耐热链霉菌的分子育种改造

BIB0830是一株可将泰乐菌素转化为乙酰异戊酰泰乐菌素（AIV）的耐热链霉菌工业菌株。以pIJ8600为载体分别构建了acyB1-B2基因整合型表达载体pBIB425和带红霉素突变启动子ermEp*的红霉素抗性ermE基因整合型表达载体pBIB304。通过大肠杆菌-链霉菌属间接合转移分别将pBIB425、pBIB304和pBIB308（耐热链霉菌的nsdA基因中断载体，本实验室保存）导入工业菌株BIB0830，抗性筛选分别得到接合子BIB425、BIB304和BIB308。PCR验证均为阳性克隆。摇瓶发酵结果表明：与出发菌株BIB0830相比，BIB425和BIB308泰乐菌素转化率分别提高了14%和22%，BIB304无明显影响。     

提高耐热链霉菌转化泰乐菌素能力的分子改造与育种

BIB0830是将泰乐菌素转化为乙酰异戊酰泰乐菌素(AIV)的耐热链霉菌(Streptomyces thermotolerans)工业菌株。以pIJ8600为载体分别构建了acyB1-B2基因整合型表达载体pBIB425和带红霉素突变启动子ermEp*的红霉素抗性ermE基因整合型表达载体pBIB304。通过大肠杆菌(Escherichia coli)-链霉菌属间接合转移分别将pBIB425、pBIB304和pBIB308(耐热链霉菌的nsdA基因中断载体)导入工业菌株BIB0830,抗性筛选分别得到接合子BIB425、BIB304和BIB308。经PCR验证均为阳性克隆。摇瓶发酵结果表明,与出发菌株BIB0830相比,BIB425和BIB308泰乐菌素转化率分别提高了14%和22%,而BIB304则无明显影响。     

orfX基因整合表达在阿维链霉菌工业育种中的应用

阿维链霉菌（Streptomyces avermitilis）基因组中含有orfX基因，通过增加orfX基因剂量可以提高阿维菌素的产量。本研究以pIJ8600为出发质粒，构建了含红霉素启动子（ermEp*）和orfX结构基因DNA片段的整合型表达载体pWJ827。通过接合转移将pWJ827导入阿维菌素的工业菌株BIB9903中，得到稳定高产的重组菌株BIB0827。高效液相（HPLC）分析结果表明，与出发菌株BIB9903相比，BIB0827发酵产物阿维菌素产量提高了1.5倍，达到3350μg/mL。传代稳定性实验证明，BIB0827传代10代后依然稳定，在工业生产上有较大的应用价值。     

利用PCR介导的基因置换技术构建阿维链霉菌bkdF-突变株

PCR介导的基因置换技术是一种利用λ噬菌体Red重组系统在微生物中进行基因中断的新方法。实验利用该方法快速构建基因中断载体，并成功地置换了阿维链霉菌（Streptomyces avermitilis）bkdF基因。先合成1对长度分别为58和59nt的引物，其5’端的39nt序列分别与bkdF基因两侧同源，3’端则分别与安普霉素抗性标记盒（aac（3）Ⅳ＋onT）两侧序列一致。以该引物扩增的PCR产物电转化能表达λRed重组酶且含有目标质粒的大肠杆菌（Eschcrichia．coli）菌株BW25113／pU790／pXW1224，获得了阳性重组质粒pXW1230。将该质粒中的大小为4．0kbBglⅡ目的片段插入基因置换载体pHZl35l，再接合转移至阿维链霉菌BJBM9903，筛选得到表型为Apma^RThio^S的接合子。PCR验证并对发酵产物进行HPLC和MS分析，证实该接合子为敞dkdF^-突变株。     

bkdFGH和aveD基因缺失多拉菌素工程菌株的构建

多拉菌素(doramectin)是一种新型大环内酯类抗寄生虫药物,为阿维菌素的衍生物,可由基因重组阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)发酵产生,在畜牧业生产中应用广泛.为获得可用于生产的能够稳定制造多拉菌素的阿维链霉菌工业菌株,本研究以阿维菌素高产菌株SAV939为基础,通过对阿维菌素生物合成基因簇进行遗传改造,构建获得阿维链霉菌突变株S.avermitilis LZ-01和LZ-02.LZ-01是通过同源双交换法构建的支链α-酮酸脱氢酶基因簇(branched-chain alpha-keto acid dehydrogenase gene cluster,bkdFGH)缺失突变株,自身无法合成多拉菌素,当在发酵过程中添加环己甲酸时即可产生多拉菌素(CHC-B1).LZ-01缺失avermectin D(aveD)基因即获得突变株LZ-02,对其发酵仍可获得多拉菌素,但不再产生无效的CHC-A组分,为分离纯化提供了便利.突变菌株LZ-01和LZ-02的构建为进一步优化发酵条件,提高多拉菌素产率奠定了基础.     

瑞氏木霉碳源阻遏相关基因Cre1的分子改造

为了提高瑞氏木霉（Trichoderma reesei）纤维素酶的活力,用类似基因改组的方法改造其碳源阻遏相关基因cre1。以瑞氏木霉基因组DNA为模板PCR扩增cre1基因,用DNaseⅠ消化cre1基因后,回收50-100 bp的DNA片段,用T4 DNA连接酶连接,以连接产物作为模板进行无引物PCR,并将PCR产物转入瑞氏木霉原生质体,通过测定滤纸酶活的方法筛选突变菌株,并在NCBI上比对分析突变菌株的cre1基因。结果表明,筛选获得1株纤维素滤纸酶活比出发菌株提高0.7倍的突变菌株cre2-3。cre2-3菌株在液体培养基中呈棉花状,而出发菌株呈小颗粒状,菌株cre2-3发酵液的颜色比出发菌株的更黄亮。推测cre1基因与瑞氏木霉菌株的生长代谢有关。     

链霉菌Snea253菌株的变异分析及对根结线虫活性影响

为明确委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)自发突变对南方根结线虫活性的影响。本研究利用继代培养法选育Snea253突变株,对形态分化及相关基因进行分析,并测其代谢产物的生物活性。获得6株菌落形态差异大的自发突变菌株,其中不产色素的3株突变菌株Snea253-G、Snea253-B和Snea253-F杀线虫活性分别为61.0%、45.5%和35.0%;产色素的3株突变株Snea253-A、Snea253-H和Snea253-J杀线虫活性分别为48.7%、37.2%和37.9%。ssgA、bldC、bldD、whiB、whiE和whiI基因克隆测序结果显示各突变株基因序列没有差异,可能此6个基因没有直接参与控制Snea253菌株的自发突变。链霉菌自发突变不但使其形态发生变异,而且也影响了其代谢产物的生物活性,研究为从形态上筛选优良菌株提供了相关理论依据。     

高寒冷凉环境中解磷微生物的效果初探

为了筛选出能适应青藏高原冷凉气候环境下的解磷菌株,以低磷土(有效磷1.48 mg/kg、全磷1.3 g/kg)为试验土壤,以作物生长中的特征温度5、15、25 ℃来模拟青藏高原的冷凉环境,将胶冻样芽孢杆菌(Paenib-Bacillus mucilaginosusv)、巨大芽孢杆菌(Priestia megaterium)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、紫变异链霉菌(Streptomyces violovariabilis)、肉桂褐链霉菌(Streptomyces cinnamofuscus)、黄团孢链霉菌(Streptomyces flavoag-glomeratus)6株解磷菌接种到土壤中。通过测定不同温度下土壤的pH、有效磷含量、土壤中的碱性磷酸酶活性、无机磷组分,筛选出解磷能力较强的解磷菌。试验结果表明,接种了紫变异链霉菌的处理在任何温度下土壤有效磷含量、碱性磷酸酶活性都高于接种其他菌株的处理,pH与土壤有效磷含量呈显著负相关关系。15℃下无机磷组分中Ca2-P和Ca8-P含量要高于其他处理。因此,紫变异链霉菌(Streptomyces violovariabilis)为适合青藏高原冷凉气候环境的解磷菌株。     

阴沟肠杆菌B29菌株脂多糖合成基因（waaL,waaG）缺失突变株的构建及分析

脂多糖（LPS）在革兰氏阴性细菌中的功能作用在不同菌株中已有研究,但尚未有对肠杆菌属LPS结构与功能的报道。本研究试图构建能引起肥胖的阴沟肠杆菌B29菌株waaL和waaG基因的缺失突变株,以了解突变体菌株产生的LPS结构与活性与野生菌株产生的LPS的差异。根据同源重组技术原理,利用广宿主自杀性质粒构建成敲除载体pKNG101△waaL和pKNG101△waaG,转化E.coli SM10菌株,并与B29菌株进行双亲杂交,再以抗生素和蔗糖筛选条件筛选waaL和waaG基因缺失突变株;利用多重PCR、ERICPCR、PCR-DGGE、DNA测序结果均证实突变株B29△waaL和B29△waaG构建成功;最后,对野生菌株B29与两个突变株生物学特性的差异进行了比较。银染实验结果表明野生型B29菌株的脂多糖为光滑型结构,突变株的LPS结构明显缺失O抗原,B29△waaG突变株同时还缺失了外部核心部分;用鲎试剂法检测LPS的内毒素活性显示,突变株的内毒素活性与野生型相比有较大幅度下降;B29△waaL突变株的生长速率与野生型相当,而B29△waaG突变株的生长速率则相对降低。本研究成功构建两种内毒素活性下降的突变株,为下一步利用突变株研究B29菌株在肥胖发生中的机制奠定基础。     

农杆菌介导的木薯转基因研究初报

将米曲霉植酸酶基因phyA克隆于植物表达载体pB1121的CaMV35S启动子（P35s）下游，构建了含有P35s—phyA-TNOS表达盒的重组质粒pBI-phyA，并用电脉冲法将其导人大肠杆菌中。通过三亲接合将pBI—phyA质粒由大肠杆菌导入根癌农杆菌LBA4404菌株，获得带有phvA基因的根癌农杆菌工程菌株LBA4404／pBI-phyA。用LBA4404／pBI—phyA转化木薯外植体652个，在含100mg／L卡那霉素和250mg／L氨苄青霉素的MS分化培养基上诱导分化芽，获得24株抗卡那霉素转化苗。以转化苗和未转化植株的总DNA为模板，用phyA基因的同源序列为引物，进行聚合酶链式反应（PCR），结果表明9株转化苗的PCR结果为阳性，初步证明目的基因phvA已经转入木薯中。     

水稻橙红色突变体的遗传分析与基因定位

从水稻材料H9808航天诱变的后代中筛选出1株与色素相关的突变体,该突变植株在幼穗分化期新出幼叶的叶脉为橙红色,到拔节后期植株节间及下部约1/3的茎秆均呈现橙红色,在茎杆节底部中心有一橙红色的原点,抽穗时颖壳为橙红色,并保持到种子成熟,遗传分析表明突变体受1对隐性基因控制。在突变体与9311杂交的F2代隐性群体中,利用SSR标记将橙红色基因定位在2号染色体RM5350和RM12601标记之间,遗传距离分别为0.55cM和1.38cM。再利用新设计的InDel标记,进一步将该基因定位在S1和S2之间,遗传距离分别为0.41和0.25,为克隆水稻橙红色基因奠定了基础。     

过量表达OsNPR1基因稳定提高水稻对白叶枯病的抗性

在拟南芥中，NPR1是系统获得抗性SA信号传导途径中的一个重要的调节因子，在水稻中已克隆到与之同源的OsNPR1基因。构建OsNPR1基因水稻过量表达载体，并将其转化粳稻TP309得到转基因植株；通过自交纯合，得到17个纯合株系；对T3、T4代纯合株系进行PCR鉴定，证实转基因纯合株系中外源伪OsNPR1基因具有遗传稳定性；检测了T1、T2代转基因株系和T3代转基因纯合株系对水稻白叶枯病病原细菌Xanthomonas oryzae pv．oryzae的抗病性，结果表明，在T1、T2代中70％以上的株系对水稻白叶枯病的抗性显著提高，T3代中约67％的株系对水稻白叶枯病的抗性显著提高，说明这种抗病性的提高具有遗传稳定性。OsNPR1基因可作为选育水稻抗白叶枯病新种质的一个良好的候选基因。     

低能重离子诱导的狐米草(Spartina patens)突变系生物量与光合能力比较

为从狐米草低能重离子突变系中筛选出生物量大、光合能力强、并可在滩涂生长良好的牧草用突变系,在室外模拟沿海滩涂环境中种植狐米草,检测各突变系的叶长、叶宽、茎高、茎直径、地上部分生物量以及各突变系单位面积的光合能力等指标。结果显示:各突变系的叶片均比对照大,茎也比对照高且粗,但地上生物量只有N1、N3和N5突变系高于对照;多数突变系在光能的吸收、传递与光化学转换方面的能力要高于对照,但只有N1、N2、N3、N5和N9等5个突变系的单位面积光合速率高于对照。综合生物量与光合能力的检测结果,N1、N3和N5突变系在生物量与光合能力方面相对有较高的优势。这为适合我国沿海滩涂生长的优良狐米草牧草突变系筛选提供了依据。     

籼型温敏核不育水稻叶绿素突变体的诱变及其初步研究

用＾６０Ｃｏγ射线辐照籼型温敏核不育系２１７７Ｓ,获得了一批常见的叶绿素突变体。Ｍ２代按苗计,叶绿素总突变频率为０．２６２％,其中只有４．５０％可以存活并遗传,从中筛选出３３个综合性优良的灿型温敏核不育叶绿素突变系。经鉴定,这些叶绿素突变受基因控制,比较稳定,有的只在苗期表达并逐渐转为正常,有的则在全生育期表达。     

蜡样芽孢杆菌ATCC14579毒力基因plcR缺失株的构建及其一般特性

蜡样芽孢杆菌是土壤中的优势菌,具有作为益生菌的潜在能力,同时它也是条件致病菌,能引起食物中毒等。蜡样芽孢杆菌的多种毒力因子受到多效性调控子（pleiotropic regulator,plcR）的调控,在其条件致病性作用中起着重要作用。真养产碱杆菌JMP34（Alcaligenes eutrophus）质粒上的2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-dichlorophenoxyacetic acid,2,4-D）单加氧酶（tfdA）基因可以降解2,4-D。本研究利用同源重组技术使tfdA基因置换掉蜡样芽孢杆菌的plcR基因,构建了蜡样芽孢杆菌ATCC14579突变株B.cereus△plcRΩtf-dA,并对其毒性、一般生理生化特性进行分析。研究结果表明,突变株B.cereus△plcRΩtfdA的毒性显著减弱;生理生化实验结果显示突变株与野生株并没有明显区别,且突变株并没有表现出tfdA酶活性。所有的结果表明plcR控制着蜡样芽孢杆菌ATCC14579的致病性,同时剔除plcR并不破坏其酶系统。本研究为今后构建蜡样芽孢杆菌工程菌提供了新的思路和依据。     

晚粳稻品种浙粳22内稃突变体基因的遗传分析和基因定位

晚粳稻品种浙粳22内稃突变体是60Co γ射线对浙粳22辐照后选到的内稃约有正常内稃一半大小的突变体。遗传分析表明，该突变性状由1对隐性基因控制。该内稃突变体与籼稻珍汕97杂交的F₂群体，采用SSR分子标记对突变性状基因进行初步遗传定位，把内稃突变基因定位在第9号染色体上，暂将该突变基因命名为hig1，位于RM6051和RM556之间，遗传距离为12.7cM。