香蕉EST-SNP标记的开发

为发掘出一批香蕉的SNP位点、进一步研究香蕉的遗传关系、相关性状的定位等打下基础,从美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)的dbEST数据库下载46 665条香蕉EST序列,经生物信息学方法分析发掘EST-SNP位点,并对其所在核酸序列进行功能注释分析。通过对46 665条EST进行拼接,共得到3 490条重叠群(contigs),在含有4条以上重叠群中发现有39条重叠群中含有SNP位点,从中筛选出127个候选SNP位点,其碱基突变类型中转换、颠换分别占SNP位点总数的63.78%、36.22%。通过序列比对分析发现了34个与香蕉相关基因,证明NCBI中的香蕉EST数据库数据量大,能够发掘出SNP标记对香蕉进行品种鉴定、分类和遗传多样性分析。     

梅、杏、桃EST同源序列特征分析及EST-SNP发掘

通过生物信息学手段,下载GenBank数据库中已公布的梅、杏、桃3个物种EST序列各4 660、15 388、82 583条,利用CAP 3软件拼接后序列分别为4 456、5 595和24 243条。经比对发现,同源序列592条,同源序列的总长度为235 576 bp,平均长度和同源性分别为437.67 bp和97.50%;进行Blast比对后发现,所有同源序列中有340个具有相应的功能注释,183个为未知功能蛋白,其余69个为没有相应序列信息的新基因;在所有同源序列中共发现8 818个SNP,总频率为每SNP26.71 bp,并以转换和颠换为主。同时,对3个物种的同源序列进行两两比较发现,SNP数量明显少于这三者比较的结果。利用所有SNP对梅、杏、桃3个特种进行聚类分析,结果表明,梅、杏的亲缘关系较近,而两者与桃亲缘关系较远。     

表达序列标签(EST)分析及藻类EST文库的研究进展

随着生物信息学的发展,表达序列标签（EST）在基因组作图、克隆基因、新基因的识别、蛋白质组研究等方面具有重要作用。笔者简要介绍了EST技术的原理及其在构建遗传图谱、分离与鉴定新基因等方面的应用。综述了藻类EST文库的研究现状,并对EST的应用前景进行了展望。     

利用GenBank中大量葡萄EST序列分离有效基因的电子表达分析平台

 【目的】充分利用GenBank上的大量葡萄EST序列,建立本地化基因电子表达分析平台,实现基因表达模式的大规模快速分析。【方法】利用生物信息学方法对GenBank上的362 193条葡萄EST序列进行本地化及后续处理,建立电子分析平台,并通过RT-PCR技术对其电子分析准确性进行验证。【结果】建立了包含叶、花等11个组织类别和GA3等5个胁迫类型的基因电子表达分析平台。通过VvAG、VvCHS、VvF3H、VvLDOX等4个葡萄基因的RT-PCR和电子表达分析结果比较发现,平台预测效率较高,在预测EST来源数较多的果实、花序、花组织的表达效果较好,而对叶等EST来源较少的组织的预测效果需结合试验判断。随着dbEST库中源于葡萄各组织EST序列数量的大量增加,平台的预测效果将更加符合基因表达的实际情况。【结论】葡萄基因电子表达分析平台预测效率较高,为葡萄基因大规模快速表达分析以及重要相关信息的挖掘提供了很好的分析工具。     

日本沼虾EST-SNP的筛选及多态性检测

利用EST数据库开发SNP是筛选SNP标记的重要途径。本研究利用日本沼虾现有EST数据开发SNP标记—从NCBI获得8 458条EST序列;Seqclean软件去除序列中的载体、引物和接头等污染序列,得到8 453条EST序列;利用Quality SNP软件对预处理后序列中含有4条以上同源序列重叠群进行分析,在含有4条以上同源序列的1 055个重叠群中,筛选得到可靠SNP(Reliable SNPs)位点705个,较可信SNPs(High confidence SNPs)905个,潜在SNPs(Potential SNPs)1 144个。根据候选SNP位点设计28对引物,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,基因分型验证44个太湖个体,13对引物具有二等位基因多态性,观测杂合度和期望杂合度范围分别为0.259~0.745和0.255~0.728。结果表明,EST数据库中存在大量SNP位点,筛选的SNP标记可用于日本沼虾遗传学分析。     

草莓EST中SSR位点分析

[目的]从现有的草莓EST数据中获取有效的微卫星标记。[方法]利用MISA（Microsate llite）软件分析简单重复序列（Simple se-quence repeat,SSR）在草莓EST中的分布频率与密度,用CAP3软件进行冗余分析。[结果]在17565条EST序列中,共获得10129条SSR序列,SSR之间的距离约为0.90kb。其中,六碱基重复丰度最大,占61.0%,而三碱基、单碱基、二碱基、四碱基和五碱基重复丰度分别为14.3%、13.1%、6.2%、4.3%和1.1%。在单碱基、二碱基、三碱基和四碱基重复模体中,丰度最大的分别是A/T、AG、AAG和AAAG,而CG在编码区内没有。在这6种类型的重复模体中,冗余与非冗余的草莓EST之间没有显著差异。[结论]从现有的草莓EST数据中可以方便地获取有效的微卫星标记。     

大通牦牛TLR2基因SNP位点筛选及生物信息学分析

采用DNA混合池扩增后直接测序的方法,对大通牦牛TLR2基因CDS区的SNP位点进行筛选,估算各SNP位点等位基因频率,并通过生物信息学软件预测突变对TLR2 mRNA和蛋白质结构的影响。结果表明,大通牦牛TLR2基因CDS区存在2个SNP位点,分别为G⁶⁷⁷A和G¹⁵⁸⁷A,其中G⁶⁷⁷A为错义突变,导致半胱氨酸(Cys)转变为酪氨酸(Tyr)。生物信息学分析结果表明,G⁶⁷⁷A和G¹⁵⁸⁷A位点均降低了mRNA二级结构的稳定性,且蛋白二、三级结构组成也发生了改变。     

基于EST和GSS序列的木豆miRNA生物信息学分析

应用miRtour在线分析工具对木豆EST和GSS序列进行miRNA生物信息学预测,应用psRNATarget进行靶基因预测。结果发现,43条不同的木豆miRNA成熟序列,隶属于33个不同的miRNA家族。靶基因预测发现有36条编码序列受miRNA调控,其中17条序列编码酶,2条编码转录因子,7条编码参与细胞信号转导的蛋白,5条编码参与蛋白质降解通路的蛋白。     

葡萄EST-SNP位点的信息与特征

为了从不同基因型葡萄组织的表达序列标签(EST)中得到候选单核苷酸多态性(SNP)位点,从NCBI的dbEST数据库中下载来源于9个不同葡萄基因型的不同组织EST序列42 493条,利用CAP3软件拼接得到6 126个重叠群(contig),将拼接结果导入QualitySNP进行SNP筛选;同时,为提高候选SNP位点的可靠度,降低小规格contig开发SNP的假阳性率和大规格contig开发SNP的假阴性率,设置候选SNP位点的次要等位基因频率至少为30%,SNP侧翼序列保守度至少为5bp。结果表明:仅在1 195个contig中存在候选SNP位点,共5 032个,其中包括1 800个颠换类型,2 896个转换类型,336个单碱基的插入与缺失(indel),SNP的平均出现频率为4.2SNP.contig-1。利用CAPS(酶切扩增多态序列)分子标记和重测序方法对其中几个候选SNP位点进行验证表明,符合人工筛选原则且来自于小规格contig的候选SNP位点检测结果较好,可靠度最高。     

草莓EST中SSR位点分析（摘要）

[目的]从现有的草莓ESTs数据中获取有效的微卫星标记。[方法]利用MISA（Microsatellite）软件分析简单重复序列（simple sequence repeats,SSRs）在草莓EST中的分布频率与密度,用CAP3软件进行冗余分析。[结果]在17565条EST序列中,共获得10129条SSR序列,SSRs之间的距离约为0.90kb。其中,六碱基重复丰度最大,占61.0%,而三碱基、单碱基、二碱基、四碱基和五碱基重复丰度分别为14.3%,13.1%,6.2%,4.3%和1.1%。在单碱基、二碱基、三碱基和四碱基重复模体中,丰度最大的分别是A/T,AG,AAG和AAAG,而CG在编码区内没有。在这6种类型的重复模体中,冗余与非冗余的草莓EST之间没有显著差异。[结论]从现有的草莓ESTs数据中可以方便地获取有效的微卫星标记。     

切花玫瑰缺素症状研究

以切花玫瑰红箭为试材,在分别缺乏一种大量元素的情况下,观察分析植株和叶片表现出来的典型症状。     

玫瑰叶片离体培养胚状体的发生

[目的]为玫瑰转基因提供基础物质。[方法]以玫瑰试管苗叶片为外植体,以MS为基本培养基,研究了不同浓度6-苄基腺嘌呤（6-BA）,腺嘌呤硫酸盐（Ad）,萘乙酸（NAA）及其组合对胚状体发生的影响,同时也进行了不同蔗糖浓度对胚状体形成的研究。[结果]6-BA对胚状体的诱导效果较Ad好,NAA与二者配合使用可提高胚状体的发生率,其最佳浓度组合为6-BA0．4mg／L＋Ad0．2mg／L＋N从0．2mg／L。蔗糖20-30g/L有利于胚状体的形成。其组织学观察表明,胚状体起源于叶片气孔附近的上表皮细胞或上表皮下方的叶肉组织细胞,为单细胞起源。[结论]玫瑰叶片诱导胚状体的最佳培养基为：1／2MS＋6-BA0．4mg／L＋Ad0．2mg／L＋NAA0．2mg／L＋蔗糖20～30∥L。     

玫瑰花柱总RNA提取方法的比较研究

为获得一种玫瑰(Rosa rugosa)花柱总RNA提取的理想方法,为后续相关基因工程研究奠定基础。以玫瑰花柱为材料,用核酸蛋白仪和凝胶电泳法比较了改良CTAB 法、Trizol 法以及EASY spin Plus 植物RNA提取试剂盒法提取的玫瑰花柱总RNA的纯度、浓度及完整性,利用RT-PCR反应检测了其反转录产物用于基因扩增的有效性。结果表明：改良CTAB法提取的总RNA纯度、浓度较高,但存在严重降解现象;Trizol 法提取的总RNA纯度和浓度极低;EASY spin Plus 植物RNA提取试剂盒法提取的总RNA纯度和浓度较高,条带清晰,且28S 条带亮度是18S 条带亮度的2 倍,将其反转录获得的cDNA用于RT-PCR,能够扩增出清晰的特异性条带。综上所述：EASY spin Plus 植物RNA提取试剂盒法从玫瑰花柱中提取的RNA质量最好,完全能够满足后续的玫瑰分子生物学研究要求。     

野玫瑰茎段培养和植株再生

为了探讨野玫瑰培养繁殖的方法,利用野玫瑰的新鲜茎段建立了野玫瑰植株再生体系。结果表明:在含有3%蔗糖的MS固体培养基上添加0.4mg/LNAA、3.0mg/L6-BA及2.0mg/L2,4-D时芽分化效果好,继代培养时可促进茎分化和伸长;试管苗在MS(1/2N)培养基上生根效果要好于MS和1/2MS培养基;在MS(1/2N)培养基中添加1.0mg/LNAA时,生根效果显著,平均根数达5.6条。试管苗以V草炭土∶V粗沙∶V田土=1∶1∶1为基质移栽成活率最高,达85.1%。     

保加利亚精油玫瑰的离体起始培养与快速繁殖

以保加利亚精油玫瑰同一无性系相同部位茎段为试验材料,12～2月接种最好,芽生长迅速,污染率低,以6-BA,NAA,GA3及蔗糖为试验因子,每个因子5个含量水平,以不同培养基及浓度为基础,通过实验选出宜于保加利亚精油玫瑰组织培养的初代培养基,即MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA0.15 mg/L+蔗糖40g/L+琼脂6g/L.     

不同种源野生玫瑰鲜花芳香成分的比较研究

采用顶空固相微萃取(HS-SPME)和气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术分析我国不同产地野生玫瑰鲜花的芳香成分及其相对含量.结果表明:野生玫瑰的芳香成分及其相对含量差异明显.牟平野生玫瑰共检测出64种成分,醇类化合物是主要香气成分;荣成野生玫瑰共检测出48种成分,醇类化合物是主要香气成分;珲春野生玫瑰共检测出56种成分,醇类和酯类化合物是它的主要香气成分;庄河野生玫瑰共检测出56种成分,醇类化合物是主要香气成分.不同的芳香物质组成,使野生玫瑰产生不同的香气类型.     

玫瑰果实生长动态研究

以玫瑰8个栽培品种和3个野生类型为试材,对其果实生长过程的变化进行了研究。结果表明：栽培品种和野生类型横径生长规律不相同,“唐红”、“刺果”、“紫雁”、“一品紫衣”和“紫枝”5个栽培品种在生长过程中有一个相对快速增长阶段,其余3个栽培品种则呈现均匀稳定的增长趋势;3个野生类型均有两个相对快速增长阶段,分别出现在5月下旬至6月初和6月中旬至7月初。玫瑰果实纵径增长趋势大体一致,除“唐白”在5月下旬至6月上旬有一个相对快速增长阶段外,其余栽培品种和野生类型均呈现出均匀稳定的增长趋势,5月下旬至6月中旬是果实纵径增长比较明显的阶段。到7月中下旬,果实纵横径逐渐停止生长,达到最大值。     

玫瑰与月季种间杂交障碍原因分析

【目的】探明玫瑰（Rosa rugosa）与月季（Rosa hybrid）种间杂交障碍原因,为提高观赏玫瑰育种效率提供理论依据。【方法】以牟平野生玫瑰（MP）、‘唐红’玫瑰,以及月季品种‘塞尔维亚’和‘红帽子’为试材,统计分析种间杂交（MPב塞尔维亚’、MPב红帽子’）和品种间杂交（MPב唐红’）的田间坐果率、每果种子数、种子纵径、有胚率、萌发率和成苗率;采用荧光显微法观察花粉管在花柱中的生长状况;利用常规石蜡切片观察受精及胚胎发育状况。【结果】（1）MPב塞尔维亚’种间杂交坐果率和每果种子数均显著低于品种间杂交,MPב红帽子’种间杂交则未结籽。（2）MPב塞尔维亚’种间杂交种子大小不一,76.67%的小种子纵径仅（0.24±0.07）cm,无胚、胚乳,不萌发;23.33%的大种子纵径达（0.61±0.05）cm,有胚、胚乳,萌发率和成苗率显著低于品种间杂交。（3）授粉后2 h,种间杂交花粉和品种间杂交花粉均已在柱头上大量萌发,但种间杂交花粉管顶端却大量沉积胼胝质;授粉后20-24 h,品种间杂交花粉管进入子房,但全部MPב红帽子’花粉管和多数MPב塞尔维亚’花粉管却于花柱1/2处停止生长;品种间杂交花柱通道细胞及间隙中无明显胼胝质沉积,但种间杂交花柱通道细胞及间隙中却大量沉积胼胝质。（4）少量MPב塞尔维亚’花粉管能够进入子房,并完成受精。但79.42%的杂种胚在授粉15 d左右的心形胚阶段败育,20.58%的杂种胚仍能继续发育。【结论】（1）MPב红帽子’为受精前障碍,MPב塞尔维亚’为受精前后双重障碍;（2）受精前障碍主要由花粉管在花柱1/2处停止生长而导致,可能与花粉管顶端和花柱通道细胞及间隙中大量沉积的胼胝质有关;（3）受精后障碍主要由杂种胚在心形胚阶段败育而造成。     

22份国产玫瑰资源的自交亲和性

 【目的】探明玫瑰(Rosa rugosa Thunb.)自交亲和性状况,为玫瑰及以玫瑰为母本的月季、蔷薇等重要蔷薇属观赏植物的杂交育种技术提供理论依据。【方法】采用统计分析田间坐果率及平均种子数与荧光显微观察花粉管生长状况相结合的方法。【结果】(1)所有试验材料开花当天及开花前4 d的自交坐果率均为零,且花粉管只能伸长到花柱上部1/3处;(2)蕾期授粉能够一定程度地提高玫瑰的自交亲和性,其中开花前2 d授粉效果最好;(3)蕾期自交坐果率及平均种子数与其自由授粉坐果率及平均种子数显著正相关。【结论】(1)玫瑰普遍具有配子体型完全自交不亲和性;(2)蕾期授粉可提高玫瑰自交亲和性,但效果因授粉时期不同和品种不同有较大差异。