一种简单快速测定对虾白斑综合症病毒浓度方法的建立

测定出对虾白斑综合症病毒（WSSV）中基因组DNA在WSSV总质量的比例,再根据WSSV的基因组大小计算出其质量,计算出完整的WSSV病毒颗粒的质量为3.079×10^-15 g。同时测定了各个不同组分在WSSV干重中所占的比例：核衣壳包括基因组DNA和蛋白质,其比例分别为10.17%和43.07%,囊膜包括膜蛋白和各种脂类物质,比例分别为24.76%和22%;测定出WSSV悬液中WSSV浓度与其OD₆₀₀的换算关系为C=OD₆₀₀×6.79×10⁸个/μL。     

三疣梭子蟹和近亲虾类混养防病试验

<正>在分类学上,蟹虾同属于节肢动物门—软甲纲—真虾总目—十足目,十足目又分为两个亚目,即腹胚亚目和枝鳃亚目,蟹属于腹胚亚目,对虾属于枝鳃亚目。因此,从分类学角度看,蟹虾之间的亲属关系更加亲近,相互传染病害有着生物学基础。三疣梭子蟹是威海地区主要海水养殖品种之一。自1993年中国对虾出现白斑综合征病毒(WSSV)暴发性流行后,威海市的水产科研工作者为寻求适应本地区的养殖新品种,开始进行三疣梭子蟹育苗及养成试验,在取得成功的基础上,将该项技术推广应用到水产养殖生产中,并获得较好成效。期间为增加养殖产量和提高经     

具有荧光标签的猪瘟病毒Erns蛋白在杆状病毒表达系统中的表达

为了获得具有标记的猪瘟病毒Erns蛋白,通过基因工程操作,使猪瘟病毒Erns基因与绿色荧光蛋白基因(GFP)融合,用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在昆虫细胞中高效表达了ErnsGFP融合蛋白,经Western Blot和荧光显微镜观察证实,表达产物分子量正确,且发出易于检测的绿色荧光,具有标记的Erns蛋白的获得...     

携带口蹄疫病毒B细胞表位的兔出血症病毒样颗粒的表达及其免疫原性研究

为了研究RHDV病毒样粒子作为载体提呈外源B细胞表位的能力,以兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白VP60为载体,构建携带FMDV B细胞表位(FMDV VP1 B细胞表位200~213aa)的VP60嵌合蛋白,研究外源基因对VP60蛋白的表达、病毒样颗粒(VLPs)的装配及免疫原性的影响。分别在RHDV衣壳蛋白的C端、N端、306和307位氨基酸之间插入外源B细胞表位(FMDV VP1 B细胞表位200~213aa),得到嵌合VP60基因。利用杆状病毒表达系统表达嵌合蛋白,分别命名为VP60-2F、VP60-306F和VP60-578F。经IFA、SDS-PAGE和Western Blot方法鉴定嵌合蛋白的表达,通过电镜观察嵌合蛋白自聚为病毒样颗粒的能力,通过动物试验研究其免疫原性。结果显示,嵌合VP60蛋白在杆状病毒表达系统中得到高效表达,可自聚形成病毒样颗粒,免疫小鼠后可以产生针对VP60和B细胞表位特异的免疫应答。该研究为嵌合VP60 VLPs的形成及结构功能的研究奠定基础,同时为RHDV-VLPs作为外源B细胞表位展示载体的可行性提供依据。     

猪嵴病毒CH441株VP1基因的克隆与序列分析

为了深入研究嵴病毒(sw Ko V)主要结构蛋白基因VP1,根据Gen Bank中已发表的猪嵴病基因序列设计特异性引物,采用RT-PCR方法扩增猪嵴病毒CH441株VP1基因,并对其进行克隆与测序分析。结果表明,sw Ko V CH441株的VP1基因为762 bp,与Gen Bank已发表的嵴病毒属的15株嵴病毒序列的VP1基因相比较,sw Ko V CH441株的VP1基因与其他各毒株VP1基因的核苷酸同源性为81.5%~90.2%,氨基酸同源性为86.6%~96.9%,进化分析显示,sw Ko V CH441株与GS-1株之间的亲缘关系较近。生物信息学分析显示,VP1蛋白理论等电点(p I)为4.40,理论分子质量为26.978 2 k Da;其序列上共发现18个磷酸化位点,分别为Ser(7)、Thr(6)和Tyr(5),而蛋白的磷酸化与信号转导有关,预测该蛋白为一重要的信号转导分子;无信号肽和跨膜区。为进一步开展sw Ko V CH441株VP1基因在遗传变异等方面的研究奠定了理论基础。     

一个水分胁迫应答蛋白与小麦抗旱性的关系及其基因的定位

分析与小麦抗旱性密切相关的水分胁迫应答蛋白, 定位蛋白基因并挖掘与其连锁的分子标记对小麦抗旱分子辅助选择具有重要意义。在一年两点田间全生育期抗旱性鉴定基础上, 以-0.5 MPa PEG-6000模拟干旱胁迫处理小麦幼苗48 h, 并应用SDS-PAGE方法检测分子量约66.2 kD的水分胁迫应答蛋白, 分析其表达与小麦抗旱性的关系。在128个小麦品种(系)中, 检测出67份表达该蛋白, 另61份未表达该蛋白; 前者的平均抗旱指数为1.00, 而后者为0.80, 有极显著差异(P<0.01), 且各抗旱性等级中表达该蛋白的品种比例随着抗性等级的降低而减小。利用晋麦47×西农2208杂交后代230个F₃株系进行遗传分析, 发现该蛋白表达由1对显性基因控制; 目的基因与位于小麦5AS染色体上的5个SSR标记(Xgwm129、Xgwm304、Xbarc56、Xbarc117和Xbarc197)连锁, 位于邻近标记Xbarc56和Xbarc117之间, 遗传距离分别为2.2 cM和2.9 cM。用这两个紧密连锁标记检测128个小麦品种(系), 有67个品种(系)与晋麦47具有相同的标记位点, 其中86.6%的品种(系)(58/67)在水分胁迫后表达目标蛋白。该约66.2 kD的水分胁迫应答蛋白与小麦的抗旱性密切相关, 与其紧密连锁的分子标记可为小麦抗旱分子辅助选择提供依据。     

非洲马瘟病毒VP7基因的克隆与表达

为获得非洲马瘟病毒VP7蛋白,以用于制备AHS血清学诊断试剂并为AHS新型疫苗的构建奠定基础,笔者采用原核表达系统表达VP7蛋白。在GeneBank中查找非洲马瘟病毒VP7基因序列,人工合成VP7基因,将VP7基因片段克隆插入pBAD/Thio-TOPO表达载体,将重组质粒转入大肠杆菌TOP10。经测序鉴定,筛选获得VP7基因正向插入、有正确读码框的阳性克隆,经L-Arabinose诱导表达VP7融合蛋白抗原。SDS-PAGE分析表明以终浓度为0.2%的L-阿拉伯糖进行诱导,4h后表达可达到高峰,融合蛋白质量约54.72 kDa。Western blotting检测和间接ELISA表明诱导表达的融合蛋白能与非洲马瘟病毒VP7单克隆抗体发生特异性反应,说明蛋白有特异的免疫学活性。     

鞘翅目害虫-华北大黑鳃金龟围食膜结构的初步研究

应用光学显微镜和生化技术,研究了华北大黑鳃金龟(Holotrichia oblita)围食膜的基本结构和表面形态,初步分析了围食膜蛋白质的种类,蛋白质和糖的含量,测定了棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白对围食膜结构的影响.结果表明,华北大黑鳃金龟围食膜表面平滑致密,富有弹性,但与多数昆虫围食膜相比韧性较差,主要由蛋白质、糖和几丁 质组成,其中蛋白质的含量约为36.25%,糖的含量约为8.9l%,其他为几丁质等;经SDS-PAGE测定,围食膜的蛋白质种类较多,有28条多肽比较清晰,分子量多在17.6-320.3 kDa.棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白不能降解华北大黑鳃金龟围食膜中的蛋白质.     

O型口蹄疫病毒各编码基因及其产物变异率的分析

将从Genbank中提出的20株O型FMDV的全基因组分割成12个编码区域,即Lab、VP4、VP2、VP3、VP1、2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D.通过方差分析,12个编码序列的相对变异率之间无差异(P>0.05);而这12种编码序列所对应的氨基酸相对突变率之间差异显著(P<0.01).利用Duncan法对这12种氨基酸序列相对突变率进行多重比较,发现3A蛋白的氨基酸相对突变率比其余11种蛋白的差异都显著(P<0.05);VP2、Lpro的氨基酸相对突变率与VP4、2A、2C、3Cpro、3Dpol之间存在差异(P<0.05);而VP4、2A、2C、3Cpro、3Dpol之间无差异.结果显示,O型FMDV自身RNA的转录和机体对FMDV施加的免疫压力不是造成FMDV变异的主要原因,而各种病毒产物的功能选择压力才是FMDV分子进化的主要原因.     

冬小麦种质矮孟牛及其衍生后代1BL/1RS的分子和生化标记鉴定

本研究以小麦骨干亲本矮孟牛及其33个衍生品种(系)为材料,利用低分子量(LMW)麦谷蛋白Glu-B3位点的STS-PCR标记、醇溶蛋白Gli-B1位点的SSR标记和黑麦碱SEC-1b位点的STS-PCR标记进行复合PCR,检测1BL/IRS易位.结果表明,矮孟牛Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ型含有1BL/1RS染色体,矮孟牛Ⅰ和Ⅲ型不含1BL/1RS;在矮孟牛的33个衍生后代中,25个含1BL/1RS,其余8个则不含1BL/1RS.利用A-PAGE技术对上述材料进行了黑麦碱蛋白的检测,结果与复合PCR一致,两种方法相结合能准确的检测1BL/1RS.     

对虾冷藏过程中细菌菌相变化的研究

为进一步揭示虾类的腐败机理,以养殖南美白对虾和海捕鹰爪虾为研究对象,对其贮藏过程中细菌总数(APC)和细菌菌相的变化进行了研究。结果表明,养殖南美白对虾和海捕鹰爪虾的初始细菌总数分别为4.20 Log10 CFU·g-1和3.60 Log10 CFU·g-1,南美白对虾的初始细菌总数明显高于鹰爪虾(P<0.05);贮藏过程中两种对虾细菌总数的变化情况也有所不同,但都是在第4天达到106 CFU·g-1的货架期上限水平。在南美白对虾初始菌相中,革兰氏阴性菌为优势菌,其所占比例较高的主要有Aeromonas(气单胞菌)、Pseudomonas(假单胞菌)和Enterobacteriaceae(肠杆菌),分别占26%、21%和10%;在鹰爪虾初始菌相中,也是革兰氏阴性菌占优势,其中Pseudomonas、Aeromonas和Shewanella(希瓦氏菌)比例较高,分别占28%、16%和12%。在贮藏过程中,两种对虾细菌菌相的变化情况有所不同,南美白对虾的优势腐败菌为Pseudomonas和Aeromonas,而鹰爪虾的优势腐败菌为Pseudomonas和Shewanella。     

复方中草药对凡纳滨对虾生长及非特异性免疫功能的影响

为了提高凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的生长性能和抵抗细菌性疾病的能力,将黄芪、大黄、甘草和黄芩等比例组成复方,采用连续和间断两种投喂方式评价1%中草药饵料对凡纳滨对虾的生长和非特异性免疫功能的影响。试验共分3个组,分别为D0组（基础饲料对照组）,D1组（1%中草药饲料组）,6D1-6D0组（6天投喂1%中草药饲料-6天投喂基础饲料）。试验期间在不同时间取样测定血淋巴酚氧化酶、溶菌酶、超氧化物歧化酶的活性,并在14、28天分别进行副溶血弧菌感染凡纳滨对虾。结果表明：D1组对虾的增长率和相对增重率均显著高于6D1-6D0组和D0组(P＜0.05);6D1-6D0组对虾的增长率和相对增重率略低于对照组,但无显著差异(P＞0.05)。饲料中添加复方中草药可显著提高对虾免疫相关酶(PO、LSZ、SOD)活性。养殖第14、28天的弧菌感染试验结果显示：D1组的免疫保护率分别为68.3%和91.6%,6D1-6D0组的免疫保护率分别为27.2%和45.8%。说明中草药可改善对虾对弧菌性疾病的抵抗能力,并随投喂时间的增加而增强。     

有机和常规养殖条件下南美白对虾Penaeus vannamei产品质量比较研究

对有机和常规养殖条件下南美白对虾的肌肉营养成分、矿物质元素、重金属和药残含量进行了比较分析。有机养殖条件下南美白对虾的水分、粗灰分和粗蛋白含量和常规养殖条件下无显著差异（P〉0．05）;粗脂肪含量显著低于常规养殖条件下（P〈0．05）;钙、磷元素含量显著高于常规养殖条件下（P〈0．05）;在重金属和药残含量方面,常规养殖条件下南美白对虾除呋喃唑酮超标外,其余均符合无公害食品标准,但有机养殖条件下重金属和药残含量更低。结果表明,从产品卫生安全性角度考虑,有机养殖条件下的南美白对虾对人体更健康无害。     

湖北省不同克氏原螯虾群体携带白斑综合征病毒情况调查

[目的]为了了解湖北省克氏原螯虾的白斑综合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)携带情况。[方法]2016年5月—2017年7月对湖北省几个养殖地区采集的741个克氏原螯虾样品进行了WSSV的PCR检测,并选取了49个PCR阳性扩增产物进行测序分析。[结果]结果显示,湖北省潜江市、监利县等主要养殖区的克氏原螯虾和洪湖市新堤地区克氏原螯虾群体携带WSSV病毒的比率为65%以上;鄂州市、随州市以及洪湖市螺山镇养殖的克氏原螯虾群体携带WSSV病毒的比率为40%左右。测序结果发现,有部分样品中WSSV的保守序列发生碱基A/T的突变。系统发育树分析结果显示,发生碱基A/T突变的WSSV与17个已公布的WSSV地区亚种的亲缘关系都比较远,而未发生A/T碱基突变的WSSV与澳大利亚株(MF161441)、孟加拉株(KJ719075)亲缘关系更近。[结论]研究结果可为克氏原螯虾WSSV的防控提供一定的参考。     

日粮水平对凡纳滨对虾生长、消化酶和免疫酶活力以及氮收支的影响

为探讨不同日粮水平对对虾的影响。本实验研究了日粮水平对凡纳滨对虾生长、酶活力及和氮收支的影响。结果表明：日粮水平对凡纳滨对虾存活率、增重率、饲料系数、生长率、氮收支、部分消化酶和免疫酶活性有显著的影响;日粮水平7%增重率和特定生长率较高,日粮水平9%存活率最低,日粮水平2%饲料系数最低;日粮水平与特定生长率间呈二次曲线相关,日粮水平为7.92%时,获得最大特定生长率。摄食氮、生长氮和排泄氮和排粪氮,以日粮水平2%最低、7%最高,且2%日粮水平氮生长效率最高;低日粮水平组获得较低的消化酶和免疫酶活性。在对虾养殖生产实践中,日粮水平设定为7%~8%为宜。     

微生物在感染WSSV的克氏原鳌虾死亡过程中的作用研究

为了评估微生物在感染了WSSV的克氏原鳌虾（Procambarus clarkii）死亡过程中的作用,对染毒鳌虾注射抗生素,并对鳌虾血淋巴中的细菌进行了数量比较以及种属鉴定。结果表明抗生素可以显著降低染毒鳌虾的死亡率但对WSSV的增殖没有显著影响。染毒鳌虾的血淋巴中微生物数量有明显增加。微生物主要是嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、弗劳地柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）、嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）和琼氏不动杆菌（Acinetobacter junii）等条件致病菌。研究结果表明鳌虾在感染了WSSV后血细胞的消失导致体内病原微生物的数量大幅增加,从而加速了鳌虾的死亡速度。     

O型口蹄疫病毒VP1蛋白的原核表达及功能鉴定

为获得具有免疫原性的FMDV VP1蛋白,以O型FMDV重组质粒PMD18T-VP1为模板,利用PCR技术扩增得到O型FMDV VP1基因片段,将此基因片段与原核表达载体pET32a连接,构建重组表达载体,命名为pET-VP1,经PCR和测序鉴定后,用IPTG诱导表达,收集诱导的菌液进行SDS-PAGE电泳和Western-Blot分析.结果显示,在分子量约为45 ku处有1条明显的蛋白条带,且能被口蹄疫阳性血清识别,表达产物通过包涵体纯化后用透析法复性;ELISA检测结果显示,所复性的蛋白具有较高的活性.结果表明,FMDV VP1蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,为开发诊断制剂和疫苗的研制打下基础.     

农杆菌介导轮状病毒抗原蛋白VP4基因遗传转化花生的研究

选用鲁花14与花育23花生品种, 通过农杆菌介导开展了轮状病毒抗原蛋白VP4基因遗传转化研究, 从转化植株中随机选取26株表现Kan抗性植株进行npt II基因的PCR检测, 结果有22株能扩增出620 bp左右的npt II基因条带, 阳性率约为84.62%。提取npt II基因显示为阳性的植株叶片DNA作模板, 用VP4基因特异引物进行PCR扩增, 经琼脂糖凝胶电泳分析, 所有npt II基因阳性的植株均扩增出了约2 350 bp的特异性条带, 而野生型没有。对部分转基因植株进一步进行PCR-Southern杂交和Southern杂交分析, 发现转基因植株中出现了阳性杂交信号, 表明VP4基因的确已经整合到花生的基因组中, 并且是1~2个拷贝。用RT-PCR分析了11株转G1VP4基因的植株, 证明插入鲁花14中的VP4基因已经正常转录, 利用Western blot方法检测筛选到的4株转基因花生, 分别提取其蛋白, 在30 kD处出现特异性蛋白条带, 这为获得转基因创新种质材料奠定了基础。