转基因玉米植株幼叶DNA快速提取及降落PCR检测研究

用农杆菌介导玉米自交系‘掖478’茎尖遗传转化的转基因玉米植株幼叶为材料,进行快速提取玉米叶片DNA方法的研究.在室温下取2cm2大小的玉米叶片,将叶片剪碎置于2.0mL离心管中,液氮处理后使用组织研磨器研磨,然后加入800μL CTAB提取液,24∶1的氯仿∶异戊醇溶液800μL,轻摇10min后于10 000r/min离心5min,取上清,最后用0.7倍体积冰异丙醇沉淀DNA.应用降落PCR进行目的基因片段的扩增,并对结果进行测序验证.结果表明,该方法操作简单,省时省力,节约成本,效率高,降落PCR扩增目的基因条带清晰,测序结果与原序列一致.     

快速小量提取小麦叶片DNA的一种简易方法

[目的]寻求少量、快速提取小麦幼叶DNA的方法。[方法]以小麦幼叶（只要是健康的绿叶,老叶也可）为试验材料,用改良的CTAB法小量快速提取转基因小麦总DNA。具体步骤为：①直接用已灭菌的1．5ml离心管夹取小麦叶片（无需称量）,然后在液氮中快速冷冻后用玻璃棒研磨成细粉（研磨直接在离心管中进行,不必先在研钵中研磨然后再转移到离心管里,能够有效减少材料损失）,加入600山预热（65℃）的2％CTAB提取缓冲液,快速振荡摇匀。置于65℃的水浴锅中温育30min,期间温和混匀几次。②取出离心管,冷却至室温,加入600m氯仿：异戊醇（24：1）充分混匀,于4℃下12000r／min离心8min（只抽提1次）。③取上清,加入等体积预冷的异丙醇,缓慢混匀,至有絮状DNA析出,-20℃放置30min以上。④4℃下12000r／min离心8min。弃上清液,将沉淀用700μl70％乙醇清洗2次,离心,弃乙醇,室温下挥发乙醇,加入适量ddH：O或0．1×TE溶解沉淀（DNA）,-20℃保存。所提取的DNA以0．8％琼脂糖凝胶电泳检测。[结果]改良的CTAB法提取小麦基因组DNA所提取的DNA纯度高、无降解现象,适用于进行常规PCR扩增,并且需要材料量少、成本低,还可缩短操作周期、节省时间。[结论]该研究为小麦DNA的提取提供了一种所需材料量少、简便、快速的方法。     

一种适宜拟南芥PCR检测的DNA提取方法（摘要）（英文）

[目的]介绍一种适于拟南芥PCR检测的DNA快速提取方法。[方法]通过对常规DNA提取方法的改进（省去液氮研磨和苯酚提取的步骤）,获得可以快速大批量地提取拟南芥DNA样品的方法。于1.5ml Eppendorf管内加入400μl DNA提取液[内含200 mmol/LTri（pH值7.5）,25 mmol/LEDTA（pH值8.0）,250 mmol/LNaCl,0.5% SDS（W/V）],剪取拟南芥叶片材料少许（1片以下）加入400μl DNA提取液,用微型研磨棒将叶片捣碎至溶液成绿色,放置3 ～5 min;加入400μl氯仿/异戊醇（体积比24：1）,混合均匀,12 000 r/min离心5 min;取上清液至另一1.5 ml Eppendorf管内,加入300μl异丙醇,颠倒混合均匀,室温下放置5 min,12 000 r/min离心5 min;弃去上清液,以70%乙醇漂洗,放置晾干,加入100μl灭菌超纯水溶解,4℃放置备用。以随机抽取的拟南芥转基因株系和突变株系为样品进行验证。[结果]经过琼脂糖凝胶电泳及紫外吸收检测,DNA样品完整且污染少,PCR扩增目的片段结果良好,适于作为PCR反应的模板。经过对随机抽取的拟南芥转基因株系和突变株系的PCR检测,阳性植株目的基因扩增条带清晰,无假阳性,试验结果理想。[结论]该方法适用于拟南芥DNA样品的快速提取、PCR检测及拟南芥突变体筛选工作。     

不同保存方法和研磨方式对玉米总DNA提取效果的影响

以玉米自交系昌7-2为材料,采用改良CTAB法提取基因组DNA,分析不同保存和研磨方法等对样品提取效果的影响。通过A260/A280、琼脂糖凝胶电泳、PCR扩增,对提取的基因组DNA进行分析鉴定。结果表明,CTAB缓冲液保存叶片并在CTAB缓冲液中研磨叶片,得到的DNA效果最佳,同时这种方法也比较经济安全。     

鼠尾草属植物基因组DNA提取及RAPD反应条件优化

以鼠尾草属植物叶片为材料,提取基因组DNA,并对RAPD反应条件进行了系统优化.结果表明,采用核DNA法提取的DNA质量较高,适宜于RAPD分析;RAPD扩增最佳反应体系为20μl反应体系中,10×buffer 2.0μl,模板DNA 20 ng,Mg 浓度2.0 mmol/L,引物浓度0.6μmol/L,dNTPs浓度0.2mmol/L,Taq酶1.0U.扩增反应程序为94℃预变性5min,94℃变性1min,36℃退火1main,72℃延伸2main;40个循环;72℃后延伸10main,4℃保存.     

玉米叶片硝酸还原酶活性测定方法的优化

以玉米(Zea mays L.)自交系许178为材料,通过考察研磨方法、NADH用量、温度、pH、反应时间、显色时间对玉米叶片硝酸还原酶活性的影响获得最优试验条件。结果表明,石英砂研磨比液氮研磨测得的酶活性高;反应温度35℃、pH 7.5为较适反应条件;反应时间和显色时间均为10 min时测得的硝酸还原酶活性与标准方法相比无显著差异;还原剂NADH用量减少至一半测得的硝酸还原酶活性与标准方法无显著差异。综上所述,玉米叶片硝酸还原酶活性测定的优化处理方案为用石英砂研磨,加入0.15 m L NADH,在35℃、pH 7.5的条件下反应10 min,显色10 min。     

蕨类植物的DNA提取方法比较研究（摘要）

[目的]研究蕨类植物DNA提取的方法,为进一步的遗传多样性以及分类学的研究提供基础。[方法]通过改变试剂的用量以及操作方法对CTAB法提取DNA方法进行了改进。①取0.5～1.0 g新鲜叶片,加液氮充分研磨成粉末,置于1.5 ml离心管中,加2%CTAB600μl及10μl巯基乙醇;②65℃水浴15 min（期间取出振荡1次）,冷却;③加500μl氯仿/异戊醇（24：1）上下颠倒数次至液相深绿色;④12 000 r/min离心3 min;⑤取上清液至-1.5 ml离心管,重复步骤③、④;⑥取上清液至-1.5 ml离心管中,管内预装1 ml 95%乙醇。室温静置2 h;⑦12 000 r/min离心3 min;⑧弃上清,用70%乙醇（约4400μl）洗涤沉淀,真空干燥器干燥。干燥后加低温保存;⑨使用时加100μl超纯水溶解。-25℃保存。提取出的DNA样品中加超纯水50μl,混匀后,用石英比色杯于DU（R）800分光光度计中测定紫外消光值,根据其在260nm和280 nm波长处的光吸收值计算DNA产率,根据A_（260）/A_（280）判断DNA样品的纯度。DNA样品的浓度（μg/μl）为：在260 nm的紫外消光值×核酸稀释倍数×50/1 000。纯DNA样品A_（260）/A_（280）紫外消光值应为1.8,A_（260）/A_（230）值应大于2.0。A_（260）/A_（280）值大于1.9时,表明有RNA污染,小于1.6时,表明样品中存在蛋白质或酚污染。A_（260）/A_（230）值小于2.0时表明溶液中有残存盐和小分子杂质,如核甘酸、氨基酸、酚等。分别对常规CTAB法和改进CTAB法提取出的蕨类植物DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测,以验证提取出DNA的质量。[结果]改进的CTAB法提取的蕨类DNA,其主带（基因组DNA）更加明亮,且与其他杂带区分明显,表明DNA的降解较少,DNA得率及纯度都有了很大提升。[结论]改良的CTAB提取法能够提取出高质量的蕨类植物DNA。     

新疆野苹果基因组提取优化及模板浓度对ISSR-PCR影响

以新疆野苹果干燥叶片为材料,比较分析了CTAB法和4种改良CTAB法提取基因组DNA效果,及ISSR-PCR扩增所需最佳模板浓度。结果表明:5种方法提取的DNA在纯度和量上有很大差别,研磨时加入PVP,可有效去除多酚物质;第一次提取上清液中加入1/10体积CTAB裂解液(0.7 mol/L Na Cl、10%CTAB),可以有效去除多糖;异丙醇沉淀时加入1/9体积的乙酸钠,可加速得到白色沉淀。新疆野苹果ISSR扩增体系研究中,发现DNA模板浓度处于400~1 000 ng/μL时,ISSR-PCR扩增结果最佳。DNA提取优化及模板浓度优化为后续的分子生物学研究提供理论依据。     

桔梗RAPD-PCR体系的正交优化及引物筛选

【目的】建立桔梗RAPD-PCR反应的最佳体系并应用于桔梗遗传图谱的构建。【方法】以2个桔梗亲本GS16和GS106的叶片DNA为模板,对桔梗DNA的提取及对影响桔梗RAPD-PCR扩增的重要参数进行优化试验,并从530个随机引物中筛选出在2个亲本间具多态性的引物。【结果】叶片研磨后用蒸馏水预洗及2次沉淀时加入3 mol/L NaCl(pH 5.2)溶液,提取的基因组DNA纯度较高。优化的最佳反应体系总体积为25μL,内含ddH2O12.4μL、10×buffer 2.5μL、引物0.3μmol/L、dNTPs 200μmol/L、Mg2+2.5 mmol/L、TaqDNA聚合酶0.5 U、DNA模板40 ng;反应程序为:94℃预变性4 min;94℃30 s,35.3℃1 min,72℃2 min,40次循环;72℃10 min。按此优化RAPD条件成功地从530个随机引物中筛选出了115个在两亲本间具多态性的引物。【结论】改良的CTAB法能成功用于桔梗基因组DNA提取,建立的最佳反应体系可用于桔梗遗传图谱的构建。     

硅胶干燥罗布麻叶片DNA提取及RAPD反应体系建立

[目的]得到适用于罗布麻RAPD的最优体系.[方法]以伊犁地区新源县罗布麻硅胶干燥叶片为材料,采用TIANGEN试剂盒提取罗布麻基因组DNA,得到满足RAPD(Random amplified polymorphic DNA)分析的罗布麻基因组DNA.[结果]通过单因素优化实验,得到罗布麻RAPD分析的最佳反应体系为:Mg2+ (2.0mmol/L)、dNTPs(0.5 mmol./L)、primer(0.4 mmol/L)、DNA(1μL)、Tap酶取1μL、10×buffer取1μL,总反应体系为10 μL;扩增程序为:在94℃下预变性,然后进行42个循环(94℃变性30 s、38℃退火30 s、72℃延伸2min),最后在72℃延伸7 min.[结论]提取的罗布麻总DNA均有较高的质量,适合RAPD分析;Tiangen植物基因组DNA提取试剂盒对罗布麻基因组DNA有着良好的提取效果;对罗布麻RAPD-PCR中Mg2+、dNTPs、DNA聚合酶和引物浓度进行优化,较为理想的各因子用量和扩增程序为:Mg2+(2.0 mmol/L)、dNTPs(0.5mmol/L)、primer(0.4 mmol/L)、Tap酶(0.5 U/μL)、DNA(40 ng),总反应体系为10 μL;扩增程序为:在94℃下预变性5 min,然后进行42个循环(94℃变性30 s、38℃退火30 s、72℃延伸2 min),最后在72℃延伸7min.     

转基因玉米PCR检测体系的优化研究

以转基因玉米为研究材料,从模板DNA的提取质量、Mg2＋浓度、退火温度、引物用量等方面对PCR检测体系进行优化,建立了检测转基因玉米中外源基因的有效PCR反应体系。在优化体系中,25mm ol/LMg2＋用量由1.5μl降低为1.2μl,12.5mm ol/L引物用量由1μl降低为0.5μl,退火温度提高2℃。TouchDown PCR反应条件：95℃5m in;95℃1m in,62.5℃1m in（以后每个循环递减1℃）,72℃1m in,循环15次;95℃1m in,57.5℃1m in,72℃1m in,循环20次;72℃延伸7m in。     

超声波辅助提取枫香叶总黄酮工艺研究

利用超声波法提取枫香叶中的总黄酮,探讨乙醇浓度、提取时间和料液比等因素对总黄酮提取率的影响,通过正交试验确定枫香叶中总黄酮的最佳提取工艺。结果表明,提取枫香叶中总黄酮的最佳提取工艺为A3B2C1,即乙醇浓度80%,提取时间60 min,料液比1∶10。影响枫香叶中总黄酮提取的主要因素是乙醇浓度和提取时间,料液比影响较小。     

石鲽基因组DNA的提取及其RAPD体系的优化

[目的]研究石鲽基因组DNA的提取及其RAPD体系的建立和优化。[方法]以石鲽为试材,按常规酚/氯仿抽提法提取其基因组的DNA,对影响RAPD反应的各因素进行优化,建立了石鲽的最佳RAPD反应体系和程序。[结果]采用常规酚/氯仿抽提法获得的DNA完全能够满足RAPD分析的要求。通过优化建立一套适合石鲽的稳定的RAPD反应体系:反应体系总体积为25μl,包括10×buff-er2.5μl,MgCl22 mmol/L,dNTPs 0.15 mmol/L,引物0.2μmol/L,模板30 ng,Taq酶1 U。扩增程序为:94℃预变性5 min,45次PCR循环(94℃变性45 s,36℃退火45 s,72℃延伸2 min和72℃延伸10 min。利用该体系对OPK和OPV系列共40条引物进行扩增,发现其中部分引物能产生稳定、清晰的条带。[结论]该体系为石鲽遗传多样性以及相关分子标记的研究奠定了基础。     

玉米SSR分子标记技术操作规程的优化

[目的]建立玉米SSR标记技术操作规程,为其在生产中应用提供参考。[方法]以2个玉米杂交种(黔单16号、西山99)和4个玉米自交系(苏37、交51、黄C、4011)为试材,从玉米中提取基因组DNA,分别对不同DNA提取方法、SSR反应体系、PCR扩增程序和银染方法进行比较。[结果]采用SDS法、CTAB法提取DNA的扩增效果较好。玉米的最佳SSR反应体系为:1U Taq酶,1×Bufer,60ng模板DNA,2.0 mmol/LMg2+,0.15 mmol/LdNTPs,0.3μmol/L引物。最佳SSR扩增程序为:93℃,1 min;93℃,1 min;60℃,2 min;72℃,2 min,30个循环;72℃,5 min。用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶或6%变性聚丙烯酰胺凝胶来检测玉米SSR标记较好。[结论]采用优化的SSR标记检测体系,对贵州51份玉米杂交种进行遗传多样性分析,大多数引物扩出清晰条带。     

白木香愈伤组织与叶片DNA快速提取方法的确定

[目的]确定白木香愈伤组织与叶片DNA的快速提取方法.[方法]用TE、ES1、ES2 3种提取液及相应的方法提取叶片和愈伤组织总DNA,通过琼脂糖凝胶电泳检测提取产物,通过普通PCR及荧光定量PCR检查DNA的可用性,并将PCR产物经克隆测序验证.[结果] ES1法提取的叶片和愈伤DNA条带清晰,纯度较高;普通PCR和荧光定量PCR可扩增出200和600bp左右的目的条带.ES2法提取液电泳不能检测到DNA条带,但PCR可扩增出愈伤组织200bp左右目的条带.TE法得到的提取液检测不到DNA条带且PCR不能得到目的条带.[结论] ES1提取液及相应的提取方法可用于白木香愈伤和叶片DNA高通量快速提取,为沉香属植物种质研究和分子研究奠定基础.     

蝴蝶兰RAPD反应体系的建立

为建立一个稳定的蝴蝶兰RAPD反应体系,对RAPD反应体系中模板DNA、Taq DNA聚合酶用量、随机引物浓度、Mg2+浓度和dNTPs浓度等各项参数进行筛选比较。结果表明,最佳反应体系为:25μl反应体系中,其中含模板DNA(20 ng/μl)1.5μl,Taq DNA聚合酶(5 U/μl)0.4μl,随机引物(20μmol/L)1μl,Mg2+(25 mmol/L)2.5μl,dNTPs(10 mmol/L)0.5μl,10×PCR Buffer2.5μl,ddH2O 16μl。     

白木香基因组DNA的提取及ISSR反应条件的优化

[目的]以白木香为试验材料,研究基因组DNA提取方法,并优化ISSR-PCR反应体系。[方法]利用快速提取仪和微量液氮法提取DNA,并对ISSR-PCR反应体系进行单因素筛选。[结果]微量液氮法提取的DNA质量好于快速提取仪,但2种方法得到的DNA对后续ISSR研究没有明显的差异。同时,建立了最适的白木香ISSR-PCR体系,即25lμPCR反应体积中,1×PCR buffer,2.0 mmol/L MgCl2,4ng/μl模板DNA,200μmol/L dNTPs,1.1 UTaqDNA聚合酶,0.4μmol/L引物。最佳扩增程序为:94℃预变性5 min,然后进行45个循环,94℃变性45 s,复性温度根据各引物的TM值略低1~2℃,45 s,72℃延伸75 s,循环结束后72℃延伸7 min。[结论]优化系统的建立为进一步利用ISSR分子标记技术进行白木香遗传多样性研究提供了基础。     

黄花棘豆表面活性物质的初步研究

以黄花棘豆为原材料提取植物源表面活性剂OOR,并研究了其对农药的增效作用。初步研究表明,黄花棘豆粗取物的最佳提取溶剂为甲醇,粗提物产出率为5.94%。OOR在农药中的最佳添加量为3 mL/L,在此用量下,20%杀虫双水剂300倍液药后1～10 d对桃蚜的防效提高8.39～12.31百分点,对菜青虫的防效提高11.49～14.25百分点;75%百菌清可湿性粉剂600倍液对番茄早疫病的防效提高10.30百分点,对叶霉病的防效提高12.10百分点;在确保10%草甘膦水剂对藜的株防效和鲜重防效达90.00%以上的条件下,用药量可降至9 L/hm2,对水量可降至450 kg/hm2。     

玉米DNA纤维的制备及端粒DNA的Fiber-FISH

[目的]建立了一种快速制备DNA纤维的方法,用端粒DNA在玉米纤维上进行物理定位。[方法]采用刀切法从玉米嫩叶中提取细胞核。以端粒DNA为探针,在玉米DNA纤维上进行伸展DNA纤维的荧光原位杂交(Fiber-FISH),研究端粒DNA重复序列在玉米染色体上的拷贝数。[结果]用刀切法提取玉米细胞核,提高了核的完整性,并改善了DNA纤维的制备效果。玉米细胞核裂解的最佳时间为8~9 min。玉米的Fiber-FISH试验结果表明,杂交信号为伸展的念珠状长链,玉米各条染色体端粒DNA的长度为7~103μm,各染色体端粒重复序列的拷贝数存在显著差异(为15~230 kb)。[结论]玉米各染色体中端粒的长度可能不同,而且随着玉米生长及环境的变化,各条染色体端粒DNA长度的变化也不一致。