分泌抗rtM蛋白抗体的杂交瘤细胞株,将其命名为M 2B3。间接免疫荧光检测结果发现,所获得的单克隆抗体能与PRRSV感染细胞产生特异性免疫荧光。亚型鉴定结果显示,单克隆抗体M 2B3为IgG 1型,其轻链均为κ链。研究获得的融合蛋白rtM及单克隆抗体将为今后深入研究PRRSV病毒结构和功能,分析M蛋白的抗原表位等提供有益帮助。     

猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）S蛋白5′端基因重组腺病毒的构建及其免疫特性

RT-PCR扩增出猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）S蛋白基因5′端包含B、C抗原位点的1.0kb DNA片段，并与穿梭载体pShuttle-CMV连接；然后与腺病毒（Adenovirus）骨架载体pAdEasy-1共转化大肠杆菌（Es-chenchia coli）BJ5183，通过同源重组获得重组腺病毒质粒。该重组腺病毒质粒转染HEK293细胞并进行噬斑纯化，获得了1株含有TGEV S蛋白5′端基因的重组人复制缺陷型血清5型腺病毒rAd-TGEV-S。随后用RT-PCR和间接免疫荧光（indirect immunofluorescent assay，IFA）检测目的基因的转录与表达。重组腺病毒rAd-TGEV-S在HEK293细胞连续传代9次后，病毒效价稳定，滴度平均为10^7.7TCID50／mL。动物免疫试验显示，rAd-TGEV-S可以诱导小鼠产生TGEV特异性IgG和IgA。     

猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白5'端基因重组腺病毒的构建及其免疫特性

RT-PCR扩增出猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus, TGEV）S蛋白基因5'端包含 B、C抗原位点的1.0 kb DNA片段，并与穿梭载体pShuttle-CMV连接；然后与腺病毒（Adenovirus）骨架载体pAdEasy-1共转化大肠杆菌（Escherichia coli）BJ5183，通过同源重组获得重组腺病毒质粒。该重组腺病毒质粒转染HEK293细胞并进行噬斑纯化，获得了1株含有TGEV S蛋白5'端基因的重组人复制缺陷型血清5型腺病毒rAd-TGEV-S。随后用RT-PCR和间接免疫荧光（indirect immunofluorescent assay, IFA）检测目的基因的转录与表达。重组腺病毒rAd-TGEV-S在HEK293细胞连续传代9次后，病毒效价稳定，滴度平均为107. 7TCID50/mL。动物免疫试验显示， rAd-TGEV-S可以诱导小鼠产生TGEV特异性IgG和IgA。     

鸡新城疫病毒F基因与鸡白介素-2(IL-2)基因在真核载体中串连表达及免疫原性

为了探索鸡白介素-2(IL-2)对鸡新城疫病毒(NDV)F蛋白免疫效果的增强作用,本研究通过重叠延伸PCR技术(SOE-PCR)利用连接子(G2SG3S)将鸡IL-2基因和鸡NDV F基因串连,克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建了表达质粒pcDNA-IL-2-F.通过脂质体介导DNA瞬时转染法,将重组质粒pcDNA-IL-2-F和pcDNA-F分别转染鸡胚成纤维细胞,Western blot验证表明,pcDNA-IL-2-F和pcDNA-F均能瞬时表达F蛋白,表达蛋白分别为76.0和59.6 kD,表达蛋白的大小与预期一致并具有抗原性.将表达质粒免疫SPF鸡(Gallus domedticus),6d后开始用ELISA方法检测NDV的特异抗体,免疫20 d后,用F48E9进行攻毒.结果显示,免疫pcDNA-IL-2-F的鸡群产生的抗体水平(P＜0.05)高于混合免疫pcDNA-IL-2和pcDNA-F,高于免疫pcDNA-F的鸡群,但比免疫Lasota组的抗体水平要低.攻毒试验说明免疫pcDNA-IL-2-F组比免疫其他质粒组保护率高,这说明串连表达的免疫效果要好于二者的联合使用,为病毒病疫苗的研制提供了思路.     

鸡传染性鼻炎自家油乳苗免疫的研究

本试验用从广西分离的二株引起鸡传染性鼻炎的副鸡嗜血杆菌 ( H aemophilus paragallinarum,H.pg) GX 97、GX 981株研制成自家油乳苗 ,进行后备鸡免疫试验 ,免疫后 3、 6、 9和 1 2个月进行免疫抗体检测和攻毒试验。结果表明 ,免疫后 6个月 90 %免疫鸡的抗体滴度在 1∶ 640以上 ,9个月抽样攻毒有 75%～ 80 %的鸡获得保护。大田免疫试验也获得了良好的效果。证明自家油乳苗免疫接种也是防制该病的一个有效途径。     

HA基因密码子及表达载体优化的H5亚型禽流感DNA疫苗免疫保护效果比较

为评估HA基因密码子优化及不同表达载体对H5亚型禽流感DNA疫苗免疫效果的影响，pCIHA5、pCAGGHA5 、pCIoptiHA5和 pCAGGoptiHA5分别以100 和10 μg剂量一次免疫3周龄SPF鸡，4周后分别用100 LD50的高致病力禽流感病毒(HPAIV) A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]鼻腔途径进行攻击，观察发病与死亡情况，分别于攻毒后第3、5和7无采集喉头及泄殖腔拭子进行病毒分离、滴定检测排毒情况，同时检测免疫后、攻毒前及攻毒后血清HI抗体、AGP抗体的动态变化，对4种疫苗单次免疫的免疫保护效果进行比较评估。结果表明，100 μg剂量组中， pCAGGoptiHA5和pCAGGHA5 均可对免疫鸡形成100％完全保护（不发病、不致死和不排毒），pCIoptHA5(75%) 和pCIHA5(50%)仅可形成部分免疫保护；10 μg剂量免疫组中， pCAGGoptiHA5和pCAGGHA5 可对免疫鸡形成100％的保护（不发病和不致死），pCIoptiHA5可形成对免疫鸡的部分免疫保护(75%)，而pCIHA5则基本不能形成免疫保护。结果表明，HA基因密码子的优化以及鸡β-actin启动子表达载体pCAGGS可显著提高H5亚型禽流感DNA疫苗诱导的保护性抗体免疫反应水平，增强免疫保护效果同时证明，通过密码子和载体的优化，可使H5亚型禽流感DNA疫苗有效免疫保护剂量降低至10 μg，其推广应用已具备充分的经济可行性。pCAGGoptiHA5作为免疫效果良好、成本低廉的优化DNA疫苗，有望成为预防H5亚型高致病力禽流感的高效、安全新型基因工程疫苗。     

体内外感染PRRSV处理下仔猪脾淋巴细胞增殖活性的变化

为了探讨体内或体外感染猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndromevirus,PRRSV）的仔猪脾淋巴细胞在体外培养的增殖能力,本研究将PRRSV—GXA分离株经Mare-145细胞大量增殖培养,然后体内感染仔猪,接种病毒后分别于第11天、第14天和第21天从活体猪收获脾脏,分离脾淋巴细胞后用ConA和LPS于体外进行诱导增殖。研究结果显示第11天收获的T淋巴细胞增殖能力高于对照组,而B淋巴细胞增殖能力明显下降;第14天收获的T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖能力均极显著低于对照组;第21天收获的B淋巴细胞增殖能力略高于对照组,T淋巴细胞增殖能力略低于对照组。同时,用不同滴度的PRRSV体外感染PRRSV阴性的猪脾淋巴细胞,经ConA和LPS诱导增殖后,发现病毒滴度在10^3-10^6TCID50/mL范围内,能明显提高脾淋巴细胞的体外增殖能力;而病毒滴度在10^0-10^2TCID50/mL范围时,脾淋巴细胞增殖能力低于对照组。本研究结果说明PRRSV体内或体外感染对仔猪脾淋巴细胞增殖活性均有显著的影响,将为临床上PRRS的综合防治提供理论依据。     

猪肺泡巨噬细胞感染PRRSV进程中差异表达基因及基因功能富集分析

猪呼吸和繁殖综合症病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）感染猪后会引起妊娠母猪严重繁殖障碍和仔猪呼吸困难及高死亡率,给养猪产业造成了巨大经济损失,因此挖掘PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞进程中差异表达的基因及机理有重要意义。本研究对来自GEO数据库的PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞sage表达谱数据GSE10346进行后续挖掘。先用sage软件处理,经sagemap注释得到上调已知基因49个,下调已知基因41个。利用AgBase网站上的GORetriever工具和GOSlim Viewer工具进行细胞组分（cellular component）、分子功能（molecular function）及参与的生物过程（biological process）分类后发现有4个基因与病毒的复制相关：其中IL8已有报道认为与抗PRRSV相关;TNF-α能够抑制PRRSV复制;PPIA可能与GP5蛋白胞外区中和决定簇与抗体发生作用的24位脯氨酸有关;ICAM-1在嗜中性粒细胞的产生中起关键作用,与病毒吸附相关。这4个基因与PRRSV的致病机制相关,可望用于抗PRRSV研究。进一步利用David在线工具进行基因功能富集分析后,发现几个免疫通路,如趋化因子通路,Toll-like受体信号通路和NOD-like受体信号通路具有检验显著性,这些免疫通路在PRRSV感染过程中起着一定作用,有望成为抗PRRSV的靶通路。     

磺胺二甲氧嘧啶单克隆抗体的制备及其免疫学特性鉴定

用重氮化法将SDM(磺胺二甲氧嘧啶)偶联于载体蛋白BSA和OVA,合成免疫原BSA-SDM和包被原OVA-SDM,并用紫外扫描(UV)、SDS-PAGE进行鉴定;用BSA-SDM免疫BALB/C小鼠,间接ELISA和阻断ELISA选择细胞融合备用鼠;应用杂交瘤技术建立分泌SDM mAb细胞株,用体内诱生腹水法制备SDM mAb;对SDM mAb的效价、亲和性、敏感性和特异性等免疫学特性进行鉴定。结果表明,BSA-SDM人工抗原制备成功,分子结合比约为1∶12.1;筛选出1B43、D9、4E1共3株敏感特异的杂交瘤细胞,间接ELISA效价细胞培养上清分别为1∶3.2×102、1∶5.12×102、1∶8.1×102,腹水分别为1∶2.56×105、1∶2.56×1051、∶5.12×105,4E1亲和常数(Ka)为1.25×1010L/mol;4E1株对SDM的IC50为16.64ng/ml,与磺胺-6-甲氧嘧啶交叉反应率为5%,与其他磺胺类药物无交叉反应性。本试验获得了抗SDM高价、敏感、特异的mAb,可用于SDM残留检测的免疫学试验。     

抗苯巴比妥单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选及ciELISA试剂盒的研制

用BSA-pAPB免疫Balb/c小鼠，用细胞融合技术制备并用间接ELISA和阻断ELISA筛选抗苯巴比妥单克隆抗体(PB mAb)杂交瘤细胞株，体内诱生腹水法生产PB mAb，应用PB mAb研制PB残留竞争ELISA(ciELISA)快速检测试剂盒(PB-Kit)，并测定其性能。结果表明，筛选出3株杂交瘤细胞，最好的3F6-C4株的PB mAb间接ELISA效价为1∶6.4×105，亲和常数(Ka)为1.96×1010 L/moL，半数抑制浓度(IC50)为5.7 μg/L，与巴比妥的交叉反应率(CR%)12.4%，与其它化合物无CR；PB-Kit的线性检测范围1.0～81 μg/L，灵敏度0.75 μg/L，检测限1 μg/L；饲料样和猪尿样的平均添加回收率85.8%和91.3%，平均批内和批间变异系数均<15%。PB-Kit具有快速、敏感、特异、简便等特点，适合PB残留快速检测的推广应用。     

口蹄疫重组鸡痘病毒在豚鼠体内的毒性、分布、抗体消长规律的研究

以病毒为重组疫苗的载体构建的活载体基因重组疫苗免疫哺乳动物,抵抗传染病的研究已获得成功,其中鸡痘病毒存在着很大的潜在优势。然而,作为非复制的载体其安全性迫切需要检验。选择重组鸡痘病毒vUTAL 3CP1分别以正常剂量、超大剂量,肌肉注射、静脉注射接种豚鼠,第一次免疫后间隔14 d分别进行二免、三免;对妊娠豚鼠的不同阶段进行免疫,通过PCR、RT-PCR、EL ISA、中和抗体检测和免疫组化等检测方法,对疫苗在豚鼠体内的基因和蛋白分布、抗体消长规律以及毒性,和对妊娠豚鼠和子代体内的基因和蛋白分布、抗体消长规律以及毒性进行研究。实验结果表明:肌肉接种FMD重组疫苗株后,临床观察、病理组织学和检测表明在整个试验期间,试验组免疫动物精神状态良好、饮水、采食等临床表现一切正常;病毒培养表明只在接种的部位免疫3 h可以培养出病毒,其他组织和其他时间点均未能培养出病毒,证明重组鸡痘病毒vUTAL 3CP1在体内是一过性感染,免疫3 h的病毒是未完全吸附的病毒,而不是复制的病毒;通过PCR,RT-PCR检测,可在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、脑、肠系膜淋巴结内检测到了FPV 4b DNA和FMDV VP1 DNA,且在大部分组织能存留5 d左右;增加免疫剂量和进行多次免疫,其在体内存留时间仍然很短,重组疫苗可诱导豚鼠产生较高水平的抗FMDV特异性抗体和中和抗体;静脉注射也在体内检测到病毒的DNA,但其在体内的分布和存留时间短,诱导豚鼠产生的抗FMDV特异性抗体和中和抗体水平比肌肉注射低、且持续时间短,病毒培养表明只在任何组织和任何时间点均未能培养出病毒;对妊娠豚鼠的不同阶段均无毒性,未造成流产、早产、死胎等不良反应,子代未检测到病毒的DNA。以上均证明重组鸡痘病毒vUTAL 3CP1在豚鼠体内存留时间短,对妊娠豚鼠、子代无毒性,且能产生良好的免疫反应,且对环境无污染,为后期其他哺乳动物实验提供必要的基础数据,从而更进一步验证所构建的重组鸡痘活载体疫苗的生物安全性及免疫原性,对免疫动物无安全威胁。     

猪伪狂犬病gE-ELISA鉴别诊断方法的建立及初步应用

摘要: 为了区分伪狂犬病野毒感染猪与糖蛋白E(gE　)基因缺失疫苗免疫猪，利用大肠杆菌(Eschirchia coli　)BL21(DE3)表达伪狂犬病病毒gE糖蛋白，经纯化、变性、复性等处理后将gE蛋白作为抗原建立了伪狂犬病的gE-ELISA鉴别诊断方法。以该方法检测115份已知背景猪血清，结果表明，该方法诊断特异性为94.5%，诊断敏感性为96.7%。以5块不同批次的包被抗原的酶标板检测5份血清，结果显示阳性血清的变异系数均小于10%，表明该方法重复性好。对比国外阻断gE-ELISA同时检测临床356份猪血清，两者阳性符合率为87.44%（195/223），总符合率为92.13%（328/356）。以上结果表明该gE-ELISA特异、敏感且重复性好，可用于猪伪狂犬病的鉴别诊断。     

特布他林杂交瘤细胞株的建立及其单克隆抗体制备与鉴定

分别通过1,4丁二醚法和EDC法将特布他林偶联于载体蛋白BSA和OVA上,用BSA-TBL免疫BALB/c小鼠,经过3次免疫后,OVA-TBL包被后用间接ELISA和阻断ELISA选择细胞融合备用鼠,选择高效价、高敏感性和高特异性的小鼠进行抗原进行冲击免疫;无菌手术取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合建立分泌TBL单克隆抗体的杂交瘤细胞株;采用体内诱生腹水法制备TBL mAb,并对TBL mAb的效价、敏感性和特异性等免疫学特性进行鉴定。结果显示,免疫的6只小鼠血清抗体效价均达到10-4;融合后筛选出4C08-G5和3H3-A02共2株敏感特异的杂交瘤细胞,其细胞培养上清液效价分别为1∶800和1∶1600,腹水效价分别为1∶2.56×105和1∶1.02×106;4C08-G5株分泌的抗体对TBL的IC50为5.25ng/ml,与瘦肉精、莱克多巴胺等其他β2激动剂交叉反应性小于3%。本试验获得了抗TBL mAb,为TBL残留免疫检测方法的建立奠定了坚实的基础。