海洋假交替单胞菌CI4菌株抗菌蛋白分离纯化的初步研究

将海洋假交替单胞菌Pseudoaltermonas sp.CI4菌株于VNSS液体培养基中培养,获得浓缩无细胞上清液,采用纸片扩散法检测其抗菌活性。结果表明,该菌株的胞外产物能够抑制从岩石表面分离的污损细菌S1菌株和其自身的生长。除去菌体培养液,用饱和度为70%的硫酸铵沉淀,所得的拮抗物粗提液对热部分敏感,对蛋白酶K和链霉蛋白酶敏感,其作用的活性pH稳定范围为5.0-9.0。粗提液经Sephadex G-200柱层析、DE-52纤维素离子交换柱层析,Microcon离心超滤管分级和聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）跟踪检测,得到电泳纯抗菌蛋白,其相对分子质量为37 200。     

生防细菌ML-3抗菌蛋白稳定性研究

为确定ML-3表达的抗菌蛋白在不同外部环境下的稳定性,本研究采用不同温度、p H、紫外光照时间、金属离子、蛋白酶处理,对ML-3抗菌蛋白抑菌性进行研究。结果表明:该抗菌蛋白在低于60℃、p H5～8、紫外光照24h下可以保持较高抑菌活性;对Cu2+和Mg2+敏感,对Na+、K+、Zn2+和Fe2+不敏感;对胃蛋白酶和胰蛋白酶敏感,对蛋白酶K不敏感。提示ML-3抗菌蛋白在田间生物防治中具有一定应用潜力。     

苍白杆菌SY286抑菌活性蛋白稳定性分析

利用饱和硫酸铵沉淀法从苍白杆菌(Ochrobactrum sp.)SY286发酵滤液中提取抑菌活性蛋白,通过温度、酸碱度、紫外线以及蛋白酶对活性物质的影响,测定活性物质的稳定性。结果表明,经60%饱和硫酸铵溶液盐析出的活性蛋白对葡萄霜霉病菌的抑菌活性最强,抑制率达81.98%。温度、酸碱度以及紫外线对抑菌粗提蛋白的活性均有一定影响。抑菌粗提蛋白在50℃以下和pH 4～10条件下抑菌活性相对稳定。抑菌粗提蛋白的抑菌活性受蛋白酶的影响较大,蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶均对其活性具有较大影响。     

拮抗菌B-001抗菌蛋白产生的最佳发酵条件和特性及其室内防效

分离得到1株抑制烟草青枯病菌的内生拮抗菌B-001菌株.为确定其抗菌蛋白产生的最佳培养基和培养条件,用硫酸铵沉淀法从发酵液中提取抗菌蛋白质,测定其对烟草青枯病菌抗菌活性,确定产生抗菌蛋白的最佳培养基为BPY液体培养基,最佳发酵条件为pH7.0,30℃,装液量100 mL,200 r/min振荡培养96 h;抗菌蛋白在pH5.0,pH8.0时抑菌活性仍分别保持90%,96%;pH6.0,pH7.0时抑菌活性仍保持不变;对酸、碱稳定;经40～100℃处理20 min后抑菌活性保持不变,具有良好的热稳定性;对蛋白酶有一定的耐受性.在温室内,抗菌蛋白粗提液对烟草青枯病可取得83.8%的防效.     

解淀粉芽孢杆菌抑菌活性初步研究

为了进一步分离纯化抑菌蛋白和脂肽类物质,促进拮抗菌的开发和利用,选取2株对多种植物病原真菌具有良好拮抗作用的解淀粉芽孢杆菌,利用硫酸铵沉淀法粗提2株菌株的抑菌蛋白,酸沉淀法粗提脂态类抑菌物质,分别测定粗提物对多种植物病原真菌的抑制效果。初步检测2株菌株是否具有产纤维素酶、蛋白酶和嗜铁素活性。结果表明:BQD1菌株20%~30%的蛋白粗提液对玉米大斑病菌拮抗作用最强,抑菌直径达31.48mm。TY菌株30%~40%的蛋白粗提液对玉米大斑病菌抑菌直径最高达34.20mm。2株菌株脂态类粗提液对靶标病原菌株的拮抗作用均高于其发酵液,且均可产生纤维素酶、蛋白酶和嗜铁素。     

小麦纹枯病菌拮抗菌株X2-3的鉴定及其抗菌特性分析

从小麦根际土中分离到一株对小麦纹枯病菌拮抗活性较高的菌株X2-3,为进一步利用该菌株,对其进行了鉴定,并对其抗菌特性进行了分析。根据菌落形态和产酶特征及16S r DNA分析,将菌株X2-3鉴定为辣椒溶杆菌(Lysobacter capsici)。平板对峙法测定其抑菌谱发现,X2-3对Rhizoctonia cerealis、Thielaviopsis basicola等多种植物病原真菌和Phytophthora parasitica等卵菌表现明显的抑菌活性,但对Xanthomonas oryzae pv.oryzae和Ralstonia solanacearum等革兰氏阴性细菌没有拮抗活性。抗菌物质稳定性分析结果发现,粗提纯的抗菌物对蛋白酶K和温度不敏感,表明该物质可能属于非线性蛋白,且具有一定的耐热性。     

大豆根腐病拮抗菌枯草芽孢杆菌8-32抗菌物质性质的初步研究

对致病菌—尖孢镰刀菌(Fusrium oxysporum)具有较强拮抗作用的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)8-32产生的理化性质进行了初步研究。结果表明,该抗菌物质80℃处理30 min,拮抗活性仍保持在90.00%,100℃以上会完全丧失活性;在p H 7.0~11.0范围内抑菌活性较稳定,最适p H为8.0;高浓度(25mmol/L)EDTA使其拮抗活性降低62%;该抗菌物质对Cu2+、Fe3+敏感,对蛋白酶K不敏感。枯草芽孢杆菌8-32产生的抗菌物质具有一定的耐热、耐碱(p H 11.0)、对蛋白酶不敏感等特性。     

花脸蘑(Lepista sordida)蛋白粗提液抗烟草花叶病毒活性研究

以花脸蘑蛋白粗提液为对象,研究了其诱导烟草对TMV的抗性,对TMV的体外钝化作用及对TMV引起的番茄病毒病的室内控制作用;探讨了浓度、温度、pH值对花脸蘑蛋白粗提液抗TMV活性的影响。结果表明:当粗提液浓度为100μg/mL时,诱导烟草抗TMV的侵染枯斑抑制率可达83.97%,对TMV的体外钝化作用的枯斑抑制率为74.57%,对番茄病毒病的室内控制效果达到82.70%,表明花脸蘑蛋白粗提液通过诱导抗病性和对TMV的体外钝化作用达到了控制TMV的作用;花脸蘑蛋白粗提液具有很好的温度稳定性,在50℃的条件下处理30 min,抗TMV侵染的枯斑抑制率仍达66.30%;花脸蘑蛋白粗提液也具有很好的pH值稳定性,pH敏感性试验表明,在pH为4.0~10.0的条件下,都具有抗TMV活性,在中性(pH=8)的条件下,活性最强可达81.50%。     

合浦珠母贝抗菌肽粗提液制备方法的优化

研究了不同处理方法制备合浦珠母贝外套膜和鳃组织抗菌肽粗提液的抗菌活性,结果表明：以1.0×106cfu·mL^-1无乳链球菌刺激合浦珠母贝14 h以内对其粗提液抗菌活性无显著影响;合浦珠母贝外套膜或鳃组织抗菌肽粗提液制备时,IKAT-18匀浆机的匀浆效果要优于组织匀浆器和研钵。100℃水浴处理组织粗提液10 m in可显著提高其对溶藻弧菌的抗菌活性;反复冻融则会显著降低外套膜组织粗提液的抗菌效果。     

短短芽孢杆菌JK-2菌株抑菌物质特性的研究

研究短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis) JK-2菌株产生的抑菌物质特性,对其抑菌物质粗提液的稳定性进行测定,同时对其活性成分进行初步分离.稳定性试验结果表明JK-2产生的抑菌物质粗提物对蛋白酶不敏感,耐强酸强碱,紫外线和反复冻融对其活性均无显著影响.从JK-2发酵液中初步分离出分子量约为4.1 kDa的活性肽和具有抑制枯萎菌活性的胞外多糖.     

海域霉菌对植物病原真菌抗性的研究

以玉蜀黍平脐蠕孢菌(Bipolaris maydis)和大豆尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)为指示菌株,采用平板对峙培养法初步测定渤海海洋霉菌的抑菌活性,再用牛津杯扩散法对初筛获得的活性菌株的发酵液进行抑菌活性测定。结果表明,菌株67对玉蜀黍平脐蠕孢菌和大豆尖孢镰刀菌有很强的抑制作用,菌株32对玉蜀黍平脐蠕孢菌有较好的抑制作用。将菌株67在28℃,180 r/min条件下发酵培养66 h,生物量达到7.054 mg/mL,在54~120 h的发酵时间内,发酵液均具有抑菌活性,发酵96 h时抑菌效果最明显,对F.oxysporum和B.maydis的抑菌圈直径分别为20.3 mm和13.6 mm。同时发现,菌株67发酵液的抑菌活性不仅与发酵时间有关,而且与发酵液的pH值相关,具有明显的抑菌活性的发酵液的pH范围为4.0~5.0。     

甲基营养型芽孢杆菌BH21对葡萄灰霉病菌的拮抗作用

【目的】甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）BH21是一株对葡萄灰霉病菌（Botrytis cinerea）有较好拮抗作用的海洋源细菌,鉴定该菌株脂肽类抗菌物质合成基因,检测脂肽粗提物对葡萄灰霉病菌的拮抗作用,为应用该菌株防治葡萄灰霉病提供科学依据。【方法】通过特异引物的基因组PCR法检测甲基营养型芽孢杆菌BH21菌株合成脂肽的能力;盐酸沉淀和甲醇抽提法从无菌发酵液中提取脂肽粗提物;排油圈法检测脂肽粗提物的表面活性;采用菌丝生长速率法检测脂肽粗提物对灰霉病菌菌丝生长的抑制作用并计算有效中浓度EC₅₀;利用高效液相色谱技术（HPLC）对脂肽粗提物洗脱分离,并采用菌丝生长速率法检测各组分对葡萄灰霉病菌的抑制能力;采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）分析主要抑菌成分的脂肽类型。采用离体叶片接种法检测脂肽粗提物对葡萄灰霉病的防治效果。【结果】选取11对特异引物对菌株BH21基因组扩增,其中7对引物扩增出预期核酸片段;扩增产物经测序、BLAST比对分析,结果显示扩增产物与相关菌株脂肽基因相似度为96%-99%,扩增产物翻译的蛋白与相关菌株的脂肽合成蛋白相似度为96%-100%,表明甲基营养型芽孢杆菌BH21基因组中含有ituA、bamD、ituC、ituD、fenD、srfAB、yndJ,该菌株具有合成surfactin、iturin及fengycin等多种脂肽类抗菌物质的能力。盐酸沉淀和甲醇抽提从LB无菌发酵液中获得脂肽粗提物,得率为428 mg·L^-1。排油圈检测结果显示,脂肽粗提物使橄榄油膜形成排油圈,表明脂肽粗提物具有表面活性。脂肽粗提物对葡萄灰霉病菌菌丝生长具有显著的抑制作用,脂肽粗提物浓度为440 μg·mL^-1时,对葡萄灰霉病菌菌丝生长的相对抑制率为82.8%。根据毒力方程计算,抑制葡萄灰霉病菌菌丝生长的脂肽粗提物EC₅₀为144.39 μg·mL^-1。HPLC分离纯化脂肽粗提物获得6个组分,只有组分BH21-2和BH21-3抑制葡萄灰霉病菌的生长,RP-HPLC色谱图分析表明组分BH21-2和BH21-3属于fengycin家族脂肽。葡萄灰霉病离体叶片试验结果表明,脂肽粗提物浓度为400 μg·mL^-1时,对葡萄叶片灰霉病防病效果为100%;脂肽粗提物浓度为220 μg·mL^-1时,对葡萄叶片病斑扩展相对抑制率为94.4%。【结论】甲基营养型芽孢杆菌菌株BH21具有合成surfactin、iturin及fengycin等多种脂肽类抗菌物质的基因,该菌株脂肽粗提物对葡萄灰霉病菌具有较强的拮抗作用,在葡萄灰霉病生物防治中具有应用潜力。     

小麦赤霉病的生物防治研究 Ⅲ .拮抗芽孢杆菌B4、B6菌株的防病机制

枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)B4和B6菌株对小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum)的作用机制主要是通过产生抗生代谢产物抑制病菌的孢子萌发和菌丝生长。抗菌物质无挥发性,主要为脂溶性和水溶物质。通过硫酸铵盐析和SDS-PGE分析,抗菌蛋白是重要的抗菌物质,蛋白组分的分子量范围在20～63kD之间。最适于两菌株产生抗菌物质的条件是:YSP培养基、pH7 0、28℃和充足的氧。产生抗菌活性物质的高峰期,分别是在培养72h(B6菌株)和96h(B4菌株)。抗菌物质在酸性和中性条件下对热稳定,在碱性条件下则不稳定。     

近缘毛壳Chaetomium subaffine LB-1抑菌物质存在部位及提取方法

【目的】对近缘毛壳Chaetomium subaffine菌株LB-1产生抑菌物质的部位及提取方法进行研究,为开发生防菌株LB-1防治植物病害奠定基础。【方法】以番茄灰霉病菌Botrytis cinerea和玉米大斑病菌Exserohilum turcicum为指示菌,采用平板密封培养法检测菌株LB-1是否产生挥发性抑菌物质;采用菌体超声破碎和液态培养的方式检测菌株LB-1产生的非挥发性抑菌物质存在的部位;采用含毒培养基法和滤纸片法检测菌株LB-1培养液的硫酸铵沉淀、盐酸沉淀和有机溶剂萃取物的抑菌效果,以确定菌株LB-1培养液中抑菌物质的提取方法。【结果】菌株LB-1与2种供试病原菌密封共培养时,对病原菌的生长没有明显影响,表明菌株LB-1不能产生挥发性抑菌物质。菌株LB-1菌体胞内提取物的抑菌活性与对照无差异,但其培养液对B. cinerea和E. turcicum的生长有较强的抑制作用,表明菌株LB-1产生的抑菌物质存在于菌体细胞外。菌株LB-1培养液的硫酸铵沉淀和盐酸沉淀对2种供试植物病原真菌的生长均无抑制效果,但有机溶剂萃取可获得菌株LB-1培养液中的抑菌物质,其中正丁醇萃取物...     

植物枯萎病拮抗细菌KL-1菌株的分离及鉴定

[目的]筛选、鉴定植物枯萎病菌拮抗细菌,为植物枯萎病生防制剂的研究奠定基础。[方法]采用对峙培养法筛选对植物枯萎病菌具有良好抑制作用的生防细菌,通过Biolog细菌自动鉴定系统和16SrDNA序列分析法鉴定其分类地位,并研究该菌株对棉花和小鼠的安全性。[结果]从棉花根际土壤中分离出的12株细菌中,有5株对多隔镰刀菌、香石竹尖孢镰刀菌、棉花枯萎病菌具有拮抗活性;其中,KL-1菌株对3株目标病原菌的抑菌活性分别达69.09%、80.78%、78.89%。Biolog细菌自动鉴定系统和16SrDNA序列分析法鉴定结果表明,KL-1菌株为解淀粉芽孢杆菌;生物安全性初步测定结果表明,KL-1菌株对棉花和小鼠安全无毒。[结论]解淀粉芽孢杆菌KL-1菌株具有对多种植物枯萎病菌的抑菌活性,且对棉花和小鼠安全无毒,是一株具有研究和开发潜能的生防菌株。     

抗烟草青枯病菌的枯草芽孢杆菌SH7的筛选与鉴定

由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)侵染引起的烟草青枯病是我国烟区的主要病害之一,严重影响烟草的产量和品质。从云南和贵州烟草青枯病重病区采集600份健康烟草根基土壤,并从中筛选出1株对R. solanacearum具有较强拮抗活性的细菌菌株SH7,该菌株在室内平板抑菌试验中,对R. solanacearum抑菌带宽可达132 mm。预先用SH7无菌发酵液保护烟株根部,对R. solanacearum防效达到66.0％。SH7发酵液经70％(NH4)2SO4饱和度沉淀并透析后得到的蛋白粗提液经平板抑菌活性检测,对R. solanacearum具有很强的抑菌活性,抑菌带宽为157 mm。初步确定SH7菌株产生的主要抑菌活性物质为蛋白多肽类物质。经菌体形态学、生理生化测定和16s rDNA序列测定,结果表明:SH7菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。     

大丽轮枝菌拮抗细菌菌株12-51的筛选鉴定与抗菌物性质分析

由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb)引起的棉花黄萎病,是一种危害严重的世界性病害.通过初筛和复筛得到了对棉花黄萎病具有较高拮抗活性的细菌菌株12-51,通过对其进行形态鉴定、生理生化特征鉴定和16S rDNA全序列分析,最终鉴定此菌株为Bacillus velezensis,16S rDNA序列相似度达99.74%.采用有机溶剂萃取和盐析法对发酵产物进行了提取,初步断定拮抗物质为蛋白类.通过对粗蛋白进一步研究发现,60%组分活性较高,并且对热及酸碱敏感性较小.试验结果为棉花黄萎病的生物防治奠定了基础.     

芽孢杆菌BJ-6的抗菌物质及其抑菌作用

芽孢杆菌(Bacillussp.)BJ-6菌株分离自北京市门头沟区杏树根际土壤,室内抑菌测定发现BJ-6菌株对苹果轮纹病(Physalospora piricola)、苹果斑点落叶病(Alternaria mali)和苹果树皮腐烂病(Valsa mali)、白菜黑斑病(A.brassicae)、番茄灰霉病(Botrytis cinerea)、茄子黄萎病(Verticillium dahliae)的病原菌均有较强的抑菌作用。对其代谢产生的抗菌物质的稳定性测定表明:抗菌物质在偏酸性和中性条件下能够耐受121℃高温处理20 min;但在偏碱性条件下不具备热稳定性,热处理后失去原来的抑菌活性。采用硫酸铵分级沉淀得到抗菌粗蛋白,其中饱和度在30%~40%之间沉淀的蛋白抗菌活性最强。紫外吸收测定显示只有具有274 nm附近吸收峰的蛋白液有抑菌活性,且抗菌粗蛋白可引起白菜黑斑病菌菌丝畸形。     

抗农作物病原真菌的Streptomyces sp.IIR21菌株分离及其克拉维烷基因簇分析

从神农架烟草种植地土壤中分离出1株对7株农作物病原真菌具有抗性活性菌株,命名为ⅡR21菌株。采用琼脂块法测定,该菌株对稻瘟病菌、立枯丝核病菌、腐霉病菌、禾谷镰刀病菌和黄色镰刀病菌具有较强的抑菌活性。对该菌株的生理生化特性和16SrRNA基因序列同源性比对,初步鉴定ⅡR21菌株属于链霉菌属。经过有机溶剂萃取、硅胶柱层析、薄层层析和制备型高效液相色谱对ⅡR21菌株发酵液进行分离纯化,获得了1个纯度为90.34%的具有抗稻瘟病菌168菌株活性的化合物单体。采用高通量测序技术对ⅡR21菌株进行全基因组测序,通过全基因组序列分析,ⅡR21菌株基因组中包含克拉维烷的合成基因簇,并推测出克拉维烷的合成代谢途径。     

番茄灰霉病菌拮抗细菌B21的鉴定

对分离于叶片表面能较强抑制番茄灰霉病菌生长的拮抗细菌B21菌株进行了鉴定。通过形态特征、生理生化特征观察,利用PCR技术对菌株B2116SrDNA序列作全序列分析,序列结果在GeneBank中进行Blast同源序列检索,再用DNAStar软件与Bacillus属的其它种进行同源性分析,结果显示B21与已报道的B.subtilis16SrDNA序列(登陆号AY172513)有99.93%的相似性,且两者在系统发育树中处于同一个分支。确定B21为枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的一个菌株。