牛乳铁蛋白抗菌肽(Lactoferricin)基因的克隆与表达质粒构建

按大肠杆菌偏爱密码子设计了牛乳铁蛋白肽的3段引物序列,通过PCR合成BeL1-2-3,经双酶切后克隆入pED质粒的BamHⅠ和HindⅢ位点之间,构建出牛乳铁蛋白肽的表达载体,转化至E.coliBL-2(1 DE3),获得牛的乳铁蛋白肽基因克隆菌。该克隆菌经诱导后,可表达出可观的融合蛋白,且表达量与诱导时间呈一定相关性。     

猪乳铁蛋白肽LFcinP基因在巴斯德毕赤酵母中组成型表达及其抑菌活性检测

为获得具有生物活性作用的猪乳铁蛋白肽LFcinP基因在巴斯德毕赤酵母中进行组成型表达,检索NCBI数据库公布的牛、羊、猪、骆驼等动物的乳铁蛋白及其抗菌肽的氨基酸序列,运用ExPASY在线网站,对猪乳铁蛋白保守区域所编码的蛋白进行理化性质分析,参照巴斯德毕赤酵母使用密码子偏好性,优化设计合成138 bp编码猪乳铁蛋白肽LFcinP基因,通过pGAPHαM酵母组成型分泌表达载体将其整合到巴斯德毕赤酵母GS115菌株,获得表达猪乳铁蛋白肽LFcinP基因重组酵母菌株GS115p/GAPHαM-LFcinP。SDS-PAGE和Westernblot分析表明,获得5.4 ku乳铁蛋白肽;分析96 h的蛋白电泳带结果表明,重组蛋白占酵母菌上清蛋白35.9%,表达量为48.5μg.mL-1;动态生长曲线法抑菌试验结果表明,重组猪乳铁蛋白肽具有一定的抑菌作用。     

不同猪种乳铁蛋白基因启动子区单核苷酸多态性分析

通过构建DNA池和测序,分析了广东蓝塘猪、大花白猪和外来长白猪3个猪种的乳铁蛋白基因启动子区和部分5'UTR区1 494 by的单核苷酸多态性.结果表明,在3个猪种中发现了24处单核苷酸突变,其中12处为转换,8处为颠换,3处为插人.1处为缺失突变.通过生物信息学方法预测了猪乳铁蛋白基因启动子转录因子结合位点,发现了5个SNP:-1032A>G、-989C>T、-740T>G、-732G缺失、-680A>G,分别位于PEA3、cAMP、STAT5、SRY转录因子结合位点上,其中-1032 A>G产生了MYTI结合位点,-680A>G导致了SRY结合位点消失,引起了转录因子结合位点的改变,但是否对启动子转录活性有影响还需要进行深人研究.     

脑膜炎奈瑟氏菌NspA基因重组乳酸菌表达载体的构建及原核表达

用Nco Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切克隆质粒pMD-18T-NspA及可以在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达的载体质粒pW425et,将NspA基因与pW425et表达载体用T4DNA连接酶相连,构建出重组质粒pW425et-NspA,将其转入至E.coli DH5α感受态细胞中,筛选阳性重组子进行SDS-PAGE和Wester...     

乳铁蛋白肽的作用机制及其转基因研究进展

近年来抗菌肽由于自身的优点已成为抗生素的替代品,并已成为研究与开发的热点 ,乳铁蛋白活性多肽(Lfcin)就是其中的一种,它是乳铁蛋白(LF)经胃蛋白酶在酸性条件下降解所产生的小肽,它构成了完整乳铁蛋白主要功能区的大部分,当它被降解下来后不仅仅保持了原来完整乳铁蛋白的活性甚至比原来完整乳铁蛋白的活性更强,因其具有广谱的抗细菌、抗病毒、抗真菌等多种独特的生物学活性而备受关注.对其结构、作用及作用机制、转基因研究这几方面的最新国内外研究动态进行综述.     

重组NDV HN基因乳酸菌穿梭表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

为构建新城疫病毒乳酸菌穿梭表达载体,采用RT-PCR方法从新城疫病毒中扩增了HN基因,将其克隆到pMD18-T Simple Vector中.经测序鉴定正确后,定向克隆至乳酸菌表达载体pW425et中,并转化入表达宿主菌BL21 (DE3),利用IPTG诱导表达.采用SDS-PAGE和Western blotting检测重组菌在大肠杆菌中的表达情况.结果表明:NDVHN基因与表达载体pW425et正确重组,且该重组菌传50代次以上,重组质粒依然稳定.SDS-PAGE显示表达出约63 kD的条带,与已知表达的HN蛋白大小相符.Western blotting进一步证实该蛋白能被NDV阳性抗体所识别,具有反应原性.表明构建了重组NDVHN基因乳酸菌穿梭表达载体.     

不同泌乳期小鼠乳腺乳铁蛋白基因的表达

选取昆明小鼠为研究对象,以看家基因GAPDH为内参,用RT-PCR法对不同泌乳期小鼠乳腺组织乳铁蛋白基因的表达进行了研究。结果显示:不同泌乳期小鼠乳腺均有乳铁蛋白基因的表达,表达水平随泌乳过程的进行呈下降趋势,泌乳早期与中期和晚期差异显著。提示乳铁蛋白在泌乳期对小鼠乳腺免疫具有一定的调节作用。     

小白鼠乳铁蛋白基因片段克隆及不同泌乳阶段乳铁蛋白基因表达的差异

从泌乳期小白鼠乳腺组织中提取总RNA,用反转录酶反转录为cDNA后,根据已报道的小白鼠乳铁蛋白(LF) cDNA设计一对引物,采用聚合酶链式反应(PCR)进行扩增,获得一条897 bp的片段,克隆于pGEM-T Vector后进行序列分析表明,该片段为LF基因cDNA的部分序列,编码299个氨基酸组成的多肽,是成熟肽的主体部分.本研究得到的基因片段与已报道的小白鼠子宫LF cDNA部分序列的同源性达到99%.以LF基因片断的成功克隆为基础,本实验室构建了一优化的半定量RT-PCR法,以β-actin为内标,研究不同泌乳阶段小白鼠乳腺组织LF基因表达的差异.结果显示,不同泌乳阶段小白鼠LF基因表达有差异,在泌乳第1日,LF基因的表达量较高,从泌乳第1日到泌乳第10日和第18日,LF基因表达量呈下降趋势,到乳腺组织退化的干乳期(泌乳第25日),LF基因表达量又明显升高.     

民猪ZFAND5基因的克隆与真核表达载体构建

根据NcB1上已公布野猪的ZFAND5序列,设计上下游引物,PCR扩增,构建真核表达载体,酶切鉴定并测序.克隆并分析ZFAND5(zinc finger,AN1-type domain5)基因序列,构建zFAND5基因的真核表达载体,为转染细胞提供基础.通过研究首次获得了民猪的ZFAND5基因的全序列及其完整的cDNA...     

人乳铁蛋白腺病毒载体的构建及细胞表达

将人乳铁蛋白基因与腺病毒基因组骨架质粒重组,在293细胞中包装重组腺病毒颗粒,获得真核细胞表达的栽体pAd-hLTF.以pcDNA3X为模板,PCR扩增hLTF基因,腺病毒穿梭栽体pshuttle-cmv与hLTF重组为pshuttle-cmv-hLTF:再与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组为pAd-hLTF质粒:脂质体法将重组pAd-hLTF质粒转染HEK 293细胞.包装成重组腺病毒颗粒.Western blot和ELISA法测定细胞中hLTF基因的表达.结果表明,pAd-hLTT质粒转染293细胞后,7～10 d后,获得细胞裂解液,将细胞裂解产物再次接种新鲜的293细胞,3～5 d后,80%以上的细胞变圆、膨胀、漂浮.Westem blot和ELISA结果显示,上清液中有hLTF基因的表达,为重组人乳铁蛋白的体外表达及其功能分析奠定了基础.     

Cloning of Porcine Lactoferrin Gene and Construction of Expression System in Recombinant Lactobacillus

Lactobacillus was selected as a bacterial carrier for expression of N-lobe of porcine lactoferrin （PLFN）. A pair of primers was designed with Oligo6.0 and used to amplify PLFN gene. It was in accordance with the characters of translational fusions from gene and expression vector plasmid. A 1 077 bp fragment of the gene from PLF was cloned from mammary gland tissue of the lactating sow on the third day by RT-PCR; the gene was connected with the vector plasmid pPG612.1 and transformed into the host strain JM109. The recombinant expression vector plasmid pPG612-PLFN was created and identified by using plasmid extraction, PCR, restriction enzyme digestion and sequence analysis. The recombinant plasmid was transformed into Lactobacillus casei ATCC393, Lactobacillus plantarum KLDS 1.0344, Lactobacillus paracasei KLDS 1.0652 and Lactobacillus pentosus KLDS 1.0413 by electroporation, and produced the recombinant strains of pPG612-PLFN/L, casei, pPG612-PLFN/L, plantarum, pPG612-PLFN/ L. paracasei and pPG612-PLFN/L, pentosus, respectively. The results indicated that PLFN gene had inserted into the expression vectors and achieved multiple Laetobacillus expression systems. It electes the base for the expression and production of recombinant porcine lactoferrin in Lactobaeillus     

猪尿酸氧化酶基因的克隆及表达

本研究主要涉及猪尿酸氧化酶(urate oxidase,EC 1.7.3.3)的原核表达载体的构建及蛋白表达,并对其酶活性进行测定。从猪肝组织细胞中提取总的RNA,利用RT-PCR技术克隆pUOX(porcine urate oxidase),插入原核表达载体pET-22b中,构建重组表达载体pET-22b/pUOX,并转化到大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中。通过IPTG诱导获得的重组蛋白经SDS-PAGE检测,在约34 ku处有一清晰蛋白条带,这与预期分子量一致。测定该重组蛋白的酶活力达到1.962 U,这为后期实验奠定了重要的基础。     

干酪乳杆菌表面展示IBDV VP2蛋白

旨在利用pLA载体将IBDV B87株VP2蛋白展示在干酪乳杆菌表面。首先通过RT-PCR扩增VP2基因片段,测序鉴定正确后,将目的片段构建在pLA穿梭质粒上,命名为pLA-VP2,然后将重组质粒电转化到干酪乳杆菌中,构建IBDV重组干酪乳杆菌。应用SDS-PAGE检测重组菌表达目的蛋白VP2,得到约90 kDa的融合蛋白,与预期结果相符。Western blot结果显示VP2蛋白可以与抗IBDV多抗血清发生特异性反应,具有很好反应原性。流式细胞仪的散射光检测器可以捕捉到pLA-VP2重组菌菌体表面的荧光,且重组菌荧光强度强于pLA菌对照组,应用正态分布函数计算pgsA-VP2融合蛋白的表达效率,约为80%。结果表明IBDV VP2蛋白成功展示在干酪乳杆菌表面。     

猪γ干扰素基因真核重组表达质粒的构建及活性测定

以含有全长猪γ干扰素基因的质粒为模板,通过PCR方法扩增猪γ干扰素并引入酶切位点,酶切后与PCI真核表达载体连接在一起,测序后经比较,所扩增序列同Genebank报道的IFN-γ序列同源性为99·8%.将重组质粒转染PK细胞,检测所转染的pIFN-γ的抗病毒活性.试验结果表明,转染pIFN-γ试验组与正常细胞接毒对照组比较有显著差异,说明所构建的重组质粒转染后具有抗病毒作用.     

益生菌Lactobacillus casei Zhang冻干粉对小鼠急性毒性的研究

通过研究益生菌Lactobacillus casei Zhang冻干粉对小鼠急性毒性作用,为该菌株的安全应用提供依据。连续14 d对小鼠灌胃不同剂量的L.casei Zhang冻干粉,各剂量组小鼠的一般体征、肝脏功能、脏器指数以及肝、肾、脾形态学的观察结果与对照组相比无显著差异（P>0.05）。急性毒性试验及相关指标检测结果显示L.casei Zhang冻干粉无毒副作用。     

牛奶中乳铁蛋白含量的影响因素及调控机制研究进展

乳铁蛋白是一种铁结合性糖蛋白,广泛存在于哺乳动物的分泌物中。研究表明,乳铁蛋白具有多种生物学功能。本文就牛奶中乳铁蛋白含量的影响因素及其基因调控特点方面的研究做简要综述。     

猪流行性腹泻病毒N基因的克隆及原核表达

从患猪流行性腹泻的病猪粪便中分离了猪流行性腹泻病毒(PEDV)命名为HLJBY,将病毒在Vero细胞上传代,使之适应生长。将扩增的猪流行性腹泻病毒的N基因克隆到原核表达载体PET30a上,构建了重组表达质粒PET-30a-PEDV-N,并在37℃的条件下诱导表达,通过不同时间取样,经SDS-PAGE分析结果表明,该蛋白...     

3株乳杆菌表面疏水性及凝聚性研究

[目的]探讨干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌和植物乳杆菌的表面疏水性以及凝聚性。[方法]采用MATH法测定3株乳杆菌的表面疏水率,自凝聚试验测定菌株的自凝聚率,共凝聚试验测定3株乳杆菌与致病菌的共凝聚率。[结果]3个菌株的涡旋时间与表面疏水性呈负相关,静置时间与自凝聚作用呈正相关,且凝聚作用与致病菌的粘附和菌体自身特性有关。[结论]3株乳杆菌在肠道中均表现出良好的凝聚能力。     

益生菌Lactobacillus casei|Zhang 高密度发酵中试工艺及动力学研究

在益生菌L.caseiZhang高密度培养小试（3L）基础上,进行30L到150L逐级放大中试生产工艺的研究以确定规模化生产工艺。在优化的发酵工艺下,150L规模发酵菌体密度可达2.9×10^10cfu/mL,与小试水平无差异。采用origin7.5软件在logistic equation基础上建立L.caseiZhang的生长和葡萄糖代谢动力学模型,模型与试验值拟合良好,平均误差小于10%,能够较好地反应发酵过程。初步探讨发酵后菌体的离心和冷冻干燥过程对菌体的影响,虽然发酵液经离心收集菌体后冷冻干燥可得到平均活菌数2.65×10^11cfu/g的菌粉,能够满足益生菌制剂和发酵剂对高活菌数的要求,但冻干前后活菌得率仅49.97%。有必要针对L.casei Zhang的冻干保护剂和冻干工艺进一步优化,以提高菌体存活率得到更高菌体浓度的益生菌粉。