Peat1蛋白及其3个缺失突变体的表达与热稳定性分析（英文）

[Objective] The research aimed to reveal the functions of NAC and UBA domains in Peat1's thermal stability.[Method] Fusion expression vectors of Peat1 protein and the 3 deletion mutants were constructed.The recombinant plasmids were induced by IPTG and the target proteins(Peat1,Peat1-△CD99,Peat1-△ND49 and Peat1-△ND108)were expressed obtained by AKTA and its thermal stability was analyzed.[Result] The research found that 3 deletion mutants have good thermal stability like Peat1.[Conclusion] The research demonstrated that the coexistence of NAC or UBA domains is not necessary to thermal stability of Peat1 protein,and they may give the protein particular stability structure seperately.     

Peat1蛋白及其3个缺失突变体的表达与热稳定性分析

从极细链格孢菌中提取出一种植物激活蛋白,后命名为Peat1,其分子量为35kD。该蛋白具有良好的热稳定性。生物信息学分析显示,Peat1含有2个保守结构域,即NAC(Nascentpolypeptide-associated complex)和UBA(Ubiquitin-associated)结构域。该文将Peat1在E.coli中进行克隆和表达,并     

Peatl蛋白及其3个缺失突变体的表达与热稳定性分析

从极细链格孢菌中提取出一种植物激活蛋白,后命名为Peatl,其分子量为35 kD。该蛋白具有良好的热稳定性。生物信息学分析显示,Peatl含有2个保守结构域,即NAC（Nascent polypeptide-associated complex）和UBA（Ubiquitin-associated）结构域。该文将Peatl在E.coli中进行克隆和表达,并构建3个缺失突变体,拟对赋予Peatl热稳定性的区域进行初步定位。     

Peatl蛋白及其3个缺失突变体的表达与热稳定性分析

从极细链格孢菌中提取出一种植物激活蛋白,后命名为Peatl,其分子量为35 kD。该蛋白具有良好的热稳定性。生物信息学分析显示,Peatl含有2个保守结构域,即NAC（Nascent polypeptide-associated complex）和UBA（Ubiquitin-associated）结构域。该文将Peatl在E.coli中进行克隆和表达,并构建3个缺失突变体,拟对赋予Peatl热稳定性的区域进行初步定位。     

番茄SlNAM1参与调节植物花青素累积

[目的]探究番茄SlNAM1参与调节花青素累积的分子机理,深入理解植物花青素积累的调控机制。[方法]通过酵母双杂交实验,检测番茄SlNAM1和SlMYB75、拟南芥NAC32与MYB75/PAP1蛋白相互作用;构建系统发育树,进行SlNAM1序列分析;通过烟草叶片瞬时表达分析,初步探明SlNAM1在调节植物花青素积累中的作用;在拟南芥pap1-D突变体中过表达SlNAM1,研究SlNAM1在调节植物花青素积累中的作用;通过对拟南芥pap1-D NAC32OX(OX32)双突变体表型分析,进一步证明SlNAM1的拟南芥同源基因NAC32参与调控花青素积累。[结果]酵母双杂交结果显示,SlNAM1与SlMYB75蛋白存在相互作用,其在拟南芥中的同源基因NAC32与MYB75/PAP1也存在相互作用;瞬时表达分析表明,SlNAM1通过与SlMYB75的相互作用,抑制了花青素积累;在拟南芥pap1-D突变体中过表达SlNAM1可抑制花青素累积;拟南芥pap1-D OX32双突变体表型分析结果表明,NAC32过表达抑制了花青素积累。[结论]综上所述,SlNAM1是花青素合成的负调节因子。     

玉米ZmCCT基因缺失区段原核表达载体的构建与蛋白表达

[目的]旨在纯化玉米ZmCCT基因缺失区段的原核表达蛋白.[方法]依据ZmCCT氨基酸序列中的CCT保守功能区,利用PCR技术获得ZmCCT基因的缺失突变体DNA片段,分别构建4个原核蛋白表达缺失区段.[结果]成功获得3个缺失区段的原核蛋白:ZmCCT1-300,ZmCCT300-540和ZmCCT1-540.[结论]该研究不仅有助于ZmCCT多克隆抗体的纯化,还将为探索ZmCCT的抗病分子机理奠定基础.     

生物胁迫相关NAC1转录因子的生物信息学分析

植物NAC1转录因子在调控植物的抗生物胁迫反应中起着重要的作用。为探究生物逆境相关NAC1转录因子的功能,通过生物信息学的方法对8个生物逆境胁迫相关NAC1蛋白氨基酸序列一致性、氨基酸组成、理化性质、亲/疏水性、保守结构域、磷酸化位点、亚细胞定位、二级结构及三级结构等进行了预测和分析。结果表明,8个生物逆境胁迫相关NAC1蛋白N-端保守性较强,包括5个保守的亚结构域,共同组成NAC1结构域。C-端含有多个保守的氨基酸,具有转录激活功能。同时蛋白中含有多个丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和酪氨酸(Y)磷酸化位点。8个NAC1蛋白都为亲水性蛋白,大多定位于细胞核,个别定位于细胞质或叶绿体。二级结构则以α-螺旋和β-折叠为主。8个NAC1蛋白三维结构上的相似性暗示了功能上存在相似。本研究结果为进一步挖掘生物逆境相关NAC1转录因子的功能和改良植物抗生物逆境特性提供理论依据。     

含有α-胰凝乳蛋白酶作用位点的Cry3A突变体的构建、表达、纯化以及杀虫活性分析

[目的]构建含有α-胰凝乳蛋白酶作用位点的Cry3A的突变体Cry3Am,以期提高Cry3A的活化效率,增强杀虫活性.[方法]利用重叠PCR技术,构建Cry3A杀虫蛋白的突变体Cry3Am,使之在原核细胞中表达纯化突变体蛋白;将Cry3Am与饲料混合后饲喂黄粉虫,用以评价Cry3Am的杀虫活性.[结果]成功地在Cry3h杀虫蛋白结构域I的α3和α4之间加上1个α-胰凝乳蛋白酶的作用位点,并提取Cry3Am到杀虫蛋白.体外酶切试验结果表明,Cry3Am很容易地被降解为55 kD的杀虫蛋白.生测分析结果表明,Cry3Am对黄粉虫的毒力是Cry3A的2倍以上.[结论]向Cry3A中插入α-胰凝乳蛋白酶作用位点可以使突变体Cry3Am很容易地被α-胰凝乳蛋白酶降解成55 kD的片段,并能提高Cry3A的杀虫活性.     

沙门氏菌效应蛋白SopB288～309肽段介导SopB依赖的HeLa细胞AKT的磷酸化研究

[目的]研究沙门氏菌效应蛋白SopB中跨膜疏水结构域288-309肽段对受SopB诱导的HeLa细胞Akt磷酸化激活中的功能。[方法]通过重叠延伸PCR的方法构建SopB第288~309位肽段缺失突变基因,并将该基因在HeLa细胞中进行异位表达,与野生型SopB基因进行比较,确定缺失的第288~309位间肽段在受SopB诱导的Akt磷酸化激活中的作用。[结果]与空载体对照相比较,在HeLa细胞中表达野生型SopB重组质粒明显激活了pAkt473的磷酸化,而在HeLa细胞中表达SopB缺失突变体SopBΔ288-309时,则检测不到pAkt473的磷酸化激活。[结论]SopB表达激活HeLa细胞pAkt473的磷酸化与其第288~309位肽段的功能直接相关,该跨膜疏水结构域的缺失导致SopB蛋白不能亚细胞定位至细胞膜,从而导致SopBΔ288-309对pAkt473磷酸化激活功能的丧失。     

鸡BRD2基因及其剪接体的克隆测序与亚细胞定位分析

[目的]克隆鸡含溴结构域蛋白2(BRD2)基因及其剪接体,并对其进行序列分析和亚细胞定位,为深入研究鸡BRD2基因及其剪接体在细胞转录调控中的作用机理打下基础.[方法]通过RT-PCR扩增鸡BRD2基因及其剪接体的编码区(CDS)序列,采用BioEdit、ProtParam、SOPMA、SWISS-MODEL、CDART等在线软件进行生物信息学分析;鸡BRD2基因及其剪接体经Xho I和BamH I双酶切后,分别亚克隆至真核表达载体pEGFP-C1多克隆位点上构建重组真核表达载体,通过转染HEK-293T细胞进行亚细胞定位分析.[结果]鸡BRD2基因CDS序列全长2340 bp,编码779个氨基酸残基,分子量为85.66 kD,理论等电点(pI)为8.74,其编码蛋白二级结构主要由无规则卷曲(60.59%)和α-螺旋(28.50%)组成,含有3个明显的功能结构域(2个BD结构域和1个ET结构域).与鸡BRD2基因相比,其剪接体BRD2-X1、BRD2-X2和BRD2-X3的CDS序列长分别为2301、2283和1983 bp,编码766、760和660个氨基酸残基.以鸡BRD2氨基酸序列为参照,BRD2-X1表现为第526~537位氨基酸缺失,BRD2-X2表现为第1~19位氨基酸缺失,BRD2-X3表现为第1~119位氨基酸缺失;与鸡BRD2蛋白相比,鸡BRD2基因剪接体BRD2-X1和BRD2-X2并未影响鸡BRD2蛋白的功能结构域,而剪接体BRD2-X3导致鸡BRD2蛋白第一个BD结构域部分缺失.鸡BRD2基因融合蛋白EGFP-BRD2及其剪接体融合蛋白EGFP-BRD2-X1、EGFP-BRD2-X2和EGFP-BRD2-X3均定位在细胞核,EGFP-BRD2和EGFP-BRD2-X1在细胞核中呈均匀分布,而EGFP-BRD2-X2和EGFP-BRD2-X3在细胞核中呈不均匀的点状分布.[结论]鸡BRD2蛋白及其剪接体均定位在细胞核,但BD结构域缺失可引起BRD2剪接体BRD2-X3细胞核定位模式的变化.     

溶藻弧菌III型分泌系统vscC基因缺失株的构建(英文)

[目的]构建未引入任何遗传标记物的溶藻弧菌vscC基因框内缺失突变株。[方法]首先以溶藻弧菌ZJ51-O基因组DNA为模板,用重叠延伸PCR(gene splicing by overlapext ension PCR,SOE-PCR)扩增法构建体外vscC基因缺失片段;扩增产物经酶切后连接至自杀质粒pDM4,再转化入大肠杆菌SY327进行克隆,筛选阳性克隆子并进行PCR分析鉴定;提取阳性克隆子的自杀重组质粒pDM4-△vscC,用热休克法将其转入到大肠杆菌S17-1中,再经接合生殖的方式将自杀重组质粒导入溶藻弧菌ZJ51-O菌株中,利用抗生素筛选策略与蔗糖反向筛选系统,挑选疑似目的突变菌株,最后利用PCR鉴定与测序分析进行确证。[结果]溶藻弧菌ZJ51-O的vscC基因框内缺失突变株构建成功。[结论]该研究为进一步研究vscC基因的功能和T3SS在溶藻弧菌致病过程中所起的作用奠定基础,同时也为溶藻弧菌的其他基因突变株的构建和研究提供了参考和试验经验。     

溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统vscC基因缺失株的构建

[目的]构建未引入任何遗传标记物的溶藻弧菌vscC基因框内缺失突变株。[方法]首先以溶藻弧菌ZJ51-O基因组DNA为模板,用重叠延伸PCR(gene splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)扩增法构建体外vscC基因缺失片段;扩增产物经酶切后连接至自杀质粒pDM4,再转化入大肠杆菌SY327进行克隆,筛选阳性克隆子并进行PCR分析鉴定;提取阳性克隆子的自杀重组质粒pDM4-△vscC,用热休克法将其转入到大肠杆菌S17-1中,再经接合生殖的方式将自杀重组质粒导入溶藻弧菌ZJ51-O菌株中,利用抗生素筛选策略与蔗糖反向筛选系统,挑选疑似目的突变菌株,最后利用PCR鉴定与测序分析进行确证。[结果]溶藻弧菌ZJ51-O的vscC基因框内缺失突变株构建成功。[结论]该研究为进一步研究vscC基因的功能和T3SS在溶藻弧菌致病过程中所起的作用奠定基础,同时也为溶藻弧菌的其他基因突变株的构建和研究提供了参考和试验经验。     

响应面法优化核桃青皮色素棉织物染色工艺

[目的]广泛开发具有保健功能的天然染料,选用核桃青皮对棉织物进行染色。[方法]通过紫外扫描图谱研究了核桃青皮染液的热稳定性,响应面法优化不同染液浓度、碱(碳酸氢钠)浓度、时间、温度下棉织物的染色工艺,以未染色棉织物为对照,总色差为指标,最后应用扫描电镜图谱分析棉织物染色前后形貌变化。[结果]核桃青皮染液在100℃内稳定性良好;模型优化的条件为染液浓度70mg/m L,碱浓度3.91%,时间102 min,温度100℃,此条件下,总色差为35.292,各因素中碱浓度是影响总色差值的最显著因素,染液浓度和碱浓度交互作用极显著(P0.01);扫描电镜图显示棉织物染色前后形貌未发生改变;由于媒染剂的络合作用,预媒染染色色牢度比直接染色普遍高1~2级,色牢度均达4级。[结论]响应面法可有效优化核桃青皮染液的棉织物染色工艺。     

dsRNA介导的抗ToMV和CMV植物表达载体的构建

[目的]构建通过表达dsRNA,诱导植物基因沉默机制可抗2种病毒的表达载体.[方法]根据已报道番茄花叶病毒(ToMV)的运动蛋白基因(MP)和黄瓜花叶病毒(CMV)的沉默抑制子基因(2b)的核苷酸序列设计特异性引物,扩增到部分△MP和2b基因;然后通过重组PCR技术将2个病毒基因进行融合,获得长度为676 bp的融合基因△MP-2b.再将融合基因以反向重复的方式与大豆内含子相连,并定向插入到植物表达载体pBIN438上35S启动子下游.[结果]构建了含两种不同病毒来源基因的植物表达载体pBIN438△MP-2b(i/r).酶切和PCR鉴定证明所构建的载体与预期的设计完全一致.[结论]为利用RNA沉默原理进行植物广谱抗病研究奠定了基础.     

水稻白叶枯病菌fkbM基因对其运动性的影响

[目的]研究水稻白叶枯病菌fkb M基因对其运动性的影响。[方法]采用同源置换方法对水稻白叶枯病菌野生型菌株PXO99A的fkbM基因进行基因敲除,构建突变菌株ΔfkbM_(Xoo),同时构建互补菌株ΔfkbM_(Xoo)(C)。通过运动性试验,确定fkbM基因对运动性的影响。[结果]与野生型菌株PXO99~A相比,ΔfkbM_(Xoo)突变体运动性明显减弱,而互补菌株ΔfkbM_(Xoo)(C)能基本恢复水稻白叶枯病菌的运动性。[结论]水稻白叶枯病菌fkbM基因突变能减弱水稻白叶枯病菌的运动能力。     

鲈形目线粒体DNA蛋白编码基因的适用性分析

[目的]对线粒体DNA 13种蛋白质编码基因的系统进化分析能力进行了评估。[方法]单个基因和基因拼接序列比较,综合考虑序列的信息量和邻位连接法构建系统进化树的置信度。[结果]按分类阶元不同将基因都分成不同的4等。在鲈形目的科间阶元,最好的为ND6和cox2 好的序列为ND5和ND4 ND4L、ND3和ATP8差 包括Cyt b、cox1在内的其余6种基因为中等 在属内种间阶元,最好的为ATP6和cox2 好的序列为ND2和cox1 ND6、ND3和ATP8差 包括Cyt b在内的其余6种基因为中等。另外,分析揭示序列长度的增加可以提高系统进化树的置信度,且属内物种间比较时序列长度的影响小于高级阶元。[结论]线粒体DNA蛋白质编码基因的信息分布具不均一性,需分类阶元选择最佳基因和组合。     

青脚麻鸡新城疫和禽流感母源抗体的衰减规律研究

[目的]为青脚麻鸡的新城疫(ND)和禽流感(AI)预防提供依据。[方法]采用血凝抑制(HI)试验测定了3个鸡场青脚麻鸡在1～30日龄的AI H5、AI H9和ND母源抗体水平,并计算相应母源抗体的半衰期。[结果]3个鸡场的AI H5母源抗体水平均较低,1日龄母源抗体HI效价分别是5.8log2、7.2log2和6.0log2,AI H9和ND的母源抗体水平相对较高。青脚麻雏鸡的AI H5、AI H9和ND母源抗体平均半衰期分别为2.49、2.87和2.22 d。[结论]青脚麻雏鸡的AI H5首免日龄推荐为3～6日龄,AI H9和ND首免日龄推荐为7～12日龄。     

产碱性蛋白酶海洋菌的诱变及其酶学性质的初步研究

[目的]筛选出高产碱性蛋白酶的菌株,为其在生产中的应用提供依据。[方法]从青岛沿海海域采集的海水及海泥中分离得到产碱性蛋白酶的菌株,经紫外诱变和微波诱变处理,获得目标菌株并测定菌株的酶活力,同时对诱变菌株的酶学性质进行初步的研究。[结果]筛选出的菌株酶活力为145 U/ml,经过复合诱变后,菌株ZR-58-3-1-3发酵液的酶活力达775 U/ml,比出发菌株高4.3倍。菌株所产碱性蛋白酶的最适反应温度为45℃,属中温蛋白酶;最适作用pH为8.5,具有较高的热稳定性。[结论]菌株ZR-58-3-1-3产碱性蛋白酶的性能稳定,可作为产碱性蛋白酶的突变菌株。