Identification of Zinc Deficiency-Responsive MicroRNAs in Brassica juncea Roots by Small RNA Sequencing

The importance of zinc （Zn） as a micronutrient essential for plant growth and development is becoming increasingly apparent. Much of the world’s soil is Zn-deficient, and soil-based Zn deficiency is often accompanied by Zn deficiency in human populations. MicroRNAs （miRNAs） play important roles in the regulation of plant gene expression at the level of translation. Many miRNAs involved in the modulation of heavy metal toxicity responses in plants have been identiifed;however, the role of miRNAs in the plant Zn deifciency response is almost completely unknown. Using high-throughput Solexa sequencing, we identiifed several miRNAs that respond to Zn deifciency in Brassica juncea roots. At least 21 conserved candidate miRNA families, and 101 individual members within those families, were identiifed in both the control and the Zn-deifcient B. juncea roots. Among this, 15 miRNAs from 9 miRNA families were differentially expressed in the control and Zn-deifcient plants. Of the 15 differentially expressed miRNAs, 13 were up-regulated in the Zn-deifcient B. juncea roots, and only two, miR399b and miR845a, were down-regulated. Bioinformatics analysis indicated that these miRNAs were involved in modulating phytohormone response, plant growth and development, and abiotic stress responses in B. juncea roots. These data help to lay the foundation for further understanding of miRNA function in the regulation of the plant Zn deifciency response and its impact on plant growth and development.     

Inhibition of miR397 by STTM technology to increase sweetpotato resistance to SPVD

As a critical food crop, sweetpotato (Ipomoea batatas (L.) Lam.) is widely planted all over the world, but it is deeply affected by Sweetpotato Virus Disease (SPVD). The present study utilized short tandem target mimic (STTM) technology to effectively up-regulate the expression of laccase (IbLACs) by successfully inhibiting the expression of miR397. The upstream genes in the lignin synthesis pathway were widely up-regulated by feedback regulation, including phenylalanine ammonialyase (PAL), 4-coumarate-CoAligase (4CL), hydroxycinnamoyl CoA:shikimatetransferase (HTC), caffeicacid O-methyltransferase (COMT), and cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD). Meanwhile, the activities of PAL and LAC increased significantly, finally leading to increased lignin content. Lignin deposition in the cell wall increased the physical defence ability of transgenic sweetpotato plants, reduced the accumulation of SPVD transmitted by Bemisia tabaci (Gennadius), and promoted healthy sweetpotato growth. The results provide new insights for disease resistance breeding and green production of sweetpotato.     

钼在茶树中的生理效应

 测定了不同浓度钼处理的水培茶苗体内核酸，可溶性蛋白、游离氨基酸、咖啡碱，儿茶素、钼、磷含量及茶苗的光合强度、根中硝酸还原酶活性，顶梢和根中IAA、GA#-S。（赤霉素1、3、4、7）和ABA（脱落酸）的含量。结果表明，钼有利于茶苗叶中DNA和蛋白质的合成，但RNA含量有所下降；1.00和2.00ppm钼促进茶苗茶氨酸、咖啡碱和儿茶素的合成；钼处理增加茶苗对钼的吸收，但减少对磷的吸收；同时钼促进茶苗的光合强度和根中硝酸还原酸活性，但浓度效应有所不同；钼也影响IAA、GA#-S和ABA的合成和运输。     

椰子保守microRNA 预测和特征分析

根据释放的椰子转录组序列和miRBase数据库中的microRNA（miRNA）序列信息,分析椰子中保守miRNA 及其相应靶基因的特征遥。根据miRBase数据库中植物miRNA序列,共预测了41个miRNA,分别属于22个miRNA家族。这些miRNA家族中13个家族在植物中非常保守,miRBase至少在19个物种中检测到,而miR902、miR2673和miR414这3个家族不保守,仅在1~2个物种中检测到。这些预测的miRNA的成熟序列长度大多为21个碱基（59.5%）,而前体序列的长度大多为50~100个碱基（61.9%）。分析miR396家族前体序列时发现,成熟miRNA和成熟miRNA*（成熟miRNA形成发卡结构互补的序列）序列很保守,但是中间的序列变异很大。此外,预测miRNA的靶基因发现保守的miRNA家族的靶基因为一些重要的转录因子家族,与植物的生长发育相关,而不太保守的miRNA家族的靶基因编码与表型控制相关的蛋白。     

植物miRNA的生物学特性及在环境胁迫中的作用

MicroRNA(miRNA)是一类在生物体内普遍存在的非编码、长度约为21 nt的小RNA分子,一般由内源基因编码,RNA聚合酶Ⅱ转录后,经过Dicer-Like酶等一系列的蛋白复合物将pre-miRNA(precursor miRNA)剪切成成熟miRNA,在转录及转录后水平介导靶mRNA转录沉默、降解或翻译抑制来调控基因的表达,是真核细胞基因表达的重要调控因子。第一个miRNA是在秀丽隐杆线虫(C.elegans)中发现的lin-4,与lin-14 mRNA 3′UTR的碱基序列部分互补,降解lin-14,从而抑制lin-14的表达。lin-4对靶基因lin-14的调控与线虫的生长发育密切相关。而第一个发现的植物miRNA是拟南芥mi R171,它靶向剪切编码基因Scarecrow-Like(SCL)家族的mRNA,调控其基因的表达,进而影响植物的生长发育。植物部分miRNA,如mi R156—mi R408在各植物物种中相对保守,而mi R408以后的miRNA具有物种特异性。植物在生长过程中会遭遇诸多不可预知(如同盐碱、干旱、重金属以及害虫和病原菌的侵扰等)的环境胁迫。固着生长的特性使得植物不能像动物那样通过移动来避免不利环境的影响,因此,需要自身特殊机制来应对这些环境胁迫。植物在长期逆境中已进化出极为精细复杂的生理和分子机制。miRNA与它作用的靶基因是响应环境胁迫的主要调控因子。miRNA参与了植物的生长发育、信号转导、蛋白质降解、营养胁迫、抗病原菌的入侵以及适应高盐和干旱等逆境胁迫过程,对于调节内源抗性基因表达具有一定意义。目前通过高通量测序、实时定量PCR检测和转基因等技术已经发现了很多与环境胁迫相关的miRNA,它们在逆境胁迫下的表达呈现显著差异性;miRNA的过表达植株经逆境胁迫处理可能表现出一定的抗逆或敏感性。同一家族的miRNA不同成员在响应环境胁迫时具有物种特异性。新疆地区是典型的大陆性干旱气候,降水量少,盐碱荒漠化地区多。在这样严酷的环境中顽强生存着许多盐生旱生类植物,这些植物的miRNA如何在逆境中发挥调控作用,依然需要更深入的探索。本文主要综述了现阶段植物miRNA生物合成、与靶基因作用方式、生物功能以及不同环境胁迫下对miRNA和作用的靶基因影响等方面的研究进展,以便更好地利用miRNA依据的生物技术开展研究和应用转化。     

小金海棠实生树阶段转变过程中miR156表达及氧化还原平衡态的相关性分析

为证明苹果实生树童性变化与氧化还原平衡态的相关性,采取小金海棠实生树不同节位的叶片,测定miR156相对表达量,H2O2含量以及CAT、APX和GR酶活性。结果小金海棠实生树个体生长发育过程中miR156相对表达量从1.4m高度显著降低。叶片H2O2含量,CAT、APX和GR酶活性均随节位逐渐升高。表明植物体内活性氧清除机制的CAT途径和抗坏血酸-谷胱甘肽循环均随个体发育逐渐增强。     

陆地棉胚珠及纤维发育过程中miRNA分离与鉴定

microRNA(miRNA)是生物中一类起负调控作用的非编码的小分子RNA,主要在转录后水平上调节生物体的生长与发育。直接克隆法是鉴定植物中miRNA最常用也是最有效的方法之一。利用直接克隆法分离了陆地棉开花后0~10 d(days post anthesis, DPA)胚珠中总RNA,从中筛选17~24 nt小分子RNA构建cDNA文库,对初筛得到的阳性克隆进行测序。通过与miRNA数据库比对,最终获得4个保守的miRNA。进一步对他们的转录表达进行分析,发现所有miRNA在棉花胚珠纤维不同发育时期均能表达。其中miR167a、miR172c和miR394b在棉花幼苗的根茎叶中有不同程度的表达。预测得到55个miRNA的靶基因,多数靶基因编码转录因子、代谢酶类以及发育相关蛋白,进一步证明miRNA参与调控棉花纤维的形态建成、发育等各项生理活动。     

干旱胁迫下15种丹参miRNAs差异表达分析

参考已报道的其他植物中响应干旱胁迫的miRNAs,以其中15个miRNAs为研究对象,10％ PEG6000胁迫处理的丹参幼苗为材料,采用实时定量PCR技术分析了这些miRNAs在于旱胁迫前后丹参幼苗叶片中的差异性表达.结果表明,在干旱胁迫6h后,丹参体内miR156、miR157、miR166、miR168、miR169、miR319、miR774、miR894、miR2911、miR3462以及miR3626的表达水平表现为不同程度的上调,其中miR157、miR166、miR319、miR774、miR894、miR2911和miR3626表现为显著性上调;miR159、miR167、miR172以及miR408则表现为下调.对这些miRNAs作用的靶基因进行预测和分析发现,它们主要参与植物的新陈代谢、信号传导和生长发育过程,推测miR169和miR3462参与了丹参对干旱胁迫应答过程.     

锌在茶树碳氮代谢中的效应

测定了不同浓度锌处理的水培茶苗（Camellia sinensis L）的核酸、蛋白质、氨基酸、叶绿素、锌和磷的含量,茶苗的光合速率、叶片的硝酸还原酶活性及儿茶素组成。结果表明,锌促进茶苗的光合速率、叶中硝酸还原酶活性及蛋白质和RNA的合成,提高非酯型儿茶素的含量,1-2mg/L处理有利于茶氨酸的形成。但锌处理降低DNA的含量,不利于茶苗对磷素的吸收,使酯型儿茶素有所减少。     

初情期山羊胸腺microRNAs的筛选

为分析初情期前和初情期雌性山羊胸腺中MicroRNA的差异表达情况,并探讨其在山羊初情期启动过程中所起的作用.对初情期前(n = 3)和初情期(n = 3)山羊的胸腺组织进行了 Solexa测序,采用GO富集和KEGG分析评估差异miRNA靶基因.在初情期前和初情期的山羊胸腺组织中检测到538个miRNA,其中64个miRNA显著差异表达.与初情期前的山羊胸腺样本相比,初情期胸腺样本中存在19个上调基因和45个下调基因.KEGG通路富集分析显示,差异miRNA靶基因主要富集在苯丙氨酸,酪氨酸和色氨酸的生物合成,丁螺菌素和新霉素的生物合成等通路以及胆碱能突触和过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)等与初情期启动相关信号途径.结果提示胸腺中miRNA参与山羊初情期启动.     

杨树miRNA的靶基因预测及低氮胁迫表达分析

目的鉴定杨树受低氮胁迫后miRNA的靶基因,分析靶基因在氮胁迫后的差异表达并探讨其功能,为揭示杨树低氮胁迫下miRNA的调控功能提供参考,并为树木低氮营养高效利用育种提供重要的候选基因。方法根据miRNA的保守性及与靶基因的严谨互补配对关系,以杨树miRNA为探针利用靶基因预测软件psRNATarget,通过与毛白杨转录组的基因序列进行比对鉴定靶基因,进一步开展毛白杨受低氮胁迫后靶基因的差异表达分析及功能注释。结果获得了131个miRNA家族的242个miRNA成员对应的3 024个靶基因,分别参与了植物激素信号转导、次生代谢产物的生物合成、氨基酸合成代谢、碳代谢和RNA运输等通路。57个靶基因在低氮胁迫处理后发生显著变化,其中受到诱导（29个）和抑制（28个）的基因数目相当。14个低氮胁迫响应的miRNA,其对应的11个靶基因也发生了显著的差异表达变化,其中miRNA和靶基因表达量发生相反变化的有8个miRNA。本研究发现参与植物激素信号转导的靶基因（2个）及参与代谢途径的靶基因（6个）发生了差异表达。miR162的靶基因编码ABC转运蛋白,miR393运用于靶基因KAT2调节Na+和K+动态平衡,miR399的靶基因PIF3编码光敏色素互作因子PIFs蛋白,这些miRNA及靶基因可能在杨树响应低氮胁迫中发挥重要作用。结论本文鉴定到了毛白杨中一批低氮胁迫响应miRNA的靶基因,可调控杨树对氮逆境胁迫信号的反应。这些miRNA及靶基因为进一步揭示miRNA及靶基因在低氮胁迫下的调控功能提供了研究线索,为树木氮营养的高效利用改良提供了重要候选基因。      

MicroRNA828负调控缺磷胁迫诱导的番茄花青素生物合成

【目的】深入解析番茄miR828的生物学功能,特别是参与番茄缺磷胁迫响应和花青素生物合成的调控作用。【方法】分别利用psRNATarget和RLM-5′ RACE预测和验证miR828在番茄中的靶基因。用MegAlign和MEGA5对番茄SlMYB7-like与部分R2R3 MYB转录因子氨基酸序列进行了多重比对和进化树分析。用qRT-PCR分析miR828及其靶基因SlMyb7-like在AC、MicroTom和LA1996 3个不同番茄种质中的表达和miR828在番茄（AC）中的组织特异性表达模式。以miR828过表达转基因番茄和野生番茄为材料,设置正常供磷（+Pi,MS+KH₂PO₄ 3.4 g·L^-1）和缺磷（-Pi,MS+KCl 1.86 g·L^-1）2个处理的培养试验。用qRT-PCR分析miR828及其靶基因在缺磷胁迫下的表达模式。将野生型和miR828过表达的转基因番茄植株缺磷培养15 d后,观察番茄植株地上部分和地下部分的表型差异,通过qRT-PCR分析miR828、miR828的靶基因SlMyb7-like（SGN-U320618）和花青素合成相关酶基因（PAL、CHS、DFR、ANS、3GT和F3′H）的表达模式,应用分光光度计测量各样品的花青素含量。【结果】RLM-5′ RACE剪切试验表明miR828对靶基因SlMyb7-like存在剪切调控作用,且剪切作用位点位于成熟miR828的第10位和第11位核苷酸之间,从而验证了SlMyb7-like是 miR828直接作用的靶基因。氨基酸序列多重比对及进化树分析显示番茄SlMYB7-like与拟南芥AtMYB7和金鱼草MYB330的序列相似性最高。SlMYB7-like含有与花青素合成相关的保守氨基酸基序。miR828在MicroTom幼苗中的表达最高,在LA1996中的表达最低。相反,miR828靶基因SlMyb7-like在LA1996中的表达水平最高,在MicroTom中的表达水平最低。qRT-PCR分析显示SlMyb7-like的表达模式与miR828相反,证明SlMyb7-like被miR828调控。正常供磷条件下,野生型番茄各组织中miR828的表达量普遍较低,但在花芽、花和绿果中相对较高;miR828过表达转基因番茄植株中各花青素合成相关基因的表达量降低为野生型植株的30%-60%,花青素含量降低为野生型植株的40%。在缺磷胁迫下,野生型和miR828过表达转基因番茄植株中miR828及其靶基因SlMyb7-like的表达均受到诱导上调表达;转基因番茄植株地上部分和根系生长受到的抑制程度均小于野生型番茄;转基因番茄植株的颜色较野生型番茄植株颜色浅;转基因番茄植株中SlMyb7-like、花青素合成相关基因的表达以及花青素含量均低于野生型植株;miR828过表达转基因番茄植株缺磷胁迫耐受性却高于野生型番茄。【结论】在番茄中,miR828直接作用的靶基因是SlMyb7-like。野生型番茄所测组织中miR828的表达量普遍较低,但在花芽、花和绿果中相对较高。miR828及其靶基因SlMyb7-like的表达受缺磷胁迫诱导。在正常供磷和缺磷条件下,miR828过表达转基因番茄植株中各花青素合成相关基因的表达量和花青素含量均低于野生型,表明miR828通过靶向SlMyb7-like负调控花青素合成相关基因的表达,进而负调控番茄植株中花青素的生物合成。miR828能够提高番茄对缺磷胁迫的耐受性。     

2020-06ml 目录

目的异形叶性是植物为适应环境在同一植株上产生多种形态成熟叶片的现象。胡杨是典型的木本异形叶植物，前人研究发现，胡杨异形叶片间展现出不同的生理特性及环境适应性。本研究拟通过对胡杨异形叶差异表达miRNA及其靶基因功能的分析，揭示胡杨叶片形态及其生理变化的分子调控机制。方法以成年胡杨披针形叶和锯齿卵圆形叶为实验材料，通过高通量测序对其miRNA的表达模式及差异表达miRNA的靶基因功能进行比较研究。结果共获得6个高质量的sRNA文库，各文库有效序列占原始序列的56% ~ 81%。通过比对，共鉴定517个已知miRNA和127个新预测miRNA，主要长度分布区间为20 ~ 22 nt，其中的389个miRNA匹配至54个已知的miRNA家族。两种形态叶片共同检出的miRNA有369个，与披针形叶片相比，锯齿卵圆形叶中7个miRNA上调表达，15个下调表达。通过靶基因预测及功能分析，发现差异表达miRNA参与调控胡杨异形叶的抗逆相关途径，如对盐胁迫的响应，磷酸肌醇代谢，角质、软木脂和蜡的生物合成，碱基切除修复和RNA降解等代谢途径。利用实时荧光定量PCR验证了5个差异表达miRNA的表达趋势与高通量测序结果一致，通过PCR检测发现差异表达miRNA与其靶基因存在一定的负调控关系。结论胡杨异形叶中miRNA表达模式存在差异。其中，调控植物生长发育的保守的miR167、miR166及调控植物抗逆性的miR172在锯齿卵圆形叶中表达量上调，参与植物逆境响应的保守的miR169、miR396在锯齿卵圆形叶中下调表达，推测差异表达miRNA引起了异形叶间形态的差异，同时使锯齿卵圆形叶对不利环境具有较强的耐受性。这与我们前期有关胡杨异形叶形态与生理特性的研究结果相一致。      

茶树芽叶儿茶素含量与转录因子 MYB、bHLH关联分析

以茶树芽叶为试验材料,用高效液相色谱检测儿茶素含量,用高通量测序技术分析转录因子MYB、 bHLH 表达差异,应用数据统计分析儿茶素含量与转录因子MYB、bHLH 表达的关联性。结果表明院3 个转录因子 MYB 基因comp150334_c1、comp143073_c0、comp130756_c0 与儿茶素总量、酯型儿茶素含量的关联系数均在0.80 以 上;3 个转录因子MYB 基因comp166178_c0、comp159173_c0、comp109329_c0,3 个转录因子bHLH 基因 comp159534_c2、comp159225_c0、comp142932_c0 与儿茶素总量、酯型儿茶素含量的关联系数均在0.75 以上,这将为 研究茶树儿茶素生物合成过程的关键转录因子基因提供理论依据。